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    盤尾絲蟲ASP1蛋白佐劑活性區(qū)不同標(biāo)簽融合表達(dá)與佐劑活性比較

    2019-07-06 06:11:16盧會(huì)鵬張曉凱李洋洋張?chǎng)斡?/span>夏曉莉孫懷昌
    關(guān)鍵詞:佐劑細(xì)胞因子標(biāo)簽

    胡 威,盧會(huì)鵬,張曉凱,李洋洋,張?chǎng)斡睿臅岳?,孫懷昌,2

    (1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,揚(yáng)州 225009;2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,泰州225300)

    重組亞單位疫苗安全性好,但免疫原性較差,需與適當(dāng)免疫佐劑配合使用才能取得良好免疫效果。現(xiàn)有免疫佐劑主要有油佐劑和水佐劑,其中油佐劑誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生較慢,應(yīng)激反應(yīng)較大,但抗體維持時(shí)間較長(zhǎng);水佐劑誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生快,應(yīng)激反應(yīng)較小,但抗體維持時(shí)間較短。這些傳統(tǒng)免疫佐劑一般只能增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答[1],因此迫切需要研制能誘導(dǎo)全面免疫應(yīng)答的新型免疫佐劑。

    盤尾絲蟲(Onchocerca volvulus,Ov)第三期幼蟲活化相關(guān)分泌蛋白(activation-associated secreted protein 1,ASP-1)具有很強(qiáng)的免疫佐劑活性[2-3]。將重組Ov-ASP-1與卵清蛋白、人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)或SARS冠狀病毒重組亞單位疫苗進(jìn)行動(dòng)物免疫試驗(yàn),結(jié)果顯示不僅能促進(jìn)平衡的Th1/Th2抗體應(yīng)答,而且能增強(qiáng)向Th1偏移的細(xì)胞免疫應(yīng)答[4]。將重組Ov-ASP-1與低劑量流感病毒滅活疫苗免疫小鼠,不僅能顯著加強(qiáng)和加速抗體應(yīng)答,還能加強(qiáng)交叉免疫保護(hù)[5]。將Ov-ASP-1的PR-1佐劑活性區(qū)與卵清蛋白、乙型肝炎病毒表面抗原、HIV抗原肽免疫小鼠,不僅能刺激抗原特異抗體產(chǎn)生,而且能刺激脾細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素和IL-6等細(xì)胞因子[6]。然而這些重組大腸桿菌表達(dá)的Ov-ASP-1均為不溶性包涵體,不僅需要進(jìn)行復(fù)雜的變性/復(fù)性處理,而且需使用價(jià)格較貴的親和層析柱進(jìn)行純化,作為獸用免疫佐劑使用時(shí)受到很大限制。

    類彈性蛋白多肽(elastin-like polypeptide,ELP)是根據(jù)體內(nèi)彈性蛋白五肽重復(fù)序列(如VPGXG)合成的多肽聚合物,具有溫度敏感的可逆相變特性,在低于相變溫度下呈可溶狀態(tài),在高于相變溫度下呈凝聚狀態(tài),因此其融合蛋白可通過簡(jiǎn)單的相變循環(huán)純化[7-8]。同時(shí),ELP也具有一定的免疫佐劑作用[9]。ELK16等自聚肽能在細(xì)菌內(nèi)或液體中自動(dòng)聚集成蛋白凝聚物,其融合蛋白可用離心洗滌法純化,純化效率與親和層析法接近[10]。本研究將Ov-ASP-1佐劑活性區(qū)PR-1分別與ELP、ELK16和His標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá),與傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)重組VP2蛋白進(jìn)行動(dòng)物免疫試驗(yàn),旨在探索不同純化標(biāo)簽對(duì)PR-1免疫佐劑活性的影響,同時(shí)為IBDV新型亞單位疫苗佐劑研制提供參考。

