草莓FvARF5基因的克隆、生物信息學(xué)及表達分析

蘇麗艷

(西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院 秦嶺野生觀賞植物研究中心，陜西 西安 710065)

草莓(Fragariavesca)屬于薔薇科草莓屬，果實富含多種維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，植株易栽培、繁殖快、成本低及收益高等特點成為我國果業(yè)和設(shè)施農(nóng)業(yè)的新興產(chǎn)業(yè)。草莓果實是由子房進一步膨大而形成[1]。植物激素分泌異常對于果實的生長發(fā)育有重要的影響，如生長素分泌過多則引起草莓花芽分化異常，并最終導(dǎo)致草莓畸形果的形成[2-3]。因此，了解生長素在草莓果實發(fā)育的功能對于通過分子育種手段培養(yǎng)優(yōu)良的草莓品種具有重要的指導(dǎo)意義。

生長素響應(yīng)因子(Auxin response factor，ARF)是生長素信號途徑的重要組成部分之一，能夠與生長素響應(yīng)基因的啟動子區(qū)結(jié)合，從而特異性地調(diào)節(jié)下游基因的表達，在生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中有著重要作用[4-5]。ARF家族基因存在于大多數(shù)植物體內(nèi)，目前已經(jīng)在擬南芥[6]、甜橙[7]、葡萄[8]、香蕉[9]、番茄[10]等多種植物中得到鑒定和分離，ARF家族基因?qū)χ参锏亩鄠€生長發(fā)育過程均有調(diào)控作用[11-15]。

ARF5是ARF家族中的一員，研究表明，擬南芥ARF5/MONOPTEROS(MP)功能缺失可以導(dǎo)致其胚胎和幼苗發(fā)育缺陷，擬南芥ARF5/MP基因功能喪失的突變體植株因無法形成根尖而導(dǎo)致胚胎死亡[16-18]，近期研究表明，ARF5/MP通過調(diào)控靶基因細(xì)胞分裂素響應(yīng)因子2(Cytokinin response factor 2，CRF2)和莖端分生組織特異性調(diào)控因子(Shoot meristemless，STM)進而調(diào)控擬南芥芽組織的形成[19]，且擬南芥ARF5基因可通過影響軸向極性調(diào)控葉片和莖的發(fā)育[20]。番茄中，抑制表達SlARF5基因?qū)е路褑涡越Y(jié)實，并通過調(diào)控生長素/赤霉素信號通路中的關(guān)鍵因子調(diào)控細(xì)胞的分裂及膨大過程，進而影響番茄果實的大小，ARF5可能是生長素-赤霉素互作調(diào)控果實發(fā)育網(wǎng)絡(luò)中的一個關(guān)鍵調(diào)控因子[21]。然而，草莓中ARF家族基因功能研究較少，草莓ARF5基因的功能尚不清楚。

本研究根據(jù)草莓基因組數(shù)據(jù)庫信息中草莓ARF5的ORF序列設(shè)計特異性引物，克隆了FvARF5基因編碼區(qū)全長。利用生物信息學(xué)軟件分析基因的結(jié)構(gòu)域及序列特征，并利用MEGA 5.0軟件將草莓FvARF5與其他物種的ARF家族基因氨基酸序列進行了聚類分析。同時，采用熒光定量PCR技術(shù)分析了FvARF5在草莓不同組織中表達水平及其對外源激素處理的應(yīng)答情況，為進一步分析FvARF5蛋白在草莓生長發(fā)育過程中的功能奠定基礎(chǔ)，為將來利用分子手段進行草莓品種改良提供基因儲備。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

供試草莓材料為豐香，由西安市農(nóng)業(yè)中心草莓研究所提供。取旺盛生長期植株的不同組織，包括根、莖、葉、當(dāng)天開放的花朵、綠果、1/2紅果及全紅果，液氮冷凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱。

本研究中所用的分子試劑，高保真聚合酶、FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)試劑盒購自羅氏公司；去多糖多酚RNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑、DNA分子量標(biāo)記購自北京天根生化科技有限公司；載體購自TaKaRa; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas; 其他試劑購自上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 外源激素處理草莓方法

草莓幼苗長至第5～6片葉完全展開后，取地上部分分別置于蒸餾水、IAA(50 mg/L)、GA(10 mg/L)、ABA(100 μmol/L)溶液中，于25 ℃、光照強度200 μmol/(m2·s)條件下培養(yǎng)。分別于處理后0，1，6，12，24 h取材。3個生物學(xué)重復(fù)。試材液氮冷凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.3 基因序列分析

利用DNAMAN對不同植物基因的氨基酸序列進行同源性比對；利用在線軟件ProtParam進行蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和等電點分析；利用Cello(http：//cello.life.nctu.edu.tw/)進行FvARF5蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測；利用plantCARE進行啟動子序列分析；利用MEGA 5.0軟件進行系統(tǒng)進化樹分析，并生成報告圖形。

