復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠的研制及其療效觀察

孫淑彥，顧永衛(wèi)，楊 盟，劉繼勇,唐 震*

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院口腔科，上海 200433;2.海軍軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院藥劑科，上海 200011)

口腔潰瘍是口腔科常見的一類疾病，看似不嚴(yán)重，卻給病人生活帶來了極大的不便，嚴(yán)重影響到病人正常的說話、飲食。復(fù)方硫酸新霉素口腔潰瘍涂膜是海軍軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院的自制藥品，用于治療各類口腔潰瘍，其臨床應(yīng)用已有20多年，療效確切。但復(fù)方硫酸新霉素口腔潰瘍涂膜在臨床應(yīng)用過程中存在給藥不便，易被迅速清除，藥效無法長時間維持等問題，限制了其在長效給藥方面的應(yīng)用，因而現(xiàn)已停止生產(chǎn)使用。作者保留原涂膜主要有效成分，改變其劑型，研制了復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠，并應(yīng)用于大鼠創(chuàng)傷性口腔潰瘍模型對其療效進行驗證，為臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器 游標(biāo)卡尺(上海美耐特實業(yè)有限公司)；DM2500光學(xué)顯微鏡(德國萊卡公司)；Gemini2流變儀(Bohlin Gemini 公司)；LC-10ADVP高效液相色譜儀(日本島津制作所)；FA-2004電子天平(上海精科天平儀器廠)。

1.2 藥品和試劑 硫酸新霉素(批號201511040，宜昌三峽制藥有限公司)；鹽酸達克羅寧(批號16110501，江蘇海慈生物藥業(yè)有限公司)；乙酸地塞米松(批號170104，天津天藥藥業(yè)股份有限公司)；乙酸地塞米松對照品(批號100122-200304，中國藥品生物制品檢定研究院)；維生素E(批號1708103，浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠)；乙醇(批號1F210020，湖南九典制藥有限公司)；冰片(批號170920，云南林緣香料有限公司)；泊洛沙姆407(P407，批號HO6S8C43094)、泊洛沙姆188(P188，批號H1107C22457)由上海源葉生物科技有限公司提供；羥苯乙酯(批號170801)、冰乙酸(批號140907)由湖南爾康制藥股份有限公司提供；甲醇(批號18095055，美國天地有限公司)；口腔潰瘍膜(批號171129，海軍軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院自制)。

1.3 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，由海軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：SCXK(滬)2017-0002。大鼠購入后飼養(yǎng)一周，使其適應(yīng)新的環(huán)境。

2 方法和結(jié)果

2.1 復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠的制備

2.1.1 制備工藝 采用冷溶法制備復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠[1,2]。將處方量的P407和P188于蒸餾水中溶脹過夜，得空白凝膠基質(zhì)。將處方量的硫酸新霉素、達克羅寧、乙酸地塞米松加入到溶脹好的空白凝膠基質(zhì)中并攪拌均勻。最后，將處方量的冰片、羥苯乙酯和維生素E溶于少量乙醇中，將制備好的藥物水凝膠加入到乙醇溶液中，攪拌均勻，即得載藥口腔黏膜溫敏凝膠。

2.1.2 處方篩選 采用Gemini2流變儀對復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠樣品進行流變學(xué)測定。流變學(xué)參數(shù)：樣品從25 ℃升溫至55 ℃，升溫速度5 ℃/min，樣品溫度精確控制在±0.1 ℃內(nèi)，應(yīng)變幅度為1.0%，振蕩頻率為0.5 Hz，4/20 mm平板，間隙0.5 mm。

2.1.3 P407和P188的用量對流變學(xué)參數(shù)的影響 用不同比例的P407(18%～20%)和P188(2%～6%)制備空白凝膠，并考察不同條件下P407和P188的用量對流變學(xué)參數(shù)[相變溫度與37 ℃對應(yīng)的黏度]的影響，結(jié)果見表1。由表1可見，單獨使用P407時，相變溫度呈現(xiàn)出濃度依賴性，即濃度較高的P407溶液在較低溫度下即可以發(fā)生膠凝。固定P407比例不變，少量P188即可以對P407的相變溫度產(chǎn)生較大的影響。隨著P188加入量的增加，相變溫度會逐漸上升。

表1 采用不同比例泊洛沙姆407和泊洛沙姆188制備的凝膠的相變溫度及37 ℃時的黏度值Table 1 Phase transition temperature and viscosity values at 37 ℃ of the gel prepared with different ratios of poloxamer 407 and poloxamer 188

