桃肉質(zhì)及粘離核性狀形成及其相關(guān)基因的表達(dá)分析

韓 晴，曹 珂，朱更瑞，方偉超，陳昌文，王新衛(wèi)，劉擴(kuò)展，游雙紅，王力榮

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 鄭州果樹(shù)研究所，河南 鄭州 450009；2.重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶 401329)

桃(PrunuspersicaL. Batsch)是深受大眾喜愛(ài)的大宗果品之一，尤以溶質(zhì)型鮮食品種為主。桃果肉的質(zhì)地可分為溶質(zhì)、不溶質(zhì)、硬質(zhì)3種類(lèi)型[1-2]。此外，根據(jù)桃果肉(中果皮)與核(內(nèi)果皮)的粘連程度又可以將桃分為離核和粘核2種類(lèi)型[3]。研究發(fā)現(xiàn)，桃果實(shí)成熟過(guò)程中，果肉質(zhì)地變化(主要是硬度下降)的主要原因是相關(guān)水解酶降解細(xì)胞壁多糖和蛋白質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的改變[4]。在該過(guò)程中，涉及一系列的酶和調(diào)控因子，其中多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)起到關(guān)鍵作用[5]。在溶質(zhì)型桃果實(shí)中，PG活性及其基因PpPG的表達(dá)量均隨著果實(shí)的軟化而增加[6-7]，但在不溶質(zhì)桃中則維持在較低水平[8]。桃果實(shí)的溶質(zhì)及粘離核性狀受到2個(gè)串聯(lián)重復(fù)的PpPG基因控制，該基因座位于4號(hào)染色體[9-10]。

乙烯是植物五大激素之一，它在植物的種子萌發(fā)、葉片衰老、脫落到果實(shí)成熟等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中都起著重要的調(diào)節(jié)作用[11]。桃果實(shí)的成熟軟化尤其是PG基因的表達(dá)即受到乙烯誘導(dǎo)，因此，溶質(zhì)型桃果實(shí)成熟過(guò)程中存在一個(gè)呼吸躍變[12-13]，測(cè)量其乙烯釋放量是鑒定溶質(zhì)型和硬質(zhì)型肉質(zhì)的一種方法[14]。乙烯的生物合成則受2個(gè)關(guān)鍵酶ACS(ACC合成酶)和ACO(ACC氧化酶)的調(diào)控[15]。在硬質(zhì)型桃中，PpACS1基因的表達(dá)始終處于較低的水平，而溶質(zhì)型果實(shí)中PpACS1基因的表達(dá)隨著果實(shí)的成熟表達(dá)量迅速上升[16]。研究者發(fā)現(xiàn)，乙烯的合成與生長(zhǎng)素密切相關(guān)[17]。硬質(zhì)型桃不軟化的原因是其在成熟期IAA的合成受阻導(dǎo)致PpACS1轉(zhuǎn)錄受到抑制，乙烯不能正常釋放所致[18-19]。PpYUC11是調(diào)控桃果實(shí)成熟期 IAA合成的關(guān)鍵候選基因，導(dǎo)致了硬質(zhì)型和其他肉質(zhì)類(lèi)型桃果實(shí)成熟期乙烯釋放的差異[14]。

08-9-106和08-9-107是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所桃資源課題組通過(guò)雜交發(fā)現(xiàn)的2個(gè)優(yōu)系，表現(xiàn)為果肉質(zhì)地較硬、掛樹(shù)期長(zhǎng)。本研究以溶質(zhì)型桃大久保為對(duì)照，分析08-9-106和08-9-107桃果實(shí)成熟過(guò)程中果實(shí)硬度、中果皮和近核處果肉內(nèi)源乙烯及相關(guān)基因的表達(dá)變化，為探討桃果實(shí)成熟軟化進(jìn)程的分子調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試材

