檸條錦雞兒CkCDPK基因的克隆、表達(dá)分析及載體構(gòu)建

賈會麗，郭繼承，吳欣明，王運(yùn)琦，劉建寧，方志紅，石永紅，董寬虎

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801；3.北京綠京華園林工程有限公司，北京 102209)

在植物的整個生命周期中，缺水、高鹽和凍害成為限制其生長發(fā)育的重要環(huán)境因素。在長期的進(jìn)化過程中，植物為抵御這些非生物脅迫，形成了一系列特定、復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制[1]。當(dāng)植物受到非生物脅迫時，細(xì)胞壁可以保護(hù)細(xì)胞免受損傷和破壞，而細(xì)胞壁的主要組成部分是Ca2+。Ca2+作為第二信使，參與植物細(xì)胞骨架功能、體內(nèi)激素調(diào)控、礦物質(zhì)離子吸收等[2-3]。鈣依賴蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases，CDPKs)是植物中特有的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以參與植物激素的信號傳導(dǎo)和代謝，介導(dǎo)植物對逆境的響應(yīng)[4]，參與細(xì)胞骨架的調(diào)控、生長發(fā)育以及碳氮代謝等[5]。CDPKs是植物中研究較多的一類蛋白激酶，目前已經(jīng)在模式植物如擬南芥、煙草，雙子葉植物如大豆、陸地棉等，單子葉植物如水稻、小麥、玉米、黃瓜、白羊草等均有發(fā)現(xiàn)[6-11]。非生物脅迫、生物脅迫、激素等不良因素都可以誘導(dǎo)CDPKs基因的表達(dá)。AtCDPK1基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，過表達(dá)植株具有明顯的抗干旱和耐鹽性[12]；OsCDPK在水稻中的過表達(dá)可以增強(qiáng)水稻對鹽脅迫的耐受性[13]，在高粱中過表達(dá)能提高高粱對病害的耐受性[14]，過表達(dá)天山雪蓮SikCDPK1基因可以提高轉(zhuǎn)基因煙草對低溫的耐受性[15]。CDPK類基因除參與非生物脅迫途徑，還參與多個ABA信號通路[16]，啟動相關(guān)基因的表達(dá)、維持細(xì)胞內(nèi)離子的動態(tài)平衡、保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，最終緩解脅迫對植物造成的影響，從而提高植物對高鹽和干旱脅迫的耐受性[17]。

檸條錦雞兒(Caraganakorshinskii)是錦雞兒屬多年生灌木，根系龐大，耐貧瘠[18]，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值和生態(tài)價值[19]，可用作飼料、工業(yè)原料以及再造林物種等[20]。多生長于半固定和固定沙地，適應(yīng)性廣，耐鹽堿、抗干旱能力強(qiáng)[21]。在基因水平解析檸條錦雞兒的抗逆性機(jī)制有助于更好地了解該物種。因此，對其抗逆相關(guān)基因開展挖掘和功能研究具有非常重要的意義。

