巨峰葡萄Rs基因的克隆鑒定、 序列分析與時(shí)空表達(dá)特征研究

崔騰飛，王 晨，譚紅雨，賈海鋒，白云赫，王文然，房經(jīng)貴

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

白藜蘆醇(Resveratrol)，簡稱Res，早在1924年就被發(fā)現(xiàn)[1]，化學(xué)名稱為3，4′，5-三羥基-1，2-二苯乙烯(3，4′，5-trihydroxystilbene)，分子式C14H12O3，相對分子質(zhì)量228.25[2]，其存在順式和反式2種類型[3]。白藜蘆醇是在植物體內(nèi)受到了病原體侵染或者在惡劣環(huán)境條件下，植物體內(nèi)自身分泌的一種抗毒素[4]，具有增強(qiáng)植物抗逆性的作用。白藜蘆醇廣泛存在各種植物體中，其中在葡萄科植物中白藜蘆醇含量較高[5]。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)Res具有很強(qiáng)的預(yù)防和抑制心血管疾病及抗癌作用[6]。另外，它還具有如抗氧化、抗腫瘤、抗血小板凝聚、抗細(xì)菌和真菌等醫(yī)療保健作用。因此，白藜蘆醇已成為科學(xué)家們高度重視的天然活性成分[7]。目前，很多國家和地區(qū)都開發(fā)生產(chǎn)了白藜蘆醇及其制品并應(yīng)用于食品、醫(yī)療保健品和化妝品等領(lǐng)域。比如，日本將白藜蘆醇作為食品添加劑，美國將白藜蘆醇納入膳食補(bǔ)充劑，我國也將白藜蘆醇制成了天然保健食品[8-10]。

白藜蘆醇是一種天然多酚類化合物，目前至少已在21科、31屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)[11]。其廣泛存在于自然界中，包括葡萄、虎杖[12]、花生[13-14]、豆類[15]等植物或果實(shí)中均有存在。在現(xiàn)有報(bào)道中，葡萄中含量較高，但在葡萄不同部位中白藜蘆醇含量不同，而葡萄皮是白藜蘆醇的主要合成部位。盡管葡萄中白藜蘆醇的含量相對較高，但是作為一種次生代謝物質(zhì)，自然條件下在植物體內(nèi)的含量相對較低，所以僅僅以目前栽培的天然葡萄果實(shí)為白藜蘆醇的來源遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了人們的需求，欲實(shí)現(xiàn)葡萄中白藜蘆醇的高效富集，很有必要認(rèn)識(shí)葡萄中白藜蘆醇代謝的調(diào)控機(jī)制。而白藜蘆醇的合成受到苯丙氨酸裂解酶(PAL)、4-香豆酸：輔酶A連接酶(4CL)、肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)、二苯乙烯合酶(STS)、赤松素-甲氧基轉(zhuǎn)移酶(PMT)甚至查爾酮合成酶(CHS)等多個(gè)酶促反應(yīng)的調(diào)節(jié)控制，其中最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)酶是白藜蘆醇合酶(Rs)。Rs又被稱為3，4′，5-三羥基二苯乙烯合酶，為酮二聚物，是STS中的一類[16]。因此，研究葡萄Rs基因在白藜蘆醇代謝過程中的調(diào)控作用顯得尤為重要，而巨峰葡萄作為目前生產(chǎn)中栽培最廣的品種，且巨峰葡萄Rs基因相關(guān)的研究鮮有報(bào)道，故本研究對巨峰葡萄開展了Rs基因的初步研究，以期為認(rèn)識(shí)Rs基因在葡萄白藜蘆醇代謝過程中的調(diào)控作用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

供試巨峰葡萄(Vitisviniferacv.Kyoho)果實(shí)均采自江蘇農(nóng)博園葡萄種植基地，分別為花后25，40，60，80 d不同成熟度的葡萄果實(shí)。