以國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)資源鄭州桃圃的大久保、08-9-106、08-9-107為試驗(yàn)材料。3份種質(zhì)的桃果實(shí)發(fā)育時(shí)期基本一致，約為108 d，在鄭州地區(qū)7月中旬成熟。從果實(shí)第2次膨大期(約果實(shí)成熟前20 d)之后開(kāi)始取樣，采樣時(shí)間分別為花后92 d(7月1日)、98 d(7月7日)、103 d(7月12日)和108 d(7月17日)。每次采摘10個(gè)大小和成熟度一致果實(shí)為試材，一部分樣品用于測(cè)定果實(shí)硬度，另一部分樣品進(jìn)行果肉取樣，分別取中果皮和近核處果肉(靠近內(nèi)果皮0.5 cm)，迅速用液氮冷凍，-80 ℃保存提取RNA備用。

在花后不同時(shí)期，采集果實(shí)單層放置于敞口保鮮盒內(nèi)，密封，室溫25 ℃，相對(duì)濕度70%。每次取12個(gè)大小和成熟度一致、果形端正的果實(shí)削去外果皮，取中果皮和近核處果肉為試材用于乙烯的測(cè)定。

1.2 硬度測(cè)定

果實(shí)硬度測(cè)定采用浙江托普儀器有限公司生產(chǎn)的水果硬度計(jì)(GY-4-J)，每次選取3個(gè)果實(shí)，削去果實(shí)縫合線(xiàn)兩側(cè)中部果皮測(cè)定果實(shí)的去皮硬度，每個(gè)樣品重復(fù)3次。取平均值作為每個(gè)樣品的去皮硬度，單位kg/cm2。

1.3 中果皮和近核處果肉乙烯釋放速率的測(cè)定

取4～6個(gè)桃果實(shí)的中果皮果肉置于密閉容器中，室溫密封2 h后抽取上層氣體測(cè)定乙烯含量，每個(gè)處理重復(fù)2次，每個(gè)重復(fù)測(cè)3次。以單位鮮質(zhì)量的果肉在單位時(shí)間內(nèi)釋放的乙烯量表示中果皮果肉的乙烯釋放速率，單位為nL/(g·h)。乙烯釋放量的測(cè)定采用島津(日本)GC-2010型氣相色譜儀。氣相色譜工作條件為：色譜柱：Rtx-1701(30 m×0.25 mm)，柱溫為50 ℃，載氣為氮?dú)?N2)，檢測(cè)器(FID)溫度200 ℃；進(jìn)樣口溫度200 ℃；氫氣流速40 mL/min，空氣流量400 mL/min，壓力100 kPa，尾吹氣流30 mL/min；柱流量3.0 mL/min，進(jìn)樣體積500 μL，分流比20。

近核處果肉乙烯釋放速率的測(cè)定：取近核處的寬0.5 cm、厚0.5 cm、長(zhǎng)3.0 cm大小的果肉，放入10 mL帶橡膠蓋的玻璃瓶中，密封室溫放置0.5 h，抽取0.5 mL氣體，用于乙烯含量檢測(cè)，每處理重復(fù)2次，其他步驟同中果皮的測(cè)定方法。

1.4 相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量表達(dá)分析

桃中果皮和近核處果肉的RNA提取采用多糖多酚植物RNA提取試劑盒(華越洋，北京)的方法進(jìn)行，提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，采用NANODROP 1000 核酸蛋白儀(美國(guó))檢測(cè)其濃度。RNA的反轉(zhuǎn)錄采用東洋紡反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO，東京)，操作均按各試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)桃已登錄序列采用NCBI中的Blast-primer程序分別設(shè)計(jì)Actin、PpACS1、PpACO1、PpYUC11、PpPG5個(gè)基因的特異引物序列(表1)，引物由金唯智(蘇州)生物科技有限公司合成。

熒光定量PCR反應(yīng)在LightCycler 480Ⅱ型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行，采用SYBR GreenⅠMaster 試劑盒(Roche，瑞士)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)總體積10 μL，包含100 ng cDNA 1 μL，2×Lightcycler 480 SYBR Green I Master 5 μL，1.0 μmol/L上下游引物各0.25 μL和無(wú)RNAase水3.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃，5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。試驗(yàn)結(jié)果用2-ΔΔCT公式分析計(jì)算[20]，以?xún)?nèi)參基因Actin的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算目的基因的表達(dá)量。