本試驗以檸條錦雞兒為材料，成功克隆出一個CDPK基因，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并研究在鹽、干旱脅迫以及外源ABA誘導(dǎo)下CkCDPK基因的表達(dá)模式，同時構(gòu)建植物超表達(dá)載體，旨在為后期研究CkCDPK基因的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗中所用到的檸條錦雞兒種子來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草資源研究室。DL2000、DL15000 Markers、DNA聚合酶 ExTaq酶、限制性內(nèi)切酶BglⅡ、BsteⅡ、T4DNA 連接酶、pMD19-T 載體、SMARTer RACE cDNA Amplification Kit、In-Fusion HD Cloning Kit 均購自 TaKaRa 公司(Japan)； RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas(USA)；RNA提取采用TRIzol，購自Invitrogen(USA)；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞EscherichiacoliDH5α購自北京天根生化科技有限公司。試驗中所用到試劑藥品除ABA購自 Sigma(USA)外，其余藥品如氯仿、PEG6000、異丙醇、乙醇、NaCl 等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 檸條錦雞兒的種植與處理 2016年11月-2017年11月，挑選飽滿的檸條錦雞兒種子，用氯氣消毒 24 h后，將種子均勻擺放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，放置于光照培養(yǎng)箱(溫度 24 ℃，14 h 光照/10 h黑暗)中發(fā)芽。待長出 2 葉后將種子移至花盆(基質(zhì)為營養(yǎng)土∶蛭石∶珍珠巖比例為 3∶1∶1)中繼續(xù)生長 30 d。取生長30 d的檸條錦雞兒新鮮葉片0.1 g，在液氮中速凍，用TRzol法提取葉片總RNA，用于檸條錦雞兒 CDPK基因的克隆。各脅迫試驗前期均做預(yù)試驗篩選出最佳脅迫濃度，即 PEG 濃度為 20%，NaCl 濃度為 250 mmol/L，外源 ABA 濃度為 0.1 mmol/L。選取植株大小基本一致的檸條錦雞兒幼苗進(jìn)行外源ABA 脅迫、PEG 模擬干旱和 NaCl 模擬鹽脅迫。其中，每個脅迫用苗 5 株，重復(fù) 3 次。具體脅迫方法如下：ABA 脅迫：配制含有0.1 mmol/L ABA 的 1/2 MS 營養(yǎng)液，將檸條錦雞兒幼苗根系置于其中，脅迫0，2，4，6，8，12，24 h；干旱脅迫：配制含有 20% PEG 6000 的 1/2 MS 營養(yǎng)液，將檸條錦雞兒幼苗根系置于其中，脅迫0，2，4，6，8，12，24 h；高鹽脅迫：配制含有 250 mmol/L NaCl 的 1/2 MS 營養(yǎng)液，將檸條錦雞兒幼苗根系置于其中，脅迫 0，2，4，6，8，12，24 h。分別取以上各處理和不同脅迫時間下的檸條錦雞兒新鮮葉片0.1 g，在液氮中速凍，用TRIzol法提取RNA，用于定量PCR試驗。所有提取的RNA均經(jīng)過濃度和純度檢測，檢測合格后用于后續(xù)PCR試驗。

1.2.2 檸條錦雞兒CDPK基因的克隆與生物信息學(xué)分析 用 1.2.1 中提取到的檸條錦雞兒葉片總 RNA，參照 RevertAidTMFirstStrand cDNA Asynthesis Kit 說明書，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序得到的類CDPK基因序列片段，用 Primer Premier 5.0 分別設(shè)計 5′ RACE和 3′ RACE 的特異性引物GSP1和GSP2(表1)，進(jìn)行RACE-PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共 27個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后72℃延伸5 min。將得到的PCR產(chǎn)物在 1% 瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行檢測后回收，連接PMD19-T載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆送上海英駿公司進(jìn)行測序，分別得到3′ 端和5′ 端序列，用測序正確序列拼接出檸條錦雞兒CDPK的全長cDNA序列。

用 DNAStar軟件結(jié)合NCBI BlastP，對得到的檸條錦雞兒CDPK基因序列進(jìn)行分析，查找開放閱讀框ORF序列，基因的功能位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)域。通過DNAMAN 6.0進(jìn)行多序列比對分析。在NCBI上搜索下載擬南芥CDPK同源蛋白序列，利用MEGA 6.0軟件的Neighbor-Joning法進(jìn)行蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析[22]。

表1 試驗中的引物序列Tab.1 Primer used in the study

注：表中下劃線表示BglⅡ和BsteⅡ限制性酶切位點(diǎn)。

Note：Underlined nucleotides indicate theBglⅡandBsteⅡ restriction site.

1.2.3 不同逆境脅迫下檸條錦雞兒CDPK基因的表達(dá)特性 用 1.2.1 提取到的不同脅迫處理下的 RNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。以檸條錦雞兒ACT2基因為內(nèi)參基因，引物為F1/R1。參考 SYBR Premix ExTaq的定量PCR引物設(shè)計原則，根據(jù)得到的檸條錦雞兒CDPK基因 ORF 序列設(shè)計實時熒光定量 PCR 引物F2/R2，用 ABI 7500 熒光定量 PCR 儀(ABI，USA)，采用2步法進(jìn)行 Real-time PCR 擴(kuò)增：第 1步，95 ℃預(yù)變性 30 s；第 2 步，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共 40個循環(huán)，每個反應(yīng)重復(fù) 3 次。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)得到的 Ct 值，將每種處理的 0 h 設(shè)為對照，利用 2-ΔΔct法[23]，分別計算檸條錦雞兒CDPK基因在外源 ABA、PEG 以及 NaCl 脅迫下不同時間的表達(dá)量。