試驗(yàn)所用試劑主要有：Tris、山梨醇、PEG、CTAB、NaCl、EDTA、KAc、C2H2OH、氯仿、LiCl、異丙醇，以及由TaKaRa生物工程有限公司生產(chǎn)的RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和捷倍思生物基因技術(shù)有限公司的DNA凝膠回收試劑盒，此外還有Taq酶、T4DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶。主要載體有pMD19-T和pCAMBIA1302。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄總RNA的提取及cDNA合成 采用改良CTAB法[17]提取巨峰葡萄不同時(shí)期果肉和果皮中總RNA。用紫外分光光度計(jì)測定總RNA的OD260和OD280，通過比值大小判定其濃度和純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA完整度，如圖1所示，提取的總RNA條帶較為清晰，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。然后將RNA按照TaKaRaPrimeScriptTMRT-PCRKit操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

圖1 巨峰葡萄果皮和果肉總RNA電泳Fig.1 Total RNA electrophoresis of peel and pulp of Kyoho grape

1.2.2 PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中已報(bào)道的葡萄Rs基因序列，基本信息如表1所示，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物：上游引物rs1：5′-ATGGCT

TCAGTCGAGGAATTTA-3′；下游引物rs2：5′-TTAAT

TTGTAACCATAGGAACGCTATG-3′。根據(jù)載體pCAMBIA1302，選取BglⅡ和NheⅠ 2個(gè)酶切位點(diǎn)，加酶切后上游引物rs3：5′-GAAGATCTATGGCTTCAG

TCGAGGAATTTA-3′；下游引物：rs4：5′-CTAGCTAGC TTAATTTGTAACCATAGGAACGCTATG-3′。引物由擎科生物有限公司合成。

表1 葡萄Rs基因基本信息Tab.1 Basic information on the Rs gene of grapes

1.2.3 目的基因的克隆 以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，擴(kuò)增巨峰葡萄Rs的序列。使用25.0 μL的PCR反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液2.5 μL，提取的樣品Cdna 2.0 μL，上游引物rs1(25 mmol/L)1.0 μL，下游引物rs2(25 mmol/L)1.0 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL，rTaqDNA聚合酶0.2 μL，滅菌的無核酸重蒸水17.8 μL，離心混勻。在PCR儀中94 ℃預(yù)變性5 min后，按以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94 ℃變性30 s，53～64 ℃的溫度梯度退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min結(jié)束反應(yīng)。然后瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如圖2-A所示。按照膠回收試劑盒說明回收DNA，以回收產(chǎn)物為模板利用引物rs3和rs4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳如圖2-B所示，將PCR產(chǎn)物純化回收并連接pMD-19T載體，16 ℃連接過夜后轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行測序。

A.以rs1/rs2為引物，使用RT-PCR擴(kuò)增的目的基因片段，約為1 200 bp；B.將目的片段回收以rs3/rs4為引物擴(kuò)增后的片段，即加酶切位點(diǎn)后的片段。A.rs1/rs2 is used as a primer，and the target gene fragment amplified by RT-PCR is about 1 200 bp; B.The fragment of interest is recovered by rs3/rs4 as a fragment amplified by the primer，that is，the fragment after the restriction enzyme site is added.

1.2.4Rs基因生物信息學(xué)分析 應(yīng)用網(wǎng)站ORF Finder(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找開放閱讀框(Open reading frame，ORF)；利用NCBI在線軟件Blast搜索比對，下載其他植物相似性高的氨基酸序列，使用MEGA 5.0軟件根據(jù)相鄰連接方法(Neighbor jointing，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并分析利用在線軟件MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)對葡萄Rs蛋白進(jìn)行基序預(yù)測。使用在線軟件ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及氨基酸組成；分別用在線軟件SOPMA和Swiss-Model等對Rs蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析，對其三級結(jié)構(gòu)建模并進(jìn)行不同物種間對比分析；利用在線軟件STRING(https：//string-db.org/cgi/input.pl? UserId=input_page_show_search=on)對Rs基因進(jìn)行蛋白互作分析；采用WoLF PSORT(http：//www.genscript.com/wolf-psort.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位；利用PlantCARE對獲得的葡萄Rs基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行了順式作用元件的分析及功能預(yù)測并分析啟動(dòng)子的motif作用類型和數(shù)量。

