馬駑巴貝斯蟲Bc48蛋白的純化及其應(yīng)用

宋晶晶，王盼舉，許正茂，艾日登才次克，王莉君，吾力江，張夢圓，巴音查汗

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，烏魯木齊830011）

馬駑巴貝斯蟲病是馬駑巴貝斯蟲（Babesia caballi）經(jīng)媒介蜱傳播寄生于馬屬動物（馬、驢、斑馬等）紅細胞內(nèi)引起的一種血液原蟲病。傳播媒介為森林革蜱、草原革蜱和銀盾革蜱等硬蜱[1]，呈急性、亞急性、慢性發(fā)病，臨床癥狀分心肺型和腸胃型，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血、黃疸、水腫、肝腫大、血管內(nèi)溶血，血紅蛋白尿甚至是死亡等癥狀。馬駑巴貝斯蟲病是能影響全世界馬產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟的重要疾病之一，分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)及溫帶地區(qū)[2-3]。馬駑巴貝斯蟲感染動物死亡率高，生產(chǎn)力低，管制措施成本高，并且可影響國際馬匹貿(mào)易和流動，從而造成極大的經(jīng)濟損失。我國將其列為馬二類疫病，OIE（世界動物衛(wèi)生組織）將其列為B類疫病[4-6]。

馬駑巴貝斯蟲病臨床診斷通常采用血涂片染色方法來觀察紅細胞的染蟲情況。由于馬駑巴貝斯蟲在馬屬動物感染潛伏期長且呈慢性感染（帶蟲期），血涂片染色方法應(yīng)用于臨床大批量檢測需耗費較大的財力、人力。雖然補體結(jié)合實驗、間接免疫熒光抗體實驗和酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）均可有效檢測陽性樣品，但是補體結(jié)合實驗和間接免疫熒光抗體實驗假陽性率高、敏感性低[6]。在對于急性或慢性及大批量檢測努巴貝斯蟲感染情況時，rELISA是目前最合適的檢測方法，該方法具有成本低、特異性強、靈敏度高、制備簡單等優(yōu)點[7-8]。本研究以純化重組Bc48蛋白作為包被抗原的ELISA對新疆地區(qū)馬努巴貝斯蟲病進行檢測，加大新疆地區(qū)該病的流行病學(xué)調(diào)查研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)血清、菌種和質(zhì)粒E.coli表達菌BL21感受態(tài)細胞、構(gòu)建成功的馬駑巴貝斯蟲Bc48基因原核表達質(zhì)粒pGEX4T-1-Bc48、馬駑巴貝斯蟲病陽性血清、陰性血清均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲實驗室保存、提供。

1.1.2 血清樣本來源 采自新疆南疆巴音郭楞蒙古自治州和碩縣（40份），阿克蘇地區(qū)（11份），北疆阿勒泰地區(qū)富蘊縣（29份），伊犁地區(qū)昭蘇縣洪納海鄉(xiāng)（21份），昭蘇縣種馬場（111份）伊犁卡拉蘇（24份）共256份馬匹血樣，常規(guī)方法分離血清，-20℃保存、備用。

1.1.3 主要試劑 IPTG、氨芐霉素（Amp+）、吐溫（Tween） 均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；TMB顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白Marker 購自北京全式金生物有限公司；ELISA酶標(biāo)板購自NUNC公司；鼠抗馬IgG-HRP購自BETHYL公司；氯化鈉、酵母浸粉、胰蛋白胨、氫氧化鈉、氯化鉀等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 Bc48重組進行蛋白的制備 將原核表達質(zhì)粒pGEX4T-1-Bc48轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)，將鑒定為陽性的菌落進行擴大培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達后，采用KCl染色切膠純化Bc48蛋白[8]，純化后用BCA法進行蛋白濃度的測定。

1.2.2 ELISA檢測 用PBS將切膠純化后的目的蛋白稀釋為最適工作濃度0.8 μg/mL，采用碳酸鹽包被酶標(biāo)板，按照每孔100 μL加至反應(yīng)板中，4℃過夜。 每孔加入200 μL PBST（0.5%吐溫）清洗5次，甩掉液體拍干后，每孔加入3%的脫脂乳（200 μL），37℃下封閉2 h。