    1 材料和方法

    1.1 材料ELK16自聚肽和ELP融合表達(dá)載體pETP16P[10]和pET-ELP[8]由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存;His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司;煙草蝕紋病毒(Tobacco etch virus,TEV)蛋白酶活性包涵體由本實(shí)驗(yàn)室制備[11];RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)GE公司;細(xì)胞因子ELISA試劑盒購(gòu)自武漢酶免生物公司;SPF級(jí)Balb/c小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

    1.2 重組載體構(gòu)建用網(wǎng)上在線軟件JAVA Codon Adaption Tool,將IBDV VP2基因片段[12]優(yōu)化成大腸桿菌偏愛密碼子序列,5'端引入TEV蛋白酶切位點(diǎn),序列由上海生工生物公司合成。用限制酶SalI和XhoI將VP2編碼序列插入pET-ELP載體,重組載體命名為ELP-VP2。將上海生工生物公司合成的ASP-1的PR-1功能區(qū)[6]編碼序列分別插入pET-P16P、pETELP和pET-30a載體的SalI/NotI位點(diǎn),獲得的重組載體命名為pELK-PR1、pELP-PR1和pET-PR1。

    1.3 重組蛋白表達(dá)分別將重組質(zhì)粒pELP-VP2、pELK-PR1、pELP-PR1和pET-PR1轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按1∶100比例接種500 mL卡那霉素(50 μg/mL)2×YT培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6,加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG,37℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。4℃、

    4000 ×g離心10 min,收集菌體,用1/10體積菌體裂解液或PBS重懸,然后用JNBIO高壓細(xì)胞破碎儀破碎3次(1300 pa),4℃、12 000 ×g離心10 min,收集上清。加入終濃度為0.5%聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)混勻,4℃、14 000 ×g離心10 min,離心收集上清用于重組蛋白純化。

    1.4 重組蛋白純化ELP融合蛋白的相變循環(huán)按文獻(xiàn)[8] 進(jìn)行,純化ELP-VP2融合蛋白的相變溫度為26℃,氯化鈉濃度為1.5 mol/L;純化ELP-PR1融合蛋白的相變溫度為26℃,用0.4 mol/L硫酸銨和1 mol/L尿素進(jìn)行。孵育10 min后,室溫、12 000 ×g離心5 min,沉淀用預(yù)冷PBS重懸,冰浴30 min,4℃、12 000 ×g離心10 min去除不溶性雜蛋白,必要時(shí)重復(fù)1次相變循環(huán)。ELK-PR1融合蛋白純化按文獻(xiàn)[10-11] 進(jìn)行,將高壓破碎菌液在4℃、12 000 ×g離心10 min,沉淀蛋白先用洗滌液1(50 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/LNaCl、2 mol/L尿素、1% Triton X-100、1 mmol/LEDTA、3 mmol/LDTT, pH 8.0)離心洗滌2次(4℃、1000 ×g離心10 min),再用洗滌液2(50 mmol/LTris-HCl、50 mmol/L NaCl、0.5% Triton X-100, pH 7.2)離心洗滌3次,最后用1%Triton X-114抽提去除內(nèi)毒素,PBS離心洗滌2次后備用。His-PR1融合蛋白的純化按照康為世紀(jì)His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

    1.5 ELP標(biāo)簽切除ELP-VP2融合蛋白標(biāo)簽切除按文獻(xiàn)[11] 進(jìn)行,沉淀的融合蛋白先用預(yù)冷TEV蛋白酶反應(yīng)液4℃復(fù)溶,按1∶30 μg比例與TEV蛋白酶活性包涵體混合,30℃孵育6 h;4℃、12 000 ×g離心10 min,去除蛋白酶活性包涵體,上清液加入2 mol/L氯化鈉在26℃條件下再次相變循環(huán),離心去除ELP蛋白沉淀,上清液用PBS透析1次。