1.2.5 基因表達(dá)特異性分析 采用qRT-PCR技術(shù)，用試劑盒以及iQTM5Software和iQTM5Real-timePCRSystem分析不同發(fā)育階段葡萄果皮和果肉中目的基因的表達(dá)特性。根據(jù)克隆獲得的目的基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為：5′-GGCTTTTGA

CCCACTTGGTA-3′；下游引物序列為：5′-GTGGCTTT

TTCCCCCTTTAG-3′，以葡萄的actin基因(登錄號：XM_019223591.1)為內(nèi)參基因，上游引物序列為：5′-TACAATTCCATCATGAAGTGTGATG-3′；下游引物序列為：5′-TTAGAAGCACTTCCTGTGAACAATG-3′。擴(kuò)增體系總體積為20.0 μL，其中cDNA模板1.0 μL、上、下游引物各0.4 μL、2×Supermix 10.0 μL、雙蒸水8.2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s,55 ℃退火15 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃保溫10 s。繪制熔解曲線，并根據(jù)2-ΔΔCT計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨峰葡萄Rs基因克隆及序列進(jìn)化分析

2.1.1Rs基因克隆及序列分析 為研究Rs的潛在作用，開發(fā)其利用價(jià)值，本研究以巨峰葡萄cDNA為模板，利用引物rs1和rs2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到序列為1 539 bp。經(jīng)測序、分析，該序列含有一個(gè)完整的開放閱讀框，其大小是1 179 bp，共編碼392個(gè)氨基酸。如圖3所示，該序列含有查耳酮和二苯乙烯合酶活性位點(diǎn)RVMLYHQGCYAGGTVLR，并具有完整的芪合酶家族特征位點(diǎn)GVLFGFGPGLT，該蛋白屬于查耳酮合酶家族，結(jié)構(gòu)域序列號為cl28398，結(jié)構(gòu)域匹配E值為0e+00。

三角形表示起始密碼子和終止密碼子；單下劃線表示芪合酶家族特征位點(diǎn)GVLFGFGPGLT；雙下劃線表示查耳酮和二苯乙烯合酶活性位點(diǎn)。The triangle indicates the start codon and the stop codon; the single underline indicates the stilb enzyme family signature GVLFGFGPGLT; the double underline indicates the chalcones and stilbene synthase active sites.

2.1.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析 通過在NCBI中Blast搜索比對類似序列，采用MEGA 5.0軟件對巨峰葡萄Rs基因編碼的氨基酸序列同擬南芥、番茄、草莓等植物的同源序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析其保守性。如圖4-A所示，巨峰葡萄Rs基因與圓葉葡萄(ACM 47246.1)氨基酸序列一致性高達(dá)99%，與番茄(NP 001234033.2)氨基酸序列一致性為76%，與草莓(XP 004306542.1)和落花生(AID 59203.1)氨基酸序列一致性均為74%，而與擬南芥(NP 196897.1)氨基酸序列一致性為73%。證明Rs基因在葡萄屬中保守性較高，而在不同屬之間存在一定差異，但差異不大。

A．葡萄Rs基因構(gòu)建的進(jìn)化樹；B.葡萄Rs蛋白基序的MEME分析。A.Phylogenetic tree constructed from grape Rs gene;B.MEME analysis of grape Rs protein motifs.