1.4 果實RNA提取和FvARF5基因克隆

利用去多糖多酚RNA提取試劑盒(北京天根)和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)提取草莓不同組織樣品RNA，并合成第一鏈cDNA，具體方法參照盒內(nèi)說明書。利用Primer 5.0設(shè)計草莓FvARF5基因ORF序列特異性擴增引物(表1)。目標(biāo)基因FvARF5的擴增體系為20 μL，包括5×Buffer 4 μL，2 μL dNTP(2.5 mmol/L)，上下游引物各0.5 μL(10 mmol/L)，1 μL cDNA。程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 高溫變性 30 s，58 ℃ 低溫退火 30 s，72 ℃中溫延伸2 min，35次循環(huán)； 72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對目標(biāo)片段回收純化后，連接T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽性克隆子后送上海生工測序。

1.5 FvARF5基因的表達分析

以上述cDNA為模板，以18S rRNA為內(nèi)參，采用RT-PCR方法對其進行表達分析。操作步驟按照羅氏熒光定量試劑盒(FastStart Universal SYBR Green Master)說明書進行。反應(yīng)體系為：總體積20 μL，包括10 μL SYBR premix，1 μL cDNA(質(zhì)量濃度 30 ng/μL)，上下游引物(序列見表2)各1 μL(濃度10 μmol/L)，ddH2O 7 μL。qPCR試驗程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40循環(huán)；cDNA樣品均3次生物樣本重復(fù)。溶解曲線及試驗結(jié)果分析參照蘇麗艷等[22]。

表1 引物序列Tab.1 The sequences of the primers

2 結(jié)果與分析

2.1 FvARF5基因的克隆

以提取的草莓葉片RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，利用PCR對草莓的FvARF5基因全長序列進行克隆，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。獲得約為2 700 bp的片段(圖1)，將目標(biāo)帶回收純化后連接pMD-19T載體后提取質(zhì)粒測序檢測，結(jié)果與GenBank上公布的草莓ARF5基因序列(XP_004291385.1)一致。該基因開放閱讀框為2 745 bp，編碼914個氨基酸，命名為FvARF5。

1.FvARF5基因 PCR擴增結(jié)果；M.分子量標(biāo)準(zhǔn)。1.PCR products of FvARF5 gene; M.The molecular weight standard.

2.2 FvARF5蛋白生物信息學(xué)分析

2.2.1 FvARF5蛋白理化性質(zhì)分析 ProtParam分析得知，F(xiàn)vARF5由914個氨基酸組成，分子式為C4395H6887N1217O1400S46，分子質(zhì)量為100.65 ku，理論等電點為5.25，不穩(wěn)定系數(shù)為58.40，系不穩(wěn)定蛋白。該基因編碼的多肽中蘇氨酸(Ser)含量最高，約為12%，其次是賴氨酸(Leu)，占總氨基酸的10.2%。其總疏水平均系數(shù)(GRAVY)為-0.397，親水性氨基酸比例較高，與ProtScale分析結(jié)果具有一致性，可知FvARF5蛋白為親水性蛋白(圖2)。

圖2 FvARF5基因編碼蛋白的親疏水性預(yù)測Fig.2 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of FvARF5 gene coding protein

2.2.2 FvARF5蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測及啟動子序列分析 Cello分析結(jié)果表明，F(xiàn)vARF5蛋白定位于細(xì)胞核(表2)，這與作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用一致。啟動子序列分析表明(表3)，F(xiàn)vARF5含有多種激素及脅迫響應(yīng)功能元件，如生長素、赤霉素、脫落酸、茉莉酸、水楊酸誘導(dǎo)響應(yīng)、熱脅迫、低溫、干旱脅迫、低氧、光響應(yīng)、真菌脅迫響應(yīng)元件等。

表2 FvARF5蛋白的亞細(xì)胞定位分析Tab.2 Subcellular localization analysis of FvARF5 protein

表3 FvARF5啟動子順式作用元件分析Tab.3 The cis-elements in the promoter of FvARF5

2.2.3 FvARF5氨基酸序列及聚類分析 通過NCBI的CDD在線預(yù)測表明，草莓FvARF5具有生長素響應(yīng)因子特有的保守結(jié)構(gòu)域，即B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和生長素響應(yīng)因子保守結(jié)構(gòu)域，分別位于開放閱讀框的145-247和277-354。利用DNAman軟件將草莓FvARF5與川桑(XP_010095167.1)、番茄(NP_001234545.1)、核桃(XP_018807020.1)、黃瓜(XP_004147836.1)、可可(XP_017981253.1)、梨(XP_018498243.1)、榴蓮(XP_022769143.1)、麻風(fēng)樹(XP_012073833.1)、木豆(XP_020233090.1)、擬南芥(NP_173414.1)、蘋果(XP_008387956.1)、葡萄(XP_003634382.2)、栓皮櫟(XP_023900074.1)、桃(XP_020414821.1)、錦葵(XP_021285434.1)、杏(AVD68943.1)、櫻桃(XP_021831015.1)、月季(XP_024166617.1)、棗(XP_015884813.1)進行氨基酸序列比對分析。結(jié)果表明，不同物種間的ARF5結(jié)構(gòu)域具有高度相似性(圖3)。家族系統(tǒng)進化關(guān)系分析表明，草莓FvARF5基因與薔薇科月季ARF5基因的進化關(guān)系最近，相似度達95%(圖4)。

