豬源艱難梭菌的分離鑒定及特性分析

樊擎瑩，錢 滿，薛冰倩，魏世豪，王嘉怡，張 藝，汪 洋

（河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院 洛陽市畜禽分子病原與免疫學(xué)重點實驗室，洛陽 471023）

艱難梭菌（Clostridium difficile，CD）是一種常見的人畜共患病原體革蘭陽性厭氧芽胞梭菌。近年來，動物的艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）發(fā)病率逐漸上升，導(dǎo)致動物腹瀉、偽膜性腸炎（pseudomembranous colitis，PMC）甚至死亡[1]。國內(nèi)外人類艱難梭菌相關(guān)性腹瀉（Clostridium difficile- associated diarrhea，CDAD）的發(fā)病率和嚴(yán)重程度也呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，這與濫用抗生素導(dǎo)致耐藥菌株產(chǎn)生密切相關(guān)。最近的研究表明從由CD引起的人PMC病例中分離出的菌株與從家畜中分離的菌株在遺傳上相似[2]。CD主要通過粘附于腸道并產(chǎn)生毒素A和毒素B，有的強毒株還產(chǎn)生二元毒素作用于腸道而致病[3]。絕大多數(shù)人源或者動物源臨床分離菌對甲硝唑及萬古霉素呈高度敏感，但近年來已有異質(zhì)性耐藥或最低抑菌濃度上升的報道；對紅霉素和氟喹諾酮類等其他抗菌藥物的耐藥率在不同國家和地區(qū)則有較大差異[4]，國內(nèi)對CDI的關(guān)注也逐漸增多。目前大部分研究都是關(guān)于人源的艱難梭菌，對動物源性艱難梭菌的攜帶情況還不得而知。本研究對從養(yǎng)殖場疑似發(fā)病動物的糞便中收集到的艱難梭菌進行分離鑒定、抗生素敏感性分析以及毒素基因檢測，為我國畜禽業(yè)艱難梭菌的感染和流行提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品來源選擇河南省豫西地區(qū)5個養(yǎng)豬場近期曾用或正在應(yīng)用抗生素，出現(xiàn)腹瀉＞3次／24 h，且伴有糞便性狀改變（如稀便、水樣便、粘液膿血便）的豬（n=41）。用無菌糞盒采集未成形的大便制成標(biāo)本，2 h內(nèi)進行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.2 艱難梭菌分離培養(yǎng)、鑒定取自養(yǎng)殖場的病料標(biāo)本，用等體積的75%乙醇混合均勻。在室溫下靜置30 min，隨后5000 ×g離心15 min。取上清接種于環(huán)絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂（cycloserine-cefoxitinfructose agar，CCFA）選擇培養(yǎng)基上，于37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后挑選出具有典型艱難梭菌菌落形態(tài)（顏色為灰白色，表面粗糙，呈不規(guī)則形狀，邊緣不整齊，并具有特殊氣味）的菌落進行革蘭氏染色，鏡檢為革蘭陽性粗長桿菌兼具卵圓形芽孢者可初步鑒定為艱難梭菌。挑選可疑純菌落，提取DNA，用單重PCR的方法擴增16S rDNA基因并測序，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對鑒定。

1.3 艱難梭菌的毒素基因檢測挑取CCFA培養(yǎng)基上純化后典型單個菌落溶于200 μL 去離子水，100℃ 煮沸10 min。將懸浮液以12 000 ×g離心10 min ，取上清液用于PCR。依據(jù)參考文獻[5] 方法對毒素A、B 編碼基因tcdA、tcdB和二元毒素編碼基因cdtA、cdtB進行檢測。PCR引物由生工生物（上海）公司合成（表1）。多重PCR 反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL 2xTaq酶混合液、2.2 μL滅菌水、2 μL DNA、8.25 μL引物。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性50 s、52℃ 退火50 s，72℃延伸50s（30個循環(huán)）；最后72℃再延伸10 min。取10 μL PCR 產(chǎn)物，進行3.0%瓊脂糖凝膠電泳（120 V、90 mA、60 min），觀察結(jié)果。

1.4 最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）測定參照2013年CLSI推薦的《厭氧菌藥物敏感性試驗方法》（M11-A7）以及選藥原則與結(jié)果判定。采用瓊脂稀釋法測定受試藥物的MIC[6]。采用E-test法測定分離菌對9種抗菌藥物（阿莫西林、氨芐青霉素、克林霉素、紅霉素、左氧氟沙星、利奈唑酮、甲硝唑、利福平、萬古霉素）的MIC并判定結(jié)果。將倍比稀釋后不同濃度的9種抗菌藥物分別加入無菌的96孔酶標(biāo)板中，并做好標(biāo)記。第1至第11孔分別加入不同濃度的藥液。第12孔不加藥液作為空白對照。隨后取出于37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h的艱難梭菌，挑取單個菌落于強化Brucella肉湯中，調(diào)整菌液濃度為0.5個麥?zhǔn)蠞岫?。吸取適量0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木杭尤?6孔無菌培養(yǎng)板中，在37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用酶標(biāo)儀在600 nm處測定OD值，計算其抑菌率。