綜合考慮相變溫度、黏度和口腔溫度等因素，以比例為18∶2的P407與P188為空白凝膠處方，并按2.1.1項下方法制備載藥口腔黏膜溫敏凝膠，測得的流變學(xué)曲線見圖1，可見復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠在33 ℃發(fā)生相變，因此將P407和P188比例確定為18∶2，作為空白溫敏凝膠的最優(yōu)處方。

圖1 泊洛沙姆188和泊洛沙姆407比例為18∶2時制備的凝膠的流變學(xué)曲線Figure 1 Rheological curve of the gels prepared with poloxamer 188/poloxamer 407 at a ratio of 18∶2

2.1.4 最優(yōu)處方驗證 按照最優(yōu)處方同法制備3批樣品，測得的平均相變溫度為(33.1±0.32) ℃。表明優(yōu)化的復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠處方工藝穩(wěn)定，且溫敏凝膠的相變溫度高于室溫且低于口腔溫度，給藥方便；在口腔溫度條件下黏度適宜，給藥后在患處停留時間較長。

2.2 復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠對大鼠口腔潰瘍的療效

2.2.1 大鼠口腔潰瘍模型的建立 按照參考文獻[3-4]的方法制備大鼠口腔潰瘍模型。采用20%烏拉坦5 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠。準(zhǔn)備一長3 cm，內(nèi)徑0.4 cm的雙端開口玻璃管，玻璃管一端內(nèi)置一小棉球，平于玻璃管開口。將此端垂直平貼于大鼠下唇內(nèi)側(cè)黏膜上，從另一端緩緩滴入50%冰乙酸，燒灼黏膜90 s，棉簽蘸去多余冰乙酸。24 h后大鼠口唇潮濕，實驗區(qū)出現(xiàn)明顯潰瘍，表面黃白色，部分有潰爛，有滲出，表明造模成功。

2.2.2 給藥方法 48只大鼠按隨機數(shù)字表完全隨機分組法分成模型組，空白凝膠組，對照組，復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠高、中、低頻率給藥組，每組8只。除對照組外，

其余5組按 2.2.1項下方法造模。 造模24 h后測量每組大鼠口腔潰瘍面積并給藥，給藥前用棉簽蘸0.9%生理鹽水輕輕擦拭大鼠口腔表面。給藥方法如下：(1)高頻率給藥組予復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠每日6次，2 h噴一次，每次搖勻后噴3下；(2)中頻率給藥組予復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠每日4次，3 h噴一次，每次搖勻后噴3下；(3)低頻率給藥組予復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠每日2次，4 h噴一次，每次搖勻后噴3下；(4)空白凝膠組予不加任何輔料的空白凝膠，P407和P188含量同復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠，給藥劑量和頻率同高頻率給藥組；(5)模型組予0.9%生理鹽水擦拭潰瘍;(6)對照組予口腔潰瘍膜，按使用說明書將藥膜撕成適宜大小，粘貼于患處10～15 min，讓藥膜自行溶化，每日給藥2次。除模型組和對照組，其他4組都使用特定的噴霧設(shè)備，搖勻后將藥液噴于潰瘍處，每次噴3下，維持30 s，待凝膠在潰瘍處干燥并形成凝膠膜，給藥后禁食禁水30 min。

2.2.3 潰瘍面大體觀察 拍照記錄大鼠造模成功的潰瘍面情況(見圖2A)以及用藥d 4的組織愈合情況(見圖2B～F)。造模成功后，各組大鼠潰瘍面由黃白色假膜覆蓋，滲出明顯，炎癥反應(yīng)重，創(chuàng)面凹陷；給藥4 d后，模型組和空白凝膠組仍有滲出，潰瘍面明顯，損傷仍嚴(yán)重，炎癥反應(yīng)重；復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠各頻率給藥組和對照組潰瘍面光滑，創(chuàng)面愈合良好，炎癥反應(yīng)輕，其中高頻率給藥組創(chuàng)面基本痊愈。

圖2 用藥第4天各組大鼠的潰瘍面情況Figure 2 Ulcer surface of the rats in different groups on the fourth day after medicationA:模型組;B:空白凝膠組;C:對照組;D:復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠高頻率給藥組;E:復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠中頻率給藥組;F:復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠低頻率給藥組

表2 各組大鼠口腔潰瘍面積的比較
Table 2 Comparisons of the oral ulcer sizes of the rats in different groups