將封閉好的反應(yīng)板洗滌5次，拍干。待檢血清用封閉液50倍稀釋后加至反應(yīng)板，每個樣品重復(fù)3個反應(yīng)孔，每孔100 μL，37℃孵育1 h，同時加入陰性、陽性標(biāo)準(zhǔn)血清作為對照。將反應(yīng)板洗滌5次甩凈液體后拍干，加入10 000倍稀釋后的二抗，每孔100 μL，37℃孵育1h。洗滌反應(yīng)板后，每孔加入100 μL TMB顯色液，37℃作用15 min后，每孔加入100 μL 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀450 nm處進行讀數(shù)。血清樣本OD450≤0.221時，判定為陰性；OD450值＞0.221時，判定為陽性[9]。

2 結(jié)果

2.1 Bc48重組蛋白誘導(dǎo)及純化結(jié)果電泳結(jié)果顯示，37℃、終濃度為0.4 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h可成功表達出分子量約36 kDa目的蛋白，且Bc48重組蛋白以包涵體的形式存在（圖1）。利用0.25 mol/L的KCl染色切膠純化方法獲得大量高純度的目的蛋白（圖2）。SDS-PAGE結(jié)果顯示純化效果較好，經(jīng)BCA法測定濃度為360 μg/mL。

圖1 Bc48重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of Bc48 recombinant proteins

圖2 Bc48重組蛋白的純化結(jié)果Fig.2 Purification result of Bc48 recombinant protein

2.2 南北疆疫區(qū)馬駑巴貝斯蟲病 rELISA樣品檢測結(jié)果采用rELISA法對新疆南北地區(qū)256份血清進行馬駑巴貝斯蟲抗體檢測，結(jié)果顯示，南疆和碩、阿克蘇地區(qū)馬駑巴貝斯蟲陽性率分別為30%（12/40）、9%（1/11）；北疆伊犁種馬場、洪納海鄉(xiāng)、卡拉蘇和阿勒泰富蘊、阿尕什敖包鄉(xiāng)地區(qū)陽性感染率分別為17%（19/111）、17%（4/21）、12.5%（3/24）、5%（1/20）、35%（10/29），阿勒泰富蘊縣感染率最高。

3 討論

馬駑巴貝斯蟲病現(xiàn)為OIE指定檢測馬屬動物寄生蟲病之一，患病馬匹往往通過媒介蜱傳播且呈常年攜帶狀態(tài)[5-6]。新疆駑巴貝斯蟲病發(fā)病率及死亡率較高[10]，因此相關(guān)檢測技術(shù)的研究顯得尤為重要。馬駑巴貝斯蟲呈常年攜帶狀態(tài)，并且對于臨床癥狀不明顯的馬匹，臨床診斷或血液涂片檢查都難以確診，“帶蟲馬”的漏診可造成傳染源被忽略。

馬駑巴貝斯蟲二溫式、熒光PCR檢測方法已被報道[11]，雖然具有更高的特異性及靈敏度，但對于基層大量樣品的檢測及硬件條件設(shè)備等需求較高。本研究通過原核表達系統(tǒng)及KCl染色純化的Bc48重組蛋白作為rELISA基礎(chǔ)包被抗原，具有較強的特異性，陽性符合率達到95%，這與前期多次臨床經(jīng)驗應(yīng)用密切相關(guān)[12-14]，可以更好的實時監(jiān)測馬駑巴貝斯蟲病的感染情況。根據(jù)相關(guān)文獻報道[12-14]，在伊犁、阿勒泰、塔城及巴州等地區(qū)，馬駑巴貝斯蟲病感染率較高，但此次調(diào)查結(jié)果顯示北疆伊犁，阿勒泰地區(qū)的感染率有所降低，可能是近兩年科技宣傳和驅(qū)蟲方法比較到位。

表1 新疆部分馬駑巴貝斯蟲病血清學(xué)調(diào)查結(jié)果Table 1 Serological investigation of Babesia caballi infection in Xinjiang

也有報道指出，馬駑巴貝斯蟲作為蜱傳播的病原體也是馬駑巴貝斯蟲病的致病因子，能夠不同程度的感染馬屬動物，造成直接或間接經(jīng)濟損失[15-16]。因此，疫區(qū)實時監(jiān)測馬駑巴貝斯抗體情況顯得尤為重要，可為研究人員評估相關(guān)的危險因素及驅(qū)蟲藥/疫苗的使用提供依據(jù)。地方人員也應(yīng)在媒介硬蜱活動季節(jié)采取一定的預(yù)防和控制措施，制定和改進防控措施，降低馬匹疫病帶來的經(jīng)濟影響。