2 結(jié)果

2.1 艱難梭菌分離培養(yǎng)及鑒定結(jié)果37℃厭氧條件下CCFA平皿上菌落生長良好。挑選邊緣不齊、表面粗糙的黃色菌落（在紫外線照射下呈黃綠色熒光）。進行革蘭氏染色，在油鏡下可見到紫色的粗長桿菌，呈卵圓形或長形芽胞，位于次極端或極端（圖1）。

表1 多重PCR的引物Table 1 Primers used for PCR

圖1 分離株艱難梭菌革蘭氏染色鏡檢圖Fig.1 Gram staining result of isolated bacterial

2.2 艱難梭菌的基因檢測結(jié)果對初步鑒定的艱難梭菌進行多重PCR鑒定，基因tcdA、tcdB顯示為陽性，二元毒素編碼基因cdtA、cdtB為陰性。電泳結(jié)果見圖2。

2.3 抗生素耐藥情況采用E-test法對分離株選用阿莫西林、氨芐青霉素、克林霉素、紅霉素、左氧氟沙星、利奈唑酮、甲硝唑、利福平、萬古霉素進行MIC測定。艱難梭菌分離株對9種藥物的敏感性見表2。結(jié)果可見，分離株對紅霉素、萬古霉素、甲硝唑、利福平均呈現(xiàn)高度敏感。對克林霉素、阿莫西林、左氧氟沙星、利奈唑酮和青霉素呈現(xiàn)不同程度的耐藥。

圖2 豬源艱難梭菌分離株五重PCR結(jié)果Fig.2 Results of 5-plex PCR of C.difficile isolates from swines

3 討論

艱難梭菌是一種重要的條件性人畜共患致病菌，在長期使用抗菌藥物后容易引起菌群失調(diào)從而導(dǎo)致艱難梭菌感染（Clostridium difficileinfection，CDI），并引起CDAD，嚴(yán)重者可出現(xiàn)PMC甚至死亡[7]。國內(nèi)外研究表明食用動物肉類是人類感染的一個重要原因，研究發(fā)現(xiàn)CD也存在于健康的動物中，包括雞、牛以及豬等[1]。Fry等[7]對分離的豬源艱難梭菌的毒素型以及基因型與人源艱難梭菌進行比較，發(fā)現(xiàn)豬源艱難梭菌的基因型和人源的相似，表明人源艱難梭菌菌株和豬源艱難梭菌菌株可能具有共同的來源，由此可見CD可通過動物傳染給人，從而引起CDI更大范圍的流行。