1.2.4 植物雙元表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)pCAMBIA3301 植物超表達(dá)載體上的酶切位點(diǎn)和目的基因所用限制性內(nèi)切酶，在檸條錦雞兒CDPK基因的開放閱讀框5′ 端添加BglⅡ限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，3′ 端添加BsteⅡ限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。以檸條錦雞兒cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有BglⅡ/BsteⅡ酶切位點(diǎn)的產(chǎn)物。用BglⅡ/BsteⅡ雙酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA3301。將二者產(chǎn)物用T4DNA 連接酶進(jìn)行連接，得到插入有檸條錦雞兒CDPK基因的植物超表達(dá)載體(圖1)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆送上海英駿公司測序，篩選得到測序正確的pCAMBIA3301-CkCDPK重組質(zhì)粒用于后續(xù)試驗[24]。

試驗中所用到的所有引物用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，引物序列如表1所示。

圖1 pCAMBIA3301-CkCDPK植物超表達(dá)載體構(gòu)建Fig.1 Sketch map of over-expression vector of pCAMBIA3301-CkCDPK

2 結(jié)果與分析

2.1 檸條錦雞兒CDPK基因的克隆

本研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序得到的長為300 bp的類CDPK基因片段，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，利用RACE-PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到5′端長度為1 500 bp(圖2-A)，3′端長度為800 bp的序列(圖2-B)。利用DNAMAN 6.0軟件將得到的序列進(jìn)行拼接，獲得長為1 800 bp的序列。在拼接的全長序列上設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1 700 bp左右的開放閱讀框序列(圖2-C)。

A.檸條錦雞兒CkCDPK5′RACE電泳圖；B.檸條錦雞兒CkCDPK3′RACE電泳圖；C.檸條錦雞兒CkCDPKORF電泳圖；D.植物超表達(dá)載體pCAMBIA3301-CkCDPK酶切鑒定圖；M.DNA Marker 2000。

A.Electrophoresis result ofCkCDPK5′RACE; B.Electrophoresis result ofCkCDPK3′RACE; C.The fragment ofCkCDPKORF;D.Enzyme digestion of over-expression vector pCAMBIA3301-CkCDPKbyBglⅡ/BsteⅡ;M.DNA Marker 2000.

圖2 檸條錦雞兒CkCDPK電泳條帶及載體酶切鑒定結(jié)果
Fig.2 PCR results ofCkCDPKandconstructed vector enzyme digestion

2.2 檸條錦雞兒CDPK基因的生物信息學(xué)分析

用DNAStar軟件對所得到的目的基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該序列含有1個1 710 bp的完整開放閱讀框(圖2-C)，編碼570個氨基酸。序列分析結(jié)果表明，該序列編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為64.03 ku，理論等電點(diǎn)(PI)為 9.12。氨基酸分析結(jié)果顯示，包含90個強(qiáng)堿性氨基酸(K、R)，77 個強(qiáng)酸性氨基酸(D、E)，188個疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)，141個極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)。利用NCBI的BlastP對該基因的蛋白序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，包含有典型的N端可變區(qū)、蛋白激酶區(qū)以及EF手型結(jié)構(gòu)域。其中蛋白激酶區(qū)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域中包含30個活性位點(diǎn)，18個ATP結(jié)合位點(diǎn)，14個多肽底物結(jié)合位點(diǎn)，14個活化環(huán)；EF手型結(jié)構(gòu)域包含4個EF手型結(jié)構(gòu)域和8個Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，其中每個手型結(jié)構(gòu)域有36個氨基酸序列(圖3)。

將該序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對，從NCBI網(wǎng)站上下載鷹嘴豆(Cicerarietinum)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、大豆(Glycinemax)等 8 個物種的CDPK蛋白序列，用DNAMAN 6.0 將所得到的目的基因序列與它們進(jìn)行多序列比對，結(jié)果顯示，與這幾個物種的CDPK基因高度同源，蛋白序列相似度分別達(dá)到 77.19%，77.02% 和 75.75%(圖 4)。以上結(jié)果說明，所獲得的目的基因序列是一個CDPK類基因，將其命名為CkCDPK。

箭頭之前的序列為N端可變區(qū)；中間方框中的序列為蛋白激酶結(jié)構(gòu)域；加粗的方框為4個EF手型結(jié)構(gòu)域；三角形為8個Ca2+結(jié)合位點(diǎn)。The previous sequence of the arrows is the N-terminal variable region;The sequence in the middle box is the serine/threonine kinases domain;The bold box is three EF-hand domains;Triangles are eight Ca2+ binding sites.

