Ⅰ群禽腺病毒套式PCR檢測方法的建立與應用

朱小甫，吳旭錦，高 睿，尚紅梅

（1.咸陽職業(yè)技術學院畜牧獸醫(yī)研究所 動物疫病分子生物學診斷實驗室，咸陽 712000；2.楊凌職業(yè)技術學院，楊凌 712100；3.咸陽市動物疫病預防控制中心，咸陽 712000）

2015年6月以來，我國多個省雞場中出現(xiàn)了一種新發(fā)疾病，以心包積液和肝臟腫大為主要病征，暫被命名為“心包積液-肝炎綜合征”，目前研究認為其病原為Ⅰ群禽腺病毒（Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV）[1]。FAdV病毒粒子直徑為70～90 nm，無囊膜，呈正二十面體對稱結構，核酸為雙股DNA。Ⅰ群FAdV分為A、B、C、D、E共5個種，根據(jù)交叉中和試驗可再進一步分為不同的血清型[2]。心包積液-肝炎綜合征可水平傳播，亦能垂直傳播，種雞群感染會導致商品雞群質量低劣，死淘率增加，造成較大經濟損失[3]。2016年，咸陽職業(yè)技術學院畜牧獸醫(yī)研究所調查發(fā)現(xiàn)，陜西省部分雞場存在疑似心包積液-肝炎綜合征病例，為了給臨床提供快速、靈敏的診斷技術手段，咸陽職業(yè)技術學院動物疫病分子生物學診斷實驗室建立了Ⅰ群FAdV套式PCR（nested PCR，nPCR）檢測方法，經過實驗室初步驗證，該方法具有良好的靈敏性和特異性。

1 材料和方法

1.1 病毒FAdV HM15株為分離自陜西省商洛市某蛋雞場野毒株，基因測序確定為血清4型腺病毒（FAdV-4），由動物疫病分子生物學診斷實驗室保存；新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、傳染性法氏囊炎病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）、傳染性喉氣管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）、馬立克氏病病毒（Marek's disease virus，MDV）、雞痘病毒（Fowlpox virus，F(xiàn)PV）均為瑞普生物商品疫苗毒株。

1.2 病料分別來自咸陽、銅川、寶雞、渭南、和西安市雞場，由動物疫病分子生物學診斷實驗室采集或由雞場送檢疑似心包積液-肝炎綜合征病例的肝臟，共計35份。分別進行研磨處理，13 000×g離心10 min，收集上清液，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑DNAiso Reagent、RNAiso plus、rTaq酶、dNTP等分子生物學試劑均為寶生物工程（大連）有限公司產品；其他化學試劑為國產分析純。

1.4 引物設計與合成參考GenBank上發(fā)表的FAdV基因序列（登錄號：NC001720、EU979370、GU188428），針對FAdV六鄰體Hexon基因設計并合成了2對引物，序列分別為FAdV-1F：5'-TCAACCACCACCGTAACTG-3'（19802-19820），F(xiàn)AdV-1R：5'- GGGAGTTGTTTGTGTACAT-3'（2 0 9 5 6-2 0 9 3 8）；F A d V-2 F：5'-CACTTACGAGTGGGTCCTCAGA-3'（19935-19956），F(xiàn)AdV-2R：5'- CCGGTGTCGTTAAC AACG -3'（20684-20667）。由生工生物工程（上海）有限公司合成，超純水稀釋至20 μmol/L，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 FAdV DNA的提取取FAdV HM15株雞胚培養(yǎng)物上清液100 μL置于1.5mL無菌離心管中，加入DNAiso Reagent 800 μL，混勻后靜置10 min，充分裂解病毒；加入-20℃保存的無水乙醇600 μL，混勻后沉淀10 min；4℃、13 000×g離心10 min，輕輕倒去上清，加入-20℃保存的70%乙醇1 mL，輕輕顛倒數(shù)次清洗，棄去上清液，倒置在無菌濾紙上自然干燥；干燥后用40 μL超純水充分吹打溶解，在微量分光光度計上測定DNA的含量。

1.6 FAdV nPCR方法的建立以已測定濃度的DNA溶液為模板，采用不同的擴增體系和條件進行PCR，確定最佳方案。套式PCR反應第1次擴增體系：DNA 2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP1.0 μL，F(xiàn)AdV-1F、FAdV-1R各0.5 μL，梯度增加rTaqDNA聚合酶用量（0.25～1.0 μL），用超純水補至總體積25.0 μL。反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性50 s，退火溫度1℃上升速度由55℃遞增至58℃，時間1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。套式PCR反應第2次擴增時，取2.0 μL第1次擴增產物作為模板，引物更換為FAdV-2F、FAdV-2R，其他成分與第1次擴增相同。條件預設為95℃預變性5 min；94℃變性50 s，退火溫度按1℃上升速度由55℃遞增至58℃，時間1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。反應完成后取5.0 μL PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果，篩選出最佳反應體系和擴增條件。

