苦瓜下胚軸的離體再生體系

潘瓊玉 田麗波 商桑 鄒凱茜 周萌萌 朱國(guó)鵬 曾麗萍

摘 要： 為了建立高頻的苦瓜離體再生體系，為苦瓜遺傳轉(zhuǎn)化提供技術(shù)基礎(chǔ)，篩選了最適消毒方法和外植體類型。以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度激素組合，篩選最適于苦瓜不定芽誘導(dǎo)、伸長(zhǎng)和生根的培養(yǎng)基。最佳的消毒方法為：用水浸泡去殼的種子15 min，在超凈工作臺(tái)中用75%酒精浸泡30 s后再用4% NaClO浸泡6 min，用無(wú)菌水沖洗4～5遍，污染率為0，發(fā)芽率為98%;最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.5 mg·L-1 6-BA+0.01 mg·L-1 IBA，愈傷組織密度為0.79 g·cm-3，不定芽的分化率為39%，最佳外植體為下胚軸（12 d），誘導(dǎo)率為41%;最佳的增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.005 mg·L-1 IBA;最佳的生根培養(yǎng)基為MS+0.1 mg·L-1 IBA，移栽存活率為74%。初步建立了苦瓜離體再生體系。

關(guān)鍵詞： 苦瓜;再生體系;離體培養(yǎng);愈傷組織

In vitro regeneration system of bitter melon

PAN Qiongyu， TIAN Libo， SHANG Sang， ZOU Kaixi， ZHOU Mengmeng， ZHU Guopeng， ZENG Liping

（College of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou 570228， Hainan， China，）

Abstract： In order to establish the high-frequency in vitro regeneration system of bitter melon， and provide technical basis for the genetic transformation of bitter melon， the optimal disinfection method and explant type were screened. MS medium was used as the basic medium， and added different concentrations of hormones. The most suitable medium for adventitious bud induction， elongation and rooting of bitter melon were selected. The best disinfection method was： soaking the shelled seeds in water for 15 min， 75% alcohol for 30 s in the ultra-clean workbench， 4% NaClO for 6 min， and rinse with sterile water for 4-5 times. The germination rate reached 98% without any pollution. The best callus induction medium is MS+2.5 mg·L-1 6-BA+0.01 mg·L-1 IBA. The callus density was 0.79 g·cm-3， and the adventitious bud differentiation rate was 39%. The optimal explant was hypocotyl （12 d）with duction rate 41%. The best proliferation medium is MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.005 mg·L-1 IBA. The best rooting medium is MS+0.1 mg·L-1 IBA. The transplanting survival rate was 74%. An in vitro regeneration system of bitter melon was established.

Key words： Bitter melon; Regeneration system; In vitro culture; Callus

苦瓜（Momordica charantia L.）為葫蘆科苦瓜屬一年生攀援狀柔弱草本植物，苦瓜性味甘苦寒涼、無(wú)毒，具有清熱解毒、補(bǔ)腎陽(yáng)、祛寒濕、降血糖[1]、抗菌、抗腫瘤、抗病毒[2]等藥用功效，是一種食藥兼用的植物，在全世界廣泛種植，也已成為海南省的支柱蔬菜種類之一。但苦瓜常規(guī)育種的難度大、周期長(zhǎng)、遺傳性狀不穩(wěn)定，而苦瓜基因組測(cè)序已經(jīng)完成[3]，利用分子標(biāo)記輔助育種、轉(zhuǎn)基因育種、基因編輯育種或設(shè)計(jì)育種已經(jīng)成為可能，遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立對(duì)種質(zhì)資源的創(chuàng)新和新品種培育非常重要，而再生體系的建立是這些工作的基礎(chǔ)，也是目前研究的熱點(diǎn)，且離體再生能縮短植物的生長(zhǎng)周期，固定雜種優(yōu)勢(shì)，其再生無(wú)菌苗不帶任何病菌。

