化膿性鏈球菌耐藥與毒力基因研究

鄭黎黎 徐燕,* 張卉 安寧 楊平玲

(1 日照市中心醫(yī)院檢驗科，日照 276800；2 日照市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，日照 276800)

化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)亦稱A鏈球菌群(group A streptococci)是急性扁桃體炎、急性咽炎重要病原菌之一。人感染化膿性鏈球菌后會出現(xiàn)人體的變態(tài)反應(yīng)并可導(dǎo)致猩紅熱、風(fēng)濕熱和急性腎小球腎炎。所以對化膿性鏈球菌感染者進(jìn)行早期而有效的治療對預(yù)防上述疾病的發(fā)生十分有用。多年來, 有關(guān)化膿性鏈球菌對抗菌藥物的敏感性研究較多[1-5]，但尚無該菌的毒力基因研究報道。本文從急性扁桃體炎、急性咽炎患者的咽喉部分離到70株化膿性鏈球菌，為探討該菌的耐藥與毒力基因存在狀況, 我們進(jìn)行了8種與耐藥相關(guān)的元件基因(以下簡稱8種耐藥基因)和3種毒力基因檢測，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

70株化膿性鏈球菌分離自日照市中心醫(yī)院2012—2017年急性扁桃體炎、急性咽炎患者的咽拭子標(biāo)本。菌種均經(jīng)VITEK 2細(xì)菌鑒定藥敏分析儀鑒定。

1.2 抗菌藥物的藥敏試驗

5種抗菌藥物敏感性試驗為K-B藥敏紙片法。藥敏紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品。

1.3 菌株DNA提取

化膿性鏈球菌菌體DNA制備為非離子去污劑裂解加蛋白酶K消化法。菌體DNA制備試劑盒由該無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。挑取單個菌落放入菌體DNA制備試劑盒提供的裂解液A(非離子去污劑)與裂解液B(蛋白酶K)混合液中，然后60℃水浴100min，再用100℃水浴10min即可。

1.4 耐藥與毒力基因檢測

8種耐藥基因和3種毒力基因檢測均為PCR法。檢測項目見表1。引物序列由無錫新吳區(qū)新克隆數(shù)據(jù)分析工作室提供，PCR試劑盒由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供，實驗步驟完全按說明書進(jìn)行操作。每種PCR檢測的反應(yīng)系統(tǒng)均為重組的耐熱DNA聚合酶(rTaq DNA pol，日本Takara公司產(chǎn)品)1個單位(體積0.2μL)，與重組的耐熱DNA聚合酶配匹的10倍濃度緩沖液2μL；上游引物2μL(1.0μmol/L)，下游引物2μL(1.0μmol/L)；dATP、dCTP、dTTP和dGTP混合液2μL(濃度均2mmol/L)；超純水7μL，菌株DNA提取液4.8μL，合計總體積20μL。熱循環(huán)為：95℃預(yù)變性2min，然后95℃ 30s→55℃ 30s→72℃ 60s，重復(fù)30周期，最后一輪72℃延長至5min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳30min，紫外線下凝膠上出現(xiàn)與陽性對照分子量相同的目的條帶即判別為陽性。

表1 耐藥與毒力基因檢測PCR引物序列和目的產(chǎn)物長度Tab.1 PCR primers and the length of the target product of resistant determinants and virulence factors in 70 S.pyogenes

1.5 DNA序列檢測分析

毒力基因的PCR陽性產(chǎn)物委托上海鉑尚生物技術(shù)公司作DNA序列檢測，測得序列后用Chromas軟件在線作美國基因庫BLASTn比對(www.ncbi.nlm.nih.gov)。

1.6 基于檢測結(jié)果的樣本聚類分析

對8種耐藥基因和3種毒力基因檢測結(jié)果委托無錫新吳區(qū)新克隆數(shù)據(jù)分析工作室作UPGMA法分析。

2 結(jié)果

2.1 抗菌藥物的藥敏試驗

70株化膿性鏈球菌對青霉素、苯唑西林、萬古霉素敏感性均達(dá)100.00%，對紅霉素耐藥率較高(94.29%)。70株化膿性鏈球菌藥敏試驗結(jié)果見表2。

2.2 耐藥與毒力基因檢測

70株化膿性鏈球菌經(jīng)耐藥基因檢測，青霉素耐藥基因無陽性結(jié)果發(fā)現(xiàn)。大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因檢出ermB和mefA基因，其中ermB和/或mefA陽性66株，陽性率達(dá)94.29%?？梢苿舆z傳元件標(biāo)志基因intTN916檢出率高達(dá)94.29%。毒力基因檢測則發(fā)現(xiàn)3種毒力基因均有較高的檢出率。各種基因檢測結(jié)果陽性率詳見表3。圖1～3為spyA、 sagA、slo PCR陽性產(chǎn)物測序圖。

2.3 基于檢測結(jié)果的指標(biāo)樣本聚類分析

對8種耐藥基因和3種毒力基因檢測結(jié)果作UPGMA法樣本聚類分析，由圖4可見，70株化膿性鏈球菌由分為A～N，共14個分類單元，并可分為Ⅰ、Ⅱ兩個群，其中Ⅰ群由A、D、I、N、C、K、L、F、J等9個分類單元構(gòu)成(該9個分類單元均攜帶ermB基因)，Ⅱ群由E、M、B、G、H等5個分類單元構(gòu)成(5個分類單元均不攜帶ermB基因)。70株化膿性鏈球菌耐藥與毒力基因檢測結(jié)果經(jīng)樣本聚類分析，14個分類單元中各成員(菌株號)與陽性模式及占比見表4。