表1 RT-PCR所用引物Tab.1 Sequences of the primers used for RT-PCR

1.5 數(shù)據(jù)分析與作圖

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實(shí)肉質(zhì)及粘離核性狀表型評(píng)價(jià)

2.1.1 果實(shí)成熟后期中果皮果肉硬度的變化 由圖1-A可知，大久保桃果肉的硬度在成熟過(guò)程中迅速下降，硬度由花后92 d的11.53 kg/cm2下降至花后108 d的0.75 kg/cm2，下降幅度達(dá)到94%，果實(shí)軟化迅速；08-9-106果實(shí)硬度的下降趨勢(shì)與大久保類(lèi)似，由花后92 d的11.44 kg/cm2下降至花后108 d的1.31 kg/cm2，下降幅度為89%；08-9-107在果實(shí)成熟過(guò)程中硬度下降幅度小，由花后92 d的11.97 kg/cm2下降至花后108 d的9.73 kg/cm2。

圖1-B中從左到右依次為大久保、08-9-106和08-9-107。The accession in Fig.1-B from left to right was Okubo，08-9-106 and 08-9-107，respectively.

2.1.2 果實(shí)成熟后期果核外觀(guān) 由圖1-B的直接觀(guān)察可知，大久保和08-9-106的桃果肉與果核分離，屬于離核類(lèi)型；08-9-107的桃果肉與果核粘連，屬于粘核類(lèi)型。結(jié)合3份種質(zhì)果實(shí)成熟期的果肉硬度和果實(shí)橫切面觀(guān)察，判定大久保和08-9-106屬于離核溶質(zhì)類(lèi)型，08-9-107屬于粘核硬質(zhì)(或不溶質(zhì))類(lèi)型。

2.2 相關(guān)基因表達(dá)分析驗(yàn)證中果皮果肉硬度變化及粘離核性狀的形成

桃果實(shí)質(zhì)地的軟化以及粘離核性狀的形成主要是果肉組織細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)降解和成分改變?cè)斐傻?，涉及多種細(xì)胞壁降解酶和調(diào)控因子。為進(jìn)一步從分子水平驗(yàn)證3份桃種質(zhì)果肉硬度下降的原因，分析了桃果實(shí)成熟后期中果皮和近核處果肉PpPG基因的表達(dá)。

由于PpPG基因座存在2個(gè)高度相似的基因Ppa006839m和Ppa006857m，二者CDS序列僅存在5個(gè)SNP差異，因此本研究中設(shè)計(jì)了兼并引物，對(duì)這對(duì)PpPG基因進(jìn)行了表達(dá)分析。由圖2-A可知，在中果皮果肉中，桃大久保和08-9-106的PpPG基因表達(dá)較高，但峰值出現(xiàn)的時(shí)間存在差異，大久保為花后98～103 d，而08-9-106為花后103 d。在果實(shí)成熟后期，桃08-9-107的中果皮果肉中PpPG基因的表達(dá)始終維持在較低的水平。由圖2-B可知，在近核果肉處，桃大久保和08-9-106的PpPG基因表達(dá)規(guī)律與其在中果皮果肉類(lèi)似；而桃08-9-107近核果肉處的PpPG基因表達(dá)量依然較低。分析基因表達(dá)與表型的關(guān)系，證實(shí)PG基因的表達(dá)是導(dǎo)致3份種質(zhì)中果皮硬度變化和粘離核性狀形成的主要原因。

圖2 果實(shí)成熟過(guò)程中中果皮(A)和近核處果肉(B)PpPG基因的表達(dá)Fig.2 Expression of PpPG gene in mesocarp (A) and flesh near endocarp (B) during peach fruit ripening