Ck.檸條錦雞兒；Gh.陸地棉；Ca.鷹嘴豆；Nt.煙草；Gm.大豆；Ca.黃瓜；Mt.蒺藜苜蓿；La.羽扇豆；Va.紅豆。

從NCBI上獲得擬南芥CDPK基因家族，共 34 個，分為四大類。將CkCDPK與擬南芥CDPK基因家族進(jìn)行聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其與擬南芥第 Ⅳ 亞族CDPK28聚為一類(圖5)，該蛋白可能具有與擬南芥第 Ⅳ 亞族CDPK28相似的功能。

圖5 擬南芥CDPK家族DNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of CDPK DNA in Arabidopsis thaliana

2.3 逆境脅迫下檸條錦雞兒CkCDPK基因的表達(dá)分析

為了檢測CkCDPK基因在非生物脅迫下的表達(dá)量，利用qRT-PCR對檸條錦雞兒CkCDPK基因在鹽脅迫和干旱脅迫以及外源ABA誘導(dǎo)下的表達(dá)量進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，鹽脅迫和干旱脅迫均能誘導(dǎo)檸條錦雞兒CkCDPK基因的增強(qiáng)表達(dá)，2種脅迫誘導(dǎo)下CkCDPK基因的表達(dá)量變化基本呈拋物線趨勢。NaCl脅迫下，隨脅迫時間的延長，CkCDPK基因的表達(dá)量逐漸上升，在脅迫 6 h 時表達(dá)量達(dá)最大，為對照的 7.6 倍，隨后表達(dá)量逐漸下降(圖6-A)。干旱脅迫下，在脅迫 4 h 時表達(dá)量最大，為對照的 3.43 倍，隨后表達(dá)量逐漸下降(圖6-B)。外源ABA也能明顯誘導(dǎo)CkCDPK基因的表達(dá)，從圖6-C可以看出，隨誘導(dǎo)時間的變化CkCDPK表達(dá)量逐漸上升且呈雙峰趨勢，分別在脅迫6，24 h時表達(dá)量達(dá)到最大，分別為對照的 7.9，9.8 倍。所有脅迫下，CkCDPK基因的表達(dá)量均高于對照。

圖中不同小寫字母代表顯著性差異(P<0.05)。A.250 mol/L NaCl處理；B.15% PEG處理；C.外源ABA處理。Different lowercase letters represent significant differences(P<0.05).A.250 mmol/L NaCl treatment; B.15% PEG treatment; C.ABA treatment.

2.4 檸條錦雞兒CkCDPK植物超表達(dá)載體的構(gòu)建

本研究用限制性內(nèi)切酶BglⅡ/BsteⅡ分別酶切植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA3301和檸條錦雞兒CkCDPK基因開放閱讀框ORF序列，用T4連接酶進(jìn)行連接。挑選陽性克隆進(jìn)行測序檢測，選用測序結(jié)果無缺失、無突變的pCAMBIA3301-CkCDPK重組質(zhì)粒進(jìn)行應(yīng)用。將得到的重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和BsteⅡ進(jìn)行雙酶切檢測驗證，獲得2個條帶，其中上面條帶是pCAMBIA3301質(zhì)粒條帶，下面 1 710 bp左右的條帶是檸條錦雞兒CkCDPK基(圖2-D)。結(jié)果表明，CkCDPK基因已經(jīng)成功插入到pCAMBIA3301植物表達(dá)載體中。用NptⅡ基因引物和pCAMBIA3301載體引物進(jìn)行PCR檢測(圖7)，均獲得與預(yù)測大小相符的條帶，證明 pCAMBIA3301-CkCDPK超表達(dá)載體構(gòu)建成功，可用于后續(xù)CkCDPK基因功能驗證試驗中。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘸花法將構(gòu)建好的pCAMBIA3301-CkCDPK導(dǎo)入模式植物擬南芥中進(jìn)行超量表達(dá)。