抗菌藥物的應(yīng)用是CDI的最主要危險因素。一直以來甲硝唑和萬古霉素需被作為臨床上治療CDAD的一線藥物。甲硝唑有較高的體外活性，且成本較低，副作用較少。萬古霉素主要用于對甲硝唑無反應(yīng)或復(fù)發(fā)型CDAD患者。近年來有報道CD對這兩種藥物有不同程度的耐藥或者敏感性降低。北美和歐洲的監(jiān)測數(shù)據(jù)表明CD對萬古霉素已有一定的耐藥性，有報道稱核糖型027等流行株對多種抗菌藥物均呈現(xiàn)耐藥[7-9]。程穎等[10]檢測出1株甲硝唑耐藥株。本研究對從豬場發(fā)病動物病料中分離的1株CD進行耐藥性檢測，發(fā)現(xiàn)分離株對紅霉素、萬古霉素、甲硝唑、利福平均呈現(xiàn)高度敏感，對克林霉素、阿莫西林、左氧氟沙星、利奈唑酮和青霉素呈現(xiàn)不同程度的耐藥。結(jié)果說明本地區(qū)豬場CD的耐藥情況非常嚴(yán)重，并呈現(xiàn)多重耐藥。目前國內(nèi)外對CD的多重耐藥報道逐漸增多[11]，由于不同國家地區(qū)的菌株的遺傳特征和臨床用藥有差異，導(dǎo)致不同國家地區(qū)的耐藥種類和耐藥程度有所差異。黃海輝等[4]對從人臨床分離的188株CD進行耐藥性研究，多數(shù)菌株對萬古霉素呈高度敏感，僅有4株菌敏感性略降低（MIC值為4 mg/L）。目前美國僅從馬體內(nèi)分離出甲硝唑耐藥菌株，而萬古霉素耐藥菌株無論在動物源還是人源上均極其罕見[2]。研究發(fā)現(xiàn)所有的豬源艱難梭菌均對甲硝唑和萬古霉素敏感，但在臨床用藥方面仍要注意防止這兩種藥物耐藥菌株的出現(xiàn)。巴西研究人員從豬、豹貓以及人中分離的CD菌株9.3%對四環(huán)素表現(xiàn)出耐藥性，而幾乎所有早期分離出來的CD菌株均對四環(huán)素敏感[2]。克林霉素被認(rèn)為是引起CDAD的危險因素，研究表明CD對克林霉素有較高的耐藥率。CD對環(huán)丙沙星也呈現(xiàn)高度耐藥[4,11-13]。Pir?等[14]對來自動物（n=96）和人（n=92）的188株艱難梭菌進行檢測，發(fā)現(xiàn)所有菌株對萬古霉素和甲硝唑敏感，僅有3個分離株（1株來自人，2株來自豬）對甲硝唑的MIC值為2 μg/mL；環(huán)丙沙星在人類的耐藥率為100%，在動物中的耐藥率為97.9%；21.6%動物分離株及38.5%人分離株對克林霉素的敏感性均降低；人源菌株對四環(huán)素的耐藥率為11.9%，動物源耐藥菌株為9.4%。由于CD對喹諾酮類等藥物的高耐藥性導(dǎo)致其在全球多地暴發(fā)流行?？股卦谥委烠DI中起著核心作用，但是當(dāng)CD對常用抗菌藥物有耐藥性時，CDI的風(fēng)險性就會大大增加。研究發(fā)現(xiàn)在巴西分離的6株不同來源的CD對3種不同的抗生素呈現(xiàn)不同程度的耐藥，并且1株來自感染CDI的仔豬[2]。本次從養(yǎng)殖場發(fā)病動物中分離出的CD菌株對四環(huán)素、紅霉素和氟喹諾酮類藥物均出現(xiàn)了多重耐藥性，可見耐藥情況的嚴(yán)重性。養(yǎng)殖場仍可以把甲硝唑和萬古霉素作為首選藥物，但是應(yīng)注意防止CD對這兩種藥物敏感性下降。

表2 9 種抗生素對分離株艱難梭菌的MICTable 2 MICs of 9 antimicrobial agents for C. difficile isolates

艱難梭菌菌株分為產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株，兩者均可以在腸道內(nèi)定植。艱難梭菌產(chǎn)毒株在腸道上粘附繁殖產(chǎn)生毒素，毒素對腸道黏膜發(fā)揮病理作用。CD的致病性主要依賴毒素A（tcdA）和毒素B（tcdB），兩者均為單糖基轉(zhuǎn)移酶[3]。Fry等[7]所對分離的豬源CD進行PCR和DNA測序，發(fā)現(xiàn)85%的菌株屬于A+B+型，1.1%的菌株呈現(xiàn)A-B+型，81%的菌株對cdtB呈陽性并且攜帶tcdC基因。對同一頭豬體內(nèi)分離的菌株基因型進行評價，發(fā)現(xiàn)88%的豬只攜帶1種艱難梭菌，12%的豬攜帶1種以上的菌株。楊靖[13]等對727株不同人群CD分離株進行分析研究發(fā)現(xiàn)，543株CD的毒素A、B 基因均為陽性（tcdA+tcdB+），其中有4 株二元毒素基因陽性（cdtA+cdtB+）；184株毒素A、B基因為均陰性（cdtA-cdtB-）。對產(chǎn)毒株和非產(chǎn)毒株的耐藥率進行比較發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)毒株對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星和氯霉素的耐藥率高于非產(chǎn)毒株。最近A-B+型菌株已經(jīng)被報道可引起嚴(yán)重的感染和爆發(fā)[15]。據(jù)報道顯示，加拿大A-B+型菌株占3%，韓國為21.4%，上海為23.2%[16-17]。本研究從CDI的豬體內(nèi)分離出1株僅攜帶毒素A、B的菌株，但豬體內(nèi)可能同時攜帶多種菌株，而多個菌株之間可以相互促進，進而促進耐藥基因或者毒素基因間的水平轉(zhuǎn)移。本次從養(yǎng)殖場分離出的耐藥菌株，顯示CDI控制措施的必要性。養(yǎng)殖場抗生素的使用需要防止高度耐藥菌株的出現(xiàn)。