基于Rs基因進(jìn)化分析，本研究用MEME軟件構(gòu)建了蛋白基序結(jié)構(gòu)圖(圖4-B)。研究發(fā)現(xiàn)，巨峰葡萄Rs基因與同屬的圓葉葡萄(Vitisrotundifolia)蛋白長度和蛋白基序位置一致性較大，并且與不同屬之間差異較小，進(jìn)一步表明葡萄Rs基因在分子結(jié)構(gòu)進(jìn)化中具有較高的保守性。

2.2 Rs基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 Rs蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及氨基酸組成分析 通過表2可以看出，巨峰葡萄Rs編碼392個(gè)氨基酸；分子質(zhì)量為42.88 ku，理論等電點(diǎn)pI為6.09；在編碼蛋白中，酸性氨基酸所占比例高于堿性氨基酸；不穩(wěn)定系數(shù)小于40，故為穩(wěn)定性蛋白；親水性平均值為-0.047，則該蛋白屬于弱親水性蛋白。

2.2.2 Rs蛋白二級結(jié)構(gòu)分析 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是構(gòu)成其高級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，主要包括4種基本形式：α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，此外也包含延伸鏈等其他形式[18]。如表3和圖5所示，從二級結(jié)構(gòu)分析預(yù)測結(jié)果能夠看出，巨峰葡萄Rs蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成和分布為，α-螺旋為44.13%，β-轉(zhuǎn)角為11.48%，無規(guī)則卷曲為26.79%，延伸鏈為17.60%。巨峰葡萄Rs蛋白二級結(jié)構(gòu)主要成分是α-螺旋。

表2 巨峰葡萄Rs蛋白理化性質(zhì)Tab.2 Kyoho grapes Rs protein physical and chemical properties

注：不穩(wěn)定指數(shù)中S(Stability)表示穩(wěn)定，I(Instability)表示不穩(wěn)定。

Note：The unstable index S(Stability)express stable，I(Instability)express is not stable.

表3 巨峰葡萄Rs蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Tab.3 Prediction of secondary structure of Rs protein in Kyoho grapes %

圖5 巨峰葡萄白藜蘆醇合酶基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)分布Fig.5 Secondary structure map of resveratrol synthase gene encoding Kyoho grapes

2.2.3 Rs蛋白三級結(jié)構(gòu)分析 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)是在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步的盤繞折疊形成的，分析預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)有利于更加深入地了解Rs基因，開發(fā)其潛在的利用價(jià)值。故利用在線軟件Swiss-Model，對巨峰葡萄Rs蛋白進(jìn)行了三維結(jié)構(gòu)建模，并且將其和同屬的圓葉葡萄以及親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的落花生進(jìn)行比較。如圖6，建模結(jié)果顯示，巨峰葡萄Rs蛋白三級結(jié)構(gòu)與親緣關(guān)系近的圓葉葡萄相似性較高，而與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的落花生存在明顯差異。進(jìn)一步證明Rs基因在葡萄屬中具有較高的保守性。

A、B、C分別為圓葉葡萄、巨峰葡萄和落花生蛋白的三級結(jié)構(gòu)。A，B，C，respectively the Round leaf gropes，Kyoho grapes and peanut protein tertiary structure.

2.2.4 Rs蛋白互作預(yù)測 通過蛋白互作預(yù)測發(fā)現(xiàn)Rs與5個(gè)蛋白有共表達(dá)，其中有4個(gè)為假定蛋白，一個(gè)為氧-甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT2.1)。預(yù)測發(fā)現(xiàn)這些蛋白的功能可能與次生代謝相關(guān)。如圖7所示，其中VIT_12s0028g01880.t01基因編碼氧-甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT2.1)，可催化白藜蘆醇生物合成紫檀芪，紫檀芪是一種主要存在于紫檀、藍(lán)莓、葡萄和花櫚木等植物的有效成分，具有抗真菌和一定的藥理學(xué)性質(zhì)，在抗癌、抗氧化等方面具有一定的功效。 故推測Rs與OMT2.1在植物受到病原體侵染時(shí)將會(huì)高表達(dá)以增加植物的抗性。