組別給藥前給藥第1天給藥第2天給藥第3天給藥第4天空白凝膠組 25.46±0.3425.16±0.86 20.49±1.12 16.72±0.93 13.73±0.68 模型組 25.59±0.4024.99±0.7621.52±0.9817.72±0.9414.07±0.69對照組 25.55±0.4521.79±0.57**△△12.27±0.78**△△9.45±0.49**△△7.67±0.47**△△低頻率給藥組25.87±0.5522.39±0.40**△△15.57±0.65**△△▲▲10.96±0.4**△△▲▲9.20±0.35**△△▲▲中頻率給藥組25.38±0.7121.47±0.37**△△□□11.86±0.54**△△□□7.57±0.92**△△▲▲□□3.81±0.77**△△▲▲□□高頻率給藥組25.36±0.8219.87±0.72**△△▲▲□□■■9.99±0.62**△△▲▲□□■■6.12±0.82**△△▲▲□□■■2.01±0.60**△△▲▲□□■■

**P<0.01，與空白凝膠組比較；△△P<0.01，與模型組比較；▲▲P<0.01，與對照組比較；□□P<0.01，與低頻率給藥組比較；■■P<0.01，與中頻率給藥組比較

2.2.5 組織病理學(xué)變化 連續(xù)給藥4 d后處死大鼠，分別切取各組大鼠潰瘍處組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，光學(xué)顯微鏡下觀察各組口腔潰瘍形態(tài)[5]。給藥4 d后，模型組和空白凝膠組組織損傷仍較嚴(yán)重，病理損傷涉及黏膜下層，潰瘍表面有壞死組織覆蓋，大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤。對照組和低頻率給藥組上皮組織愈合良好，但黏膜下層仍有大量炎癥細胞浸潤。中頻率給藥組和高頻率給藥組上皮組織愈合良好，僅少量炎癥細胞浸潤，具體見圖3。

圖3 各組大鼠口腔潰瘍組織病理學(xué)變化(×200)Figure 3 Pathological changes in oral ulcer tissues of the rats in different groups(×200)A:模型組;B:空白凝膠組;C:對照組;D:復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠高頻率給藥組;E:復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠中頻率給藥組;F:復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠低頻率給藥組

3 討 論

口腔潰瘍是口腔黏膜疾病中發(fā)病率較高的一種疾病，多由于飲食作息不規(guī)律、心理壓力大、 緊張疲勞、體虛及免疫力低下等原因引起[6]。主要表現(xiàn)為口腔黏膜出現(xiàn)圓形或橢圓形的潰瘍， 呈淡黃色或白色，中央凹陷，邊緣整齊，周圍繞以紅暈，可單發(fā)或多發(fā)，可發(fā)生于口腔黏膜的任何部位[7,8]。目前雖有多種治療方法，但還沒有特效治療藥物，以局部對癥治療為主，以消除致病誘因、促進機體健康、緩解局部癥狀、促使?jié)冇?、延長間歇期作為治療目的[9]。復(fù)方硫酸新霉素口腔潰瘍涂膜主要由硫酸新霉素、鹽酸達克羅寧、乙酸地塞米松、維生素E等藥物組成，具有消炎止痛，促進潰瘍愈合的作用，適用于各型口腔潰瘍的治療，能明顯縮短潰瘍的病程和延長復(fù)發(fā)間歇期，減輕病人的痛苦和不適。之前復(fù)方硫酸新霉素口腔潰瘍涂膜用于臨床的劑型是糊劑，臨床應(yīng)用過程中存在的主要問題是給藥不方便，影響了藥效的發(fā)揮。

溫敏凝膠是一種越來越受到青睞的新型載藥系統(tǒng)，它以溶液狀態(tài)給藥后，可立即在用藥部位轉(zhuǎn)化成非化學(xué)交聯(lián)半固體凝膠，延長藥物的作用時間，提高療效[10-11]，用藥部位可以維持穩(wěn)定、有效的藥物濃度，減少給藥次數(shù)，提高病人依從性，減輕全身不良反應(yīng)。本研究以P407和P188為載體材料，制備復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠，在保留原復(fù)方硫酸新霉素口腔潰瘍涂膜有效成分的基礎(chǔ)上，將原有糊劑劑型改進為溫敏凝膠劑，處方組成簡單、療效確切，克服了原涂膜的不足。

臨床上表現(xiàn)為口腔潰瘍的疾病主要有兩類：口腔黏膜病引起的口腔潰瘍和創(chuàng)傷性潰瘍。兩者口腔潰瘍的發(fā)病因素不同，但潰瘍病理變化過程和愈合過程基本一致。因此本研究采用化學(xué)藥物燒灼大鼠下唇內(nèi)側(cè)黏膜，制備口腔潰瘍模型進行實驗，結(jié)果與模型組比較，復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠各頻率給藥組潰瘍面積顯著減小，潰瘍面愈合良好，提示復(fù)方硫酸新霉素溫敏凝膠對潰瘍有促進愈合的作用。