2.3 乙烯釋放對(duì)中果皮果肉硬度和粘離核性狀的影響

PG基因的表達(dá)受到乙烯的誘導(dǎo)[14]，為了分析3份桃種質(zhì)果肉硬度變化及粘離性狀差異的原因，測(cè)定了桃果實(shí)成熟后期中果皮和近核處果肉的乙烯釋放速率(圖3)。由圖3-A可知，桃08-9-107中果皮果肉的乙烯釋放量在花后92～108 d維持在較低水平，乙烯釋放速率在0.54～7.22 nL/(g·h)變化。在2個(gè)溶質(zhì)桃類(lèi)型中，大久保中果皮果肉在花后92～103 d緩慢釋放乙烯，之后乙烯釋放速率增大，到花后108 d乙烯釋放速率達(dá)到42.26 nL/(g·h)，是花后92 d的15.31倍；而另外一個(gè)溶質(zhì)桃08-9-106的中果皮果肉乙烯釋放速率卻維持在極低的水平，花后92～108 d在0.26～2.20 nL/(g·h)波動(dòng)。該結(jié)果暗示，桃08-9-106中果皮果肉PG基因的表達(dá)變化和硬度的下降與其乙烯釋放無(wú)關(guān)。

由圖3-B可知，大久保近核處果肉花后92～108 d的乙烯釋放與中果皮類(lèi)似，均在果實(shí)成熟期有明顯釋放，與其離核性狀是一致的。同期，桃08-9-106和08-9-107近核處果肉的乙烯釋放速率較低。鑒于后2份種質(zhì)分別為離核和粘核，因此，乙烯釋放可能同樣不是08-9-106近核處果肉PG基因表達(dá)變化和離核的原因。

綜上，將大久保歸為響應(yīng)乙烯的離核溶質(zhì)類(lèi)型，08-9-107為響應(yīng)乙烯的粘核硬質(zhì)類(lèi)型，而08-9-106則為不響應(yīng)乙烯的離核溶質(zhì)類(lèi)型。

2.4 相關(guān)基因表達(dá)分析驗(yàn)證果實(shí)乙烯釋放速率的變化

2.4.1 不同桃種質(zhì)中果皮和近核處果肉中PpACS1基因的表達(dá) 為了探究08-9-106桃果實(shí)成熟后期乙烯合成較低的原因，分析了乙烯生物合成的關(guān)鍵基因ACS的表達(dá)，結(jié)果表明，PpACS1在桃大久保的花后92～98 d的中果皮和近核處果肉中均有較高表達(dá)，接近成熟表達(dá)量快速下降(圖4)，基因表達(dá)峰值位于乙烯釋放峰值之前；而桃08-9-106和08-9-107在果實(shí)成熟后期的中果皮和近核處果肉中PpACS1表達(dá)量極低(圖4)，與其無(wú)明顯乙烯釋放一致(圖3)。

圖3 桃果實(shí)成熟過(guò)程中中果皮(A)和近核處果肉(B)乙烯釋放速率的變化Fig.3 Changes in ethylene production in mesocarp (A) and flesh near endocarp (B) during peach fruit ripening

圖4 桃果實(shí)成熟過(guò)程中中果皮(A)和近核處果肉(B)PpACS1基因的表達(dá)Fig.4 Expression of PpACS1 gene in mesocarp (A) and flesh near endocarp (B)during peach fruit ripening

2.4.2 不同桃種質(zhì)中果皮和近核處果肉中PpACO1基因的表達(dá) ACO是調(diào)控乙烯生物合成的另外一個(gè)關(guān)鍵酶[21]。由圖5可知，基因PpACO1在桃大久保和08-9-106的花后103 d有表達(dá)峰值。然而，桃08-9-107在花后92～108 d同樣有一定程度的表達(dá)，整體維持在恒定的水平，且在大部分時(shí)期表達(dá)量高于大久保。在近核處果肉中，桃08-9-107的PpACO1基因表達(dá)在花后92～108 d持續(xù)升高，而同期桃大久保和08-9-106則表達(dá)量較低。結(jié)合3份桃種質(zhì)中果皮和近核處果肉乙烯的釋放可知，PpACO1基因的表達(dá)與乙烯的合成關(guān)系的相關(guān)性不強(qiáng)。

圖5 桃果實(shí)成熟過(guò)程中中果皮(A)和近核處果肉(B)PpACO1基因的表達(dá)Fig.5 Expression of PpACO1 gene in mesocarp (A) and flesh near endocarp (B)during peach fruit ripening