2.3 亞細(xì)胞定位及啟動(dòng)子分析

2.3.1 葡萄Rs基因亞細(xì)胞定位預(yù)測 如表4所示，亞細(xì)胞預(yù)測表明：巨峰葡萄Rs基因主要集中在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中表達(dá)，而在高爾基體和液泡中均不表達(dá)，此外巨峰葡萄Rs基因在細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞膜和過氧化物酶體中有少量表達(dá)。故推測可知，Rs基因表達(dá)部位、表達(dá)量不同可能與葡萄不同組織中白藜蘆醇的含量具有一定的相關(guān)性。

圖7 Rs蛋白互作分析Fig.7 Rs protein interaction analysis

表4 巨峰葡萄Rs基因亞細(xì)胞定位預(yù)測Tab.4 Kyoho grapes Rs gene subcellular localization prediction

注：A.細(xì)胞質(zhì)；B.高爾基體；C.葉綠體；D.細(xì)胞核；E.線粒體；F.液泡；G.細(xì)胞膜；H.過氧化物酶體。

Note：A.Cytoplasm;B.Golgi apparatus;C.Chloroplast;D.Nucleus;E.Mitochondria;F.Vacuole;G.Plasma membrane;H.Peroxisomes.

2.3.2 葡萄Rs基因啟動(dòng)子的motif分析 利用PlantCARE對獲得的巨峰葡萄Rs基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行了順式作用元件的分析及功能預(yù)測。序列分析顯示，該啟動(dòng)子序列具有典型的核心啟動(dòng)子元件，有32個(gè)CAAT-box和50個(gè)TATA-box，其中CAAT-box決定了啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄的效率及頻率，可增強(qiáng)啟動(dòng)子的強(qiáng)度[19]。除此之外，如表5所示巨峰葡萄Rs啟動(dòng)子區(qū)片段還包含了光響應(yīng)元件、參與晝夜節(jié)律控制的順式作用調(diào)控元件、赤霉素響應(yīng)元件、參與脫落酸反應(yīng)的順式作用元件和MYB Hv1和MYB結(jié)合位點(diǎn)以及真菌誘導(dǎo)反應(yīng)元件，并且具有參與胚乳表達(dá)的順式調(diào)控元件。因此推測，巨峰葡萄Rs基因的表達(dá)可能受光照、激素、MYB的調(diào)控以及真菌的誘導(dǎo)，并且在胚乳中表達(dá)可能具有一定的時(shí)空特異性。對巨峰葡萄白藜蘆醇合酶基因的motif進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，如圖8所示，從圖中可以看出，與激素相關(guān)的motif主要兩類，分別是與赤霉素(GA)和水楊酸(SA)響應(yīng)相關(guān)的motif，推測Rs基因能夠響應(yīng)GA和SA，也進(jìn)一步表明Rs基因的表達(dá)可能受激素的調(diào)控。

表5 巨峰葡萄Rs基因啟動(dòng)子序列順式作用元件分析Tab.5 Kyoho grapes Rs gene promoter sequence cis-acting element analysis

圖8 巨峰葡萄Rs基因motif分析Fig.8 Motif analysis of Rs gene in Kyoho grape

2.4 Rs基因的表達(dá)特異性分析

采用qRT-PCR技術(shù)對巨峰葡萄果實(shí)和果皮不同生長發(fā)育階段中Rs基因的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖9所示，Rs基因在葡萄4個(gè)不同生長發(fā)育階段(青：花后25 d；微紅：花后40 d；全紅：花后60 d；深紅：花后80 d)的果皮和果肉中均有表達(dá)，但表達(dá)量有所差異；除在葡萄花后80 d之外，其余3個(gè)時(shí)期葡萄果皮中Rs基因的表達(dá)量均高于果肉；花后25 d時(shí)Rs基因的表達(dá)量在不同組織中均是最高，之后都有不同程度的變化。綜合來看，Rs基因的表達(dá)量在巨峰葡萄花后25 d的果皮中表達(dá)量最高，之后隨著果實(shí)顏色的加深，其表達(dá)量逐漸減少，到花后80 d時(shí)達(dá)到最低。定量結(jié)果表明，Rs基因在巨峰葡萄果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)具有時(shí)空特異性。