目前，國(guó)內(nèi)外做過(guò)許多針對(duì)苦瓜的研究，主要集中在雜種優(yōu)勢(shì)利用、栽培技術(shù)以及近年來(lái)對(duì)其藥用性的研究。而苦瓜的再生體系這方面開始研究的時(shí)間比較晚，且效果不顯著，苦瓜外植體易于誘導(dǎo)出愈傷組織而難以分化出再生芽。而且，不同研究人員的試驗(yàn)結(jié)論差異較大，高濃度的6-BA不利于叢生芽的伸長(zhǎng)，但一定濃度的IAA和6-BA的組合配比對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用[4]。馮銳等[5]單獨(dú)用3.0 mg·L-1的KT時(shí)，叢生芽增殖效果為其他的4.9倍，且苗健壯，長(zhǎng)勢(shì)好。還有用噻苯隆（TDZ）對(duì)苦瓜叢生芽進(jìn)行誘導(dǎo)的[6-9]。Tang[10]發(fā)現(xiàn)單獨(dú)用BAP能誘導(dǎo)芽分化。有用CSH和TDZ搭配加在MS中誘導(dǎo)苦瓜外植體為子葉的愈傷組織發(fā)芽[11]。還有用2，4-D對(duì)外植體進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)的試驗(yàn)[12-13]。在用外植體直接誘導(dǎo)出叢生芽的階段，植物苗齡也是影響不定芽誘導(dǎo)能否成功的重要因素之一[14]。王國(guó)莉等[15]用3個(gè)不同生長(zhǎng)階段的苦瓜無(wú)菌苗進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果證明，10 d前后苗齡是誘導(dǎo)子葉節(jié)叢生芽的最適時(shí)期。

當(dāng)前已有的離體培養(yǎng)再生體系并不適于所有的苦瓜遺傳轉(zhuǎn)化，建立適宜的苦瓜離體再生體系十分必要，這不僅具有一定難度，還具有一定的創(chuàng)新性。筆者對(duì)苦瓜的離體培養(yǎng)和植株再生條件進(jìn)行研究，以期為建立苦瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

‘海研二號(hào)苦瓜，由海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院苦瓜課題組提供;MS培養(yǎng)基配方：蔗糖30 g·L-1，瓊脂7.5 g·L-1，pH 5.8～6.0。試驗(yàn)于2017年11月至2018年6月在海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院品種改良試驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度為27～29 ℃，光照強(qiáng)度為2 000 Lx，每日光照16 h，黑暗8 h。

1.2.2 種子無(wú)菌萌發(fā) 用以下3種消毒方式：（1）將種子去殼，用水浸泡15 min，在超凈工作臺(tái)中用75%酒精浸泡30 s，再用4% NaClO浸泡4 min，用無(wú)菌水沖洗4～5遍;（2）將種子去殼，用水浸泡15 min，在超凈工作臺(tái)中用75%酒精浸泡30 s，再用4% NaClO浸泡6 min，用無(wú)菌水沖洗4～5遍;（3）將種子去殼，用水浸泡15 min，在超凈工作臺(tái)中用75%酒精浸泡30 s，再用4% NaClO浸泡8 min，用無(wú)菌水沖洗4～5遍。每個(gè)方法3次重復(fù)。將消毒好的種子接種到MS培養(yǎng)基中，每瓶1粒，各接20瓶（待確定最佳的消毒方式后，接種時(shí)每瓶接種3～5粒），放入培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，種子露白后移到光下。7 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率和污染率，比較各種消毒方法的效果和無(wú)菌苗的生長(zhǎng)情況，得出最佳的消毒方式。

1.2.3 外植體的取材 待接種6～7 d后（苦瓜苗長(zhǎng)勢(shì)如圖1-a），將無(wú)菌苗子葉（外植體1）和下胚軸（外植體2）切下，下胚軸取4～5 mm，子葉取5 mm×5 mm作為外植體;待接種12 d后（苦瓜苗長(zhǎng)勢(shì)如圖1-b），將無(wú)菌苗下胚軸（外植體3）和頂芽（外植體4）切取4～5 mm，用手術(shù)刀切取新葉和真葉，輕輕刮去生長(zhǎng)點(diǎn)作為外植體。