2.4.3 不同桃種質(zhì)中果皮和近核處果肉中PpYUC11基因的表達(dá)PpYUC11是生長(zhǎng)素合成的關(guān)鍵基因，在桃中通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素的合成影響乙烯的釋放。由圖6-A可以看出，在桃大久保中果皮中檢測(cè)到高表達(dá)的PpYUC11基因，而該基因在另外2份種質(zhì)08-9-106和08-9-107中果皮表達(dá)量較低。而在近核處果肉中，PpYUC11基因在3份種質(zhì)中的表達(dá)均隨著果實(shí)成熟而增加，整體表現(xiàn)為大久保峰值最高，08-9-107上升速率較快，而08-9-106峰值出現(xiàn)最晚。綜上所述，在中果皮果肉中，PpYUC11基因的表達(dá)與乙烯釋放速率一致；而在近核處果肉中，PpYUC11基因的表達(dá)與乙烯合成無(wú)明顯相關(guān)。

圖6 桃果實(shí)成熟過(guò)程中中果皮(A)和近核處果肉(B)PpYUC11基因的表達(dá)Fig.6 Expression of PpYUC11 gene in mesocarp (A) and flesh near endocarp (B) during peach fruit ripening

3 結(jié)論與討論

溶質(zhì)型桃果實(shí)屬于典型的呼吸躍變型，成熟過(guò)程中伴隨著內(nèi)源乙烯的顯著增長(zhǎng)，果肉硬度快速下降[22]。本研究分析了3份桃種質(zhì)果實(shí)成熟后期中果皮果肉硬度變化和粘離核性狀的形成，發(fā)現(xiàn)08-9-106中果皮果肉硬度在成熟后期迅速下降，這與其PpPG基因的高表達(dá)是一致的，因此將其歸為溶質(zhì)桃。然而，對(duì)乙烯釋放速率和乙烯合成相關(guān)基因的表達(dá)變化分析結(jié)果表明，PpPG基因不受乙烯的誘導(dǎo)，因此該種質(zhì)應(yīng)屬于不響應(yīng)乙烯的溶質(zhì)型桃，這與前人的結(jié)果存在較大差異[23]，有待后續(xù)研究。

PpACS1和PpACO1是桃乙烯合成的關(guān)鍵酶，而PpACS1是乙烯合成的關(guān)鍵限速酶，其表達(dá)對(duì)桃果實(shí)成熟過(guò)程中硬度的變化發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在桃大久保中果皮果肉中，PpACS1的表達(dá)量較高，且峰值出現(xiàn)在乙烯大量釋放之前，與前人研究結(jié)果[16]一致。然而，其PpACO1基因的表達(dá)量卻低于08-9-106，即該基因并不是本研究3份種質(zhì)乙烯合成的關(guān)鍵基因。過(guò)去報(bào)道硬質(zhì)桃在成熟時(shí)乙烯釋放量非常低，PpACS1不表達(dá)而PpACO1有較高表達(dá)量[24-25]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。說(shuō)明PpACS1是控制乙烯合成的主效基因[26]。

近年來(lái)的研究表明，PpYUC11基因可以通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素合成影響乙烯的釋放[7]，如Tatsuki等[24]研究發(fā)現(xiàn)，硬質(zhì)桃果實(shí)乙烯生物合成受阻的主要原因是PpACS1基因轉(zhuǎn)錄受抑制。進(jìn)一步分析表明[27-28]，成熟期PpYUC11的不表達(dá)導(dǎo)致了IAA合成受阻，影響乙烯不能正常釋放。在本研究中，同樣發(fā)現(xiàn)溶質(zhì)桃中果皮PpYUC11基因表達(dá)較高，與乙烯釋放速率相關(guān)。為此，本研究同時(shí)分析了其在近核處果肉中的表達(dá)變化，試圖揭示其與粘離核性狀形成的關(guān)系。然而發(fā)現(xiàn)在果實(shí)接近成熟期，乙烯釋放有顯著差異的大久保和08-9-107的PpYUC11基因表達(dá)卻存在明顯差異，因此，本研究認(rèn)為桃果實(shí)粘離核性狀的形成與乙烯釋放速率和PpACS1的表達(dá)有關(guān)，與PpACO1和PpYUC11無(wú)關(guān)。