1.7 FAdV nPCR方法靈敏性檢測10倍梯度稀釋DNA溶液至10-10，用建立的nPCR方法擴增稀釋后DNA模板，PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.8 FAdV nPCR方法特異性檢測按照RNAiso plus操作說明提取NDV與IBDV核酸并反轉錄獲得cDNA；提取ILTV、MDV、FPV的DNA，以cDNA或DNA為模板，采用建立的nPCR方法檢測，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.9 病料中FAdV的檢測用建立的nPCR檢測方法對收集的35份疑似心包積液-肝炎綜合征病料進行檢測。

2 結果與討論

2.1 FAdV nPCR方法的建立本研究針對Ⅰ群FAdV六鄰體Hexon基因設計了2對引物，通過改變反應體系中酶的用量和反應退火溫度，確定了最佳反應體系和擴增條件。套式PCR反應第1次擴增體系：DNA 2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，超純水17.0 μL，dNTP 2.0 μL，F(xiàn)AdV-1F、FAdV-1R各0.5 μL，rTaqDNA聚合酶0.5 μL，總體積25.0 μL。最佳反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性50 s，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。套式PCR第2次擴增反應體系：第1次擴增產物模板2.0 μL，引物為FAdV-2F、FAdV-2R，其余成分同第1次PCR反應。最佳反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性50 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。電泳結果顯示目的條帶清晰（圖1）。

圖1 FAdV nPCR檢測結果Fig.1 The result of nPCR for FAdV

智海東等[4]制備了FAdVⅠ型瓊脂擴散抗原，檢測其效價和特異性后，利用該抗原對人工感染雞沉淀抗體的變化以及血清樣本進行了檢測，為FAdV感染的血清學檢測提供了一種簡便易行的方法。韋悠等[5]采用過濾法及蔗糖梯度密度離心法制備FAdV1型，以全病毒作為ELISA包被抗原，建立了兩種檢測腺病毒抗體的ELISA檢測方法。張明明等[6]采用PCR方法擴增了FAdV基因組右末端末端重復序列片段和開放閱讀框8片段，對雞鴨鵝A型FAdV進行了PCR檢測和分析。袁萬哲等[7]根據(jù)禽腺病毒4型（FAdV-4）Hexon基因核苷酸序列，設計用于擴增FAdV-4的PCR引物，建立了FAdV-4 PCR檢測方法，最低核酸檢出量為12.9 pg。

2.2 FAdV nPCR方法的靈敏度、特異性試驗和病料的檢測微量紫外分光光度計測定HM15株DNA濃度為312 ng/μL，按10倍濃度梯度稀釋至10-10，用建立的方法進行套式PCR。結果顯示，10-1～10-8稀釋度均出現(xiàn)750 bp特異性條帶，套式PCR檢測方法的檢測靈敏度為3.12×10-6ng/μL，說明本方法靈敏度較高（圖2）。

圖2 FAdV nPCR靈敏度試驗結果Fig.2 Sensitivity test of nPCR for FAdV

用所建立的nPCR方法對NDV、IBDV、ILTV、MDV、FPV和HM15株 cDNA/DNA進行擴增，結果發(fā)現(xiàn)，僅HM15株擴增出預期目的條帶（750 bp），其他5種常見禽病毒均為陰性（圖3），表明該方法能特異性地擴增Ⅰ群FAdV目的基因。

收集35份疑似心包積液-肝炎綜合征的組織病料分別提取總DNA，用建立的nPCR方法進行檢測。結果在26份病料中擴增出目的條帶，陽性率為74.3%（圖4）。

心包積液-肝炎綜合征是新近流行的雞群傳染病，3～4周齡肉雞發(fā)病較多，在蛋雞中主要發(fā)生于3～10周齡，甚至有報道顯示300日齡蛋雞也可感染[8]。研究認為，引起心包積液-肝炎綜合征的病原為Ⅰ群禽腺病毒血清4型（FAdV-4）。1987年巴基斯坦安卡拉地區(qū)最早發(fā)現(xiàn)該病，因而又名安卡拉病[9]。進行準確診斷是防控心包積液-肝炎綜合征的前提條件，本研究建立的nPCR方法靈敏度較高，特異性強，為診斷Ⅰ群FAdV感染提供了有力的技術手段。同時，對臨床樣品的檢測結果提示在陜西省雞場中存在Ⅰ群FAdV的感染，應引起足夠重視。

圖3 FAdV nPCR檢測方法特異性試驗結果Fig.3 Specificity test for FAdV by nPCR

圖4 部分組織病料檢測結果Fig.4 Detection result of FAdV from samples by nPCR