保守結(jié)構(gòu)域黑色線標(biāo)記。單行線標(biāo)記為B3 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，雙行線為生長素響應(yīng)因子保守結(jié)構(gòu)域。The conserved domains were marked by black lines. Single line was B3 DNA binding domain and double line was auxin response factor conserved domain.

圖4 草莓FvARF5系統(tǒng)進化關(guān)系分析Fig.4 The phylogenetic relationships of FvARF5 from various organism

2.3 FvARF5基因在草莓不同組織中的表達分析

通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)vARF5在草莓各組織中均有表達，但相對表達量存在顯著性差異，其在莖中表達量最高，其次是綠果期(圖5)。推測FvARF5基因在草莓發(fā)育不同時期及不同組織中有不同的調(diào)控功能。

2.4 FvARF5基因?qū)ν庠醇に貞?yīng)答分析

利用熒光定量PCR分析FvARF5在IAA、GA和ABA誘導(dǎo)下的表達模式。與對照組相比，F(xiàn)vARF5在IAA處理1 h后，表達量迅速提高并達到頂峰，而后恢復(fù)正常水平(圖6-A)；GA處理草莓植株1～6 h后，F(xiàn)vARF5的表達水平明顯增強，而后其表達量恢復(fù)對照水平(圖6-B)；FvARF5基因?qū)BA處理應(yīng)答較弱(圖6-C)。

不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。圖6同。Different small letters show significantly different at 0.05. The same as Fig.6.

3 結(jié)論與討論

本研究對草莓FvARF5基因進行克隆，得到2 745 bp、編碼914個氨基酸的基因序列。對FvARF5基因編碼的氨基酸序列分析表明，草莓FvARF5與薔薇科月季ARF5基因的進化關(guān)系最近，相似度達95%，且具有生長素響應(yīng)因子典型的B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和生長素響應(yīng)因子保守結(jié)構(gòu)域。對FvARF5基因編碼的蛋白理化性質(zhì)分析表明，該蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白，分子質(zhì)量為100.65 ku，理論等電點為5.25。亞細(xì)胞定位預(yù)測FvARF5蛋白定位于細(xì)胞核，啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)FvARF5具有生長素、赤霉素、脫落酸、茉莉酸甲酯、水楊酸等多種激素及脅迫響應(yīng)功能元件。

ARF家族基因為多基因家族，各成員之間的功能不同[23-26]。因此，研究FvARF5在不同組織中的表達情況對于其功能的挖掘有重要意義。組織特異性表達分析顯示，F(xiàn)vARF5在草莓不同組織中均有表達但表達量存在顯著差異，其在莖和綠果中表達較高，預(yù)示著FvARF5基因可能對草莓莖和果實的發(fā)育有重要調(diào)控作用。如前所述，在擬南芥和番茄中的研究表明，ARF5(MP)基因?qū)τ谛律o芽形成、果實的發(fā)育及坐果具有重要的調(diào)控作用，而本研究中，草莓FvARF5基因?qū)τ谥参锛に厣L素及赤霉素的誘導(dǎo)有顯著性應(yīng)答，說明FvARF5基因可能通過參與生長素和赤霉素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程參與草莓的生長發(fā)育調(diào)控過程，這與前人研究中番茄SlARF5基因通過介導(dǎo)生長素和赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控番茄的果實坐果及果實發(fā)育過程結(jié)果具有一致性[21]。番茄屬于呼吸躍變型果實，而草莓屬于呼吸非躍變型果實，因此，關(guān)于FvARF5在草莓生長發(fā)育過程中的功能還有待于進一步分析驗證。

ARF家族基因?qū)τ诠麑嵉纳L發(fā)育有重要的調(diào)控過程，本研究為進一步揭示FvARF5的功能及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。下一步的工作中，將通過轉(zhuǎn)基因直接驗證草莓FvARF5基因調(diào)控草莓果實發(fā)育的相關(guān)功能，為將來在分子水平上解析生長素調(diào)控草莓果實發(fā)育及其與其他植物激素互作調(diào)控果實發(fā)育的網(wǎng)絡(luò)機制提供理論基礎(chǔ)。