M.Marker 2000。

3 結(jié)論與討論

鈣依賴蛋白激酶從N端到C端具有可變區(qū)、催化區(qū)、連接區(qū)和調(diào)控區(qū)4個典型的結(jié)構(gòu)域。每個結(jié)構(gòu)域的氨基酸數(shù)量、同源性和功能都不同。其中，催化區(qū)和連接區(qū)同源性都比較高，催化區(qū)又稱蛋白激酶區(qū)，具有典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶保守序列。連接區(qū)也有很重要的功能，當(dāng)缺乏Ca2+時，連接區(qū)可能會與催化區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致蛋白激酶活性被抑制。調(diào)控區(qū)是CDPK基因區(qū)別于其他激酶特有的區(qū)域，具有與鈣離子結(jié)合的EF手型結(jié)構(gòu)[25]。本研究對獲得的CkCDPK基因序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，該序列包含有典型的N端可變區(qū)、蛋白激酶區(qū)以及 EF 手型結(jié)構(gòu)域。其中，蛋白激酶區(qū)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域中包含 30 個活性位點(diǎn)，18 個ATP結(jié)合位點(diǎn)，14 個多肽底物結(jié)合位點(diǎn)，14 個活化環(huán)；EF手型結(jié)構(gòu)域包含 4 個EF手型結(jié)構(gòu)和 8 個Ca2+結(jié)合位點(diǎn)。CkCDPK基因序列結(jié)構(gòu)與二穗短柄草、天山雪蓮、陸地棉、花生等結(jié)構(gòu)相似[26-29]，可能會參與檸條錦雞的逆境調(diào)控。

鈣在植物的生長發(fā)育和生理代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。Ca2+在植物體內(nèi)的作用方式有2種，第1種是以游離的形式參與植物的生理過程，如缺鈣會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)不能進(jìn)行正常的有絲分裂，抑制頂芽或根毛的生長；鈣離子會促進(jìn)碳水化合物的代謝，提高植物對鉀離子的吸收等[30]。第2種作用方式是細(xì)胞質(zhì)里的Ca2+作為植物體內(nèi)一些酶的組分和活化劑，如與鈣調(diào)素或鈣依賴型蛋白激酶(CDPK)相結(jié)合而起作用[31]。當(dāng)植物遭受外界非生物脅迫時，會導(dǎo)致氣孔關(guān)閉，引起細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高，在這個過程中將鈣信號傳遞給下游的便是CDPKs。因此，CDPKs在 Ca2+介導(dǎo)的信號傳遞路徑中扮演著關(guān)鍵角色，對植物感受鈣信號和傳遞鈣信號起關(guān)鍵作用[32]。CDPKs參與調(diào)控 ABA信號對外界脅迫的反應(yīng)[33]，如擬南芥CDPK4能磷酸化ABA信號途徑中的Atlpk2β基因，提高轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)一系列ABA應(yīng)答基因的表達(dá)[34]。CDPKs通過激活或誘導(dǎo)下游脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，來參與植物體內(nèi)的熱脅迫[35]、鹽脅迫、低溫脅迫、光脅迫[36]等逆境脅迫。如水稻OsCPK12通過激活OsAPX2/OsAPX8的表達(dá)，抑制NADPH氧化酶基因，提高對鹽的抗逆反應(yīng)[33]。

本研究測定了鹽、干旱和外源ABA誘導(dǎo)下CkCDPK的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各脅迫均能誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，說明CkCDPK參與了檸條錦雞兒的逆境調(diào)控，但CkCDPK是通過與Ca2+結(jié)合還是激活或誘導(dǎo)下游相關(guān)基因的表達(dá)來參與檸條錦雞兒的逆境脅迫，還有待進(jìn)一步研究。后期筆者將對CkCDPK基因增強(qiáng)表達(dá)的擬南芥株系進(jìn)行抗逆性評價，進(jìn)一步揭示CkCDPK基因在植物抗逆性調(diào)控中的生物學(xué)功能。同時繼續(xù)篩選檸條錦雞兒體內(nèi)其他CDPK類基因，研究它們在逆境脅迫中的作用，并進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，期望進(jìn)一步揭示檸條錦雞兒CDPK基因在非生物逆境脅迫中的調(diào)控作用。