圖9 不同生長發(fā)育階段巨峰葡萄果實(shí)中Rs基因相對表達(dá)量比較Fig.9 Comparison of Rs gene expression in Kyoho grapes at different growth and development stages

3 結(jié)論與討論

隨著人們對白藜蘆醇的認(rèn)識(shí)逐漸加深，白藜蘆醇的開發(fā)利用也愈發(fā)廣泛。同時(shí)伴隨著葡萄副產(chǎn)品的研發(fā)，葡萄酒、果醋等產(chǎn)品層出不窮。白藜蘆醇不僅是植物自身分泌的抗毒素，能使植物對某些疾病產(chǎn)生抗性，而且對人體具有重要的保健作用。有研究發(fā)現(xiàn)，葡萄果醋中富含大量的白藜蘆醇[20]，經(jīng)常食用能夠增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，王茜等[21]、熊赪等[22]發(fā)現(xiàn)葡萄果醋中的白藜蘆醇具有防癌抗癌的作用。然而Rs基因是白藜蘆醇合成途徑中最后一個(gè)起重要作用的關(guān)鍵酶[23]，其屬STS中的一類。伴隨著人們對白藜蘆醇了解的逐漸深入，Rs基因的研究也早已倍受科學(xué)家們的關(guān)注。

現(xiàn)已在虎杖、花生和豆類等多種植物中克隆得到Rs基因，不同來源的Rs基因在結(jié)構(gòu)存在一定的差異，當(dāng)然其合成Res的能力也不同，因此關(guān)于Rs基因的研究十分活躍[24]。白藜蘆醇在葡萄中含量豐富，特別是在葡萄皮和葡萄籽中的含量尤其豐富[25]。然而以往對葡萄果實(shí)生長發(fā)育過程中白藜蘆醇的研究發(fā)現(xiàn)，既有研究表明Res含量從果實(shí)綠果期到成熟期穩(wěn)定下降[26]，也有在成熟期最高的結(jié)果[27]。此外，余興[28]和代紅軍等[29]研究表明，在釀酒葡萄蛇龍珠和赤霞珠葡萄生長發(fā)育過程中，果實(shí)中白藜蘆醇的變化趨勢呈雙峰型。因此，探究白藜蘆醇在葡萄果實(shí)生長發(fā)育過程中的變化趨勢顯得更加重要。本研究發(fā)現(xiàn)，在巨峰葡萄果實(shí)不同生長發(fā)育階段Rs基因在果皮和果肉中均有表達(dá)，且整體呈穩(wěn)定下降趨勢。主要表現(xiàn)為隨著葡萄果實(shí)顏色的加深，果皮中表達(dá)量遞減，而果肉中基本穩(wěn)定不變。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，同屬于歐美雜種的峰后和藤稔果皮中白藜蘆醇含量的最高時(shí)期均出現(xiàn)在轉(zhuǎn)色前的始熟期，且成熟時(shí)著色越深果皮中白藜蘆醇含量下降越快[30]，然而，鄭先波等[31]同我們研究發(fā)現(xiàn)相左；同時(shí)，Jeandet等[32-34]認(rèn)為Res合成能力在果實(shí)成熟期驟然下降，源于葡萄不同生長期Res和花青素苷合成競爭關(guān)系，出現(xiàn)了Res合成能力的下降伴隨著一系列花青素苷物質(zhì)的升高現(xiàn)象。本研究主要從鑒定巨峰葡萄Rs基因、蛋白功能分析和預(yù)測以及白藜蘆醇在葡萄果實(shí)中的時(shí)空表達(dá)特異性進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)Rs基因主要在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中表達(dá)，且與OMT2.1具有互作。此外，Rs基因表達(dá)可能受光照、MYB、真菌和激素的調(diào)控，并且具有一定的時(shí)空特異性，主要表現(xiàn)為花后25 d的青皮中表達(dá)量最高。