    1.6 小鼠免疫將20只6周齡Balb/c小鼠隨機(jī)分為5組,每組4只,分別為VP2、VP2+IFA(不完全弗氏佐劑)、VP2+ ELP-PR1、VP2+ELK-PR1和VP2+His-PR1免疫組,免疫途徑為腿部肌肉注射,抗原用量為20μg/只,所用3種PR-1融合蛋白摩爾濃度相同,His-PR1用量為10μg/只,ELP-PR1用量為26.6 μg/只,ELK-PR1用量為12.4μg/只,首免后2周加強(qiáng)免疫1次。首免后每周眶下靜脈叢采血分離血清,-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.7 免疫小鼠抗體檢測(cè)免疫小鼠血清的VP2特異IgG、IgG1和IgG2c用間接ELISA檢測(cè),包被抗原為純化VP2重組蛋白(5 μg/mL),4℃包被過夜,PBST(含0.1%Tween-20的PBS,pH7.4)洗板3次;封閉液為含5%脫脂乳粉的PBST,37℃封閉1 h;PBST洗板3次,各孔依次加入連續(xù)倍比稀釋(從1∶100開始)的免疫小鼠血清,37℃作用1 h;PBST洗板3次,加入酶標(biāo)羊抗鼠IgG、IgG1或IgG2c,37℃作用1 h;PBST洗板3次,每孔加入100 μL顯色液,室溫避光顯色20 min,加入50 μL終止液終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零,用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定每孔OD450值,將P/N ≥ 2.1判為陽(yáng)性,P/N < 1.5判為陰性。

    1.8 免疫小鼠細(xì)胞因子檢測(cè)初免后28 d采血分離血清,按照細(xì)胞因子檢測(cè)ELISA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定免疫小鼠血清的IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-10濃度,每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù),計(jì)算平均值(x)及標(biāo)準(zhǔn)誤(s)。

    2 結(jié)果

    2.1 重組VP2蛋白表達(dá)與純化將ELP-VP2重組載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,用0.2 mmol/L IPTG在37℃條件下誘導(dǎo)6 h。SDS-PAGE分析顯示表達(dá)的ELP-VP2融合蛋白為66.6 kDa,與預(yù)期相符,經(jīng)過2次相變循環(huán)純化的融合蛋白純度為95%;用TEV蛋白酶活性包涵體切除ELP標(biāo)簽,再次相變循環(huán)回收的重組VP2蛋白為預(yù)期的13 kDa,純度為95%(圖1)。

    2.2 PR-1融合蛋白的表達(dá)與純化分別將His-PR1、ELK-PR1和ELP-PR1融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,用0.2 mmol/L IPTG在37℃誘導(dǎo)6 h,SDS-PAGE分析顯示表達(dá)的His-PR1、ELK-PR1、ELP-PR1融合蛋白分別為預(yù)期的23、28、60 kDa(圖2)。其中,His-PR1融合蛋白為不溶性包涵體表達(dá),在變性條件下用鎳親和柱純化;ELK-PR1融合蛋白為活性包涵體表達(dá),用離心洗滌法純化;ELP-PR1融合蛋白為可溶性表達(dá),用相變循環(huán)純化(表1)。

    圖1 ELP-VP2融合蛋白表達(dá)、純化與標(biāo)簽切除Fig.1 Expression, purification and tag cleavage of ELPVP2 fusion protein

    表1 三種PR-1融合蛋白的純化指標(biāo)Table 1 Purification performance of three PR-1 fusion proteins