表2 70株化膿性鏈球菌藥敏試驗結(jié)果Tab.2 Result of drug sensitivity test of 70 S.pyogenes to 5 antimicrobial agents

表3 70株化膿性鏈球菌耐藥與毒力基因檢測陽性率Tab.3 Positive rates of resistance determinants and virulence factors in 70 S.pyogenes

3 討論

圖1 spyA PCR陽性產(chǎn)物測序圖Fig.1 Part sequence of spyA

圖2 sagA PCR陽性產(chǎn)物測序圖Fig.2 Part sequence of sagA

圖3 slo PCR陽性產(chǎn)物測序圖Fig.3 Part sequence of slo

圖4 70株化膿性鏈球菌的8種耐藥基因和3種毒力基因檢測結(jié)果樣本聚類分析Fig.4 Sample cluster analysis of 8 kinds of resistant determiants and 2 kinds of virulence factors in 70 S.pyogenes

本文70株化膿性鏈球菌的抗菌藥物藥敏試驗結(jié)果顯示對青霉素、苯唑西林、萬古霉素敏感性均達(dá)100.00%，其中青霉素的敏感率與先前國內(nèi)的文獻(xiàn)報道一致[1-4]，與國外的綜述性報告亦一致[6]。本文70株化膿性鏈球菌沒有檢出青霉素耐藥基因亦進(jìn)一步佐證了藥敏試驗結(jié)果。本文菌株的紅霉素耐藥率極高(達(dá)94.29%)，與之相關(guān)的大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因檢出ermB和mefA基因，況且ermB和/或mefA陽性達(dá)66株(陽性率達(dá)94.29%)，與本文菌株的紅霉素耐藥率完全一致。本文70株化膿性鏈球菌的紅霉素高耐藥率及ermB基因高檢出率與來自國內(nèi)北京與上海的報告一致[3-5]。國外的綜述性報告中亦顯示化膿性鏈球菌對紅霉素耐藥率高相吻合[6]。可見青霉素仍是治療化膿性鏈球菌感染的首選藥物。接合型轉(zhuǎn)座酶基因intTN916是接合型轉(zhuǎn)座子Tn916的遺傳標(biāo)志。接合型轉(zhuǎn)座子Tn916介導(dǎo)球菌的獲得性耐藥基因, 是球菌的重要可移動遺傳元件[7]。本文菌株intTN916檢出率達(dá)94.29%，與ermB檢出率92.86%大體一致。這是國內(nèi)首次進(jìn)行化膿性鏈球菌的intTN916檢測報告。

化膿性鏈球菌具有多種類型的毒力因子，如:黏附毒素、細(xì)胞毒素、胞外酶、蛋白酶、DNA酶、免疫反應(yīng)性抗原、超抗原以及免疫逃避機制。國內(nèi)尚無上述毒力因子編碼基因的檢測研究報道。細(xì)胞毒素是化膿性鏈球菌的重要毒力因子, 本文檢測了spyA、sagA和slo3種細(xì)胞毒素毒力因子編碼基因(毒力基因)。spyA基因編碼一種新的ADP-核糖酰轉(zhuǎn)移酶(ADP-ribosyltransferase)，具有破壞宿主細(xì)胞骨架促進(jìn)化膿性鏈球菌在感染病灶部的繁殖能力[8]。sagA基因編碼鏈球菌溶血素S(streptolysin S)是一種小分子的糖肽穿孔毒素，對淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血小板和上皮細(xì)胞均有破壞作用。鏈球菌溶血素S無抗原性。slo基因編碼鏈球菌溶血素鏈球菌溶血素O(streptolysin O)為蛋白質(zhì)穿孔毒素，已被證明會破壞細(xì)胞膜的完整性(包括多種細(xì)胞類型的上皮細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)[9]。鏈球菌溶血素O抗原性強。本文70株化膿性鏈球菌的spyA、sagA和slo等3種毒力基因檢出率分別高達(dá)82.86%、97.14%和91.43%。由表4可見，每個分類單元的化膿性鏈球菌菌株均檢出毒力基因,其中只有C分類單元(成員為4號菌株)、F分類單元(成員為9號菌株)，共2株菌僅攜帶1種毒力基因(2.86%)，其余均攜帶2種以上毒力基因(97.14%)。2016年，Ibrahim等[10]對分離自咽炎和皮膚感染者的9株化膿性鏈球菌進(jìn)行了全基因組測序分析，該9株化膿性鏈球菌均攜帶sagA和slo基因。本研究提示spyA、sagA和slo 3種毒力基因是化膿性鏈球菌常見的毒力基因。推測它們是化膿性鏈球菌感染導(dǎo)致感染灶局部炎癥和壞死的原因。本文樣本聚類分析可見，70株化膿性鏈球菌分為A～N共14個分類單元，根據(jù)是否攜帶ermB基因，可分為Ⅰ和Ⅱ2個群，Ⅰ群9個分類單元(65株)均攜帶ermB基因，Ⅱ群5個分類單元(5株)均不攜帶ermB基因。并且Ⅰ群中intTN916、sagA和slo的攜帶率亦較高，推測化膿性鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物高耐藥率是耐藥基因和毒力基因共同作用的結(jié)果。

表4 70株化膿性鏈球菌耐藥與毒力基因檢測結(jié)果樣本聚類分析(分類單元與陽性模式及占比)Tab.4 Sample cluster analysis of resistant determiants and virulence factors in 70 S.pyogenes (OTUs, positive modes and positive rates)