    2.3 免疫小鼠抗體水平檢測(cè)在初次免疫后第1周和第4周,對(duì)5個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠采血分離血清,以重組VP2蛋白為檢測(cè)抗原,用間接ELISA檢測(cè)抗原特異性IgG、IgG1和IgG2c。在初免后d7,His-PR1佐劑組總IgG水平與VP2免疫對(duì)照組差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),IFA、ELK-PR1和ELP+PR1佐劑組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),其中ELP+PR1佐劑組總IgG水平最高;His-PR1和IFA佐劑組的IgG1水平與VP2免疫對(duì)照組差異不具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,ELP-PR1佐劑組差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,ELK-PR1佐劑組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;4個(gè)佐劑組的IgG2c水平與VP2免疫對(duì)照組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中ELP-PR1佐劑組的IgG2c水平最高(圖3)。在初免后28 d,4個(gè)佐劑組的總IgG水平與VP2免疫對(duì)照組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中ELP-PR1佐劑組總IgG水平最高;His-PR1佐劑組的IgG1水平與VP2免疫對(duì)照組差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其他3個(gè)佐劑組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;4個(gè)佐劑組的IgG2c水平與VP2免疫對(duì)照組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中ELP-PR1佐劑組IgG2c水平最高(圖4)。

    圖2 三個(gè)PR-1融合蛋白的表達(dá)及純化Fig.2 Expression and purification of thee PR-1 fusion proteins

    2.4 小鼠血清細(xì)胞因子檢測(cè)在初免后28 d采血分離血清,用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子濃度。與VP2免疫組對(duì)照相比,ELP-PR1佐劑組的IFN-γ水平差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其他3個(gè)佐劑組差異不具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5A);與VP2免疫對(duì)照組相比,ELK-PR1佐劑組的IL-6水平差異具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,ELP-PR1佐劑組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,ELK-PR1和His-PR1佐劑組差異不具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5B);與VP2免疫對(duì)照組相比,ELP-PR1免疫組的IL-10水平差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其他3個(gè)佐劑組差異具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5C);與VP2免疫對(duì)照組相比,IFA佐劑組的TNF-α水平差異不具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其他3個(gè)佐劑組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5D)。

    圖3 免疫小鼠的VP2特異抗體檢測(cè)(初免后d7)Fig. 3 Detection of VP2-specific antibody response in mice on day 7 after immunization

    圖4 免疫小鼠的VP2特異抗體檢測(cè)(初免后d28)Fig. 4 Detection of VP2-specific antibody response in mice on day 28 after immunization

    3 討論

    重組蛋白和合成肽等亞單位疫苗安全性較好,但免疫原性較差,需與適當(dāng)佐劑配合使用。鋁鹽和油乳劑等傳統(tǒng)免疫佐劑可以加強(qiáng)疫苗抗原的體液免疫應(yīng)答,但不能形成有效的細(xì)胞免疫。Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)等模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRR)可以激活抗原提呈細(xì)胞和促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生,在先天性和獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,因此TLR是一種具有很大應(yīng)用前景的新型免疫佐劑[13]。Ov-ASP-1是TLR2和TLR4的配體,具有很強(qiáng)的免疫佐劑活性,活性區(qū)位于核心致病性相關(guān)-1(PR-1)結(jié)構(gòu)域[6]。重組大腸桿菌表達(dá)的PR-1不僅對(duì)卵清蛋白和乙肝表面抗原等具有體液免疫增強(qiáng)作用,還能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答[6],但其表達(dá)產(chǎn)物需用鎳親和柱純化,成本較高,難以規(guī)模化制備,在獸醫(yī)臨床使用中受到限制。ELP是根據(jù)體內(nèi)彈性蛋白重復(fù)序列合成的多聚體,具有免疫原低、體內(nèi)相容性好等優(yōu)點(diǎn),已作為藥物傳送載體和組織工程材料被研究人員進(jìn)行開發(fā)。更為重要的是,ELP具有溫度敏感的可逆相變特性,其融合蛋白可用簡(jiǎn)單的相變循環(huán)純化,是近年來(lái)快速發(fā)展的重組蛋白純化標(biāo)簽[8]。本研究中,ELP-PR1融合蛋白純化可以在2.5 h內(nèi)完成,純化蛋白的純度高達(dá)93%,與鎳親和層析純化His-PR1融合蛋白的效率(95%)接近。親和層析純化His-PR1融合蛋白的回收率和產(chǎn)量高于ELP-PR1融合蛋白,但需用價(jià)格較貴的鎳親和層析柱,而且純化過程需時(shí)長(zhǎng)達(dá)21 h,而ELP-PR1融合蛋白的純化僅需氯化鈉等常規(guī)化學(xué)試劑和離心機(jī)等簡(jiǎn)單設(shè)備。ELK16等自聚肽能自動(dòng)聚集成活性包涵體,因此其融合蛋白也可用簡(jiǎn)單的離心洗滌法純化[10-11],這在本研究中得到進(jìn)一步驗(yàn)證。

    圖5 免疫小鼠血清細(xì)胞因子檢測(cè)Fig.5 Detection of cytokines in immunized mouse serum

    自然環(huán)境中IBDV廣泛存在,疫苗使用非常普遍,所以難以找到適合免疫應(yīng)答研究的非免疫雛雞或雞胚,即使是非免疫雛雞或雞胚也不能保證無(wú)IBDV母源抗體存在。SPF雛雞不僅來(lái)源受限、價(jià)格較貴,試驗(yàn)過程中也容易受到IBDV污染而導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。小鼠為IBDV非易感動(dòng)物,SPF小鼠不僅來(lái)源方便,試驗(yàn)過程中也不會(huì)受到IBDV污染。因此,本研究分別將3種PR-1融合蛋白與IBDV重組VP2抗原進(jìn)行小鼠免疫試驗(yàn),以便對(duì)重組VP2抗原的免疫原性及其所需免疫佐劑進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

    初免后7 d,3個(gè)PR-1佐劑組VP2特異IgG滴度較VP2免疫對(duì)照組均有顯著提高,其中ELP-PR1佐劑組升高最顯著,ELK-PR1佐劑組與IFA佐劑組相當(dāng),His-PR1佐劑組較差。在初免后28 d,3個(gè)PR-1佐劑組VP2特異IgG滴度均進(jìn)一步升高,但抗體水平變化相似。除抗原特異性IgG1滴度不同程度升高外,3個(gè)PR-1佐劑組的IgG2c水平也有顯著升高,進(jìn)一步證明Ov-ASP-1的PR-1結(jié)構(gòu)域不僅能誘導(dǎo)平衡的Th1/Th2應(yīng)答,還能將免疫應(yīng)答向Th1偏移。在3個(gè)融合標(biāo)簽中,ELP不僅分子量最大(55 kDa),還能在體內(nèi)形成顆粒樣結(jié)構(gòu),可能是ELP-PR1佐劑活性較強(qiáng)的原因所在。His標(biāo)簽分子量最小(0.5 kDa),加之PR-1分子量也較?。?6 kDa),His-PR1免疫佐劑活性較低可能與其降解速度較快有關(guān)。

    細(xì)胞因子包括Th1和Th2類細(xì)胞因子,前者代表性細(xì)胞因子主要包括IL-6、IFN-γ和TNF-α,主要參與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié);后者代表性細(xì)胞因子主要有IL-4和IL-10,主要參與體液免疫調(diào)節(jié)[14]。在3個(gè)PR-1佐劑組中,ELP-PR1對(duì)IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α四種細(xì)胞因子產(chǎn)生的刺激作用均較強(qiáng),可能與其自身免疫佐劑活性有關(guān)。ELK-PR1 對(duì)IL-6、IL-10和TNF-α產(chǎn)生的刺激作用較強(qiáng),而His-PR1對(duì)IL-10和TNF-α產(chǎn)生的刺激作用較強(qiáng)。研究結(jié)果不僅證明PR-1能刺激Th1和Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生,而且提示不同融合標(biāo)簽對(duì)PR-1刺激產(chǎn)生的細(xì)胞因子種類可以產(chǎn)生影響。

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