1.2.4 愈傷組織及不定芽的分化 每種外植體取20個(gè)，將外植體頂端朝上，插在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。MS+（1、1.5、2、2.5、3） mg·L-1 6-BA+（0.01、0.02） mg·L-1 IBA配比的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（表1），14 d內(nèi)統(tǒng)計(jì)各愈傷組織的啟動(dòng)時(shí)間，28 d后記錄愈傷組織的形成率和愈傷組織質(zhì)地。選出最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將培養(yǎng)了30 d后的愈傷組織接種到最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)14 d后記錄芽原基分化情況。30 d后，統(tǒng)計(jì)不定芽分化率和不定芽數(shù)量。

愈傷組織形成率/%=形成愈傷組織的葉柄數(shù)/接種的葉柄外植體總數(shù)×100;

愈傷組織密度= 20 塊愈傷組織的鮮質(zhì)量（g）/20 塊愈傷組織的體積（cm3）。

愈傷組織體積的測(cè)量方法為：每一批取20塊愈傷組織浸入到200 mL 的無(wú)菌水中，溢出水的體積即為20 塊愈傷組織的體積。

不定芽的分化率/%=分化出不定芽的愈傷組織數(shù)/接種愈傷組織總數(shù)×100。

1.2.5 增殖培養(yǎng) 將已長(zhǎng)出大量不定芽的愈傷組織切成約4 mm×4 mm大小，轉(zhuǎn)接到MS+（1、1.5） mg·L-1 6-BA+（0.005、0.01） mg·L-1 IBA和不加激素的MS增殖培養(yǎng)基中，比較不同濃度激素對(duì)不定芽的影響，2周后記錄不定芽伸長(zhǎng)率和伸長(zhǎng)量。

1.2.6 生根培養(yǎng) 以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基，分別添加0.01、0.02 mg·L-1 IBA，探索無(wú)機(jī)鹽和不同濃度IBA對(duì)不定根誘導(dǎo)的影響，15 d后分別統(tǒng)計(jì)不定根的發(fā)生率和數(shù)目，選出最佳生根培養(yǎng)基。

1.2.7 煉苗試驗(yàn) 將根長(zhǎng)2.5～3.0 cm的再生苗除去瓶蓋，加入剛好能沒過(guò)培養(yǎng)基的水，放在室溫下培養(yǎng)2～3 d，將再生苗取出，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到裝有無(wú)菌土（V營(yíng)養(yǎng)土∶V基質(zhì) = 3∶1）的定植盆中，澆透定根水，再在室溫中暗培養(yǎng)3 d。3 d后移至正常光下，每天澆1次水，15 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子的無(wú)菌萌發(fā)

由表2可知，方法2的發(fā)芽率和污染率都顯著好于其他2種方法。3種消毒方法的發(fā)芽率都較高，第2種方式發(fā)芽率發(fā)到98%，污染率為0，是本次試驗(yàn)中最佳的消毒方式。第1種方法雖然發(fā)芽率也高達(dá)93%，但是消毒不徹底;第3種方法雖然消毒較徹底，但消毒過(guò)度，傷害到種子的胚，造成發(fā)芽率降低。

2.2 不同外植體類型對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

由表3可以看出，外植體1和外植體2較難誘導(dǎo)出不定芽。外植體3和外植體4都能誘導(dǎo)出不定芽，而外植體3（圖1-c）誘導(dǎo)率最高，如圖1-d，為41%，且顯著高于其他外植體。因?yàn)榍捌谔幚硗庵搀w時(shí)，已經(jīng)把芽點(diǎn)都處理干凈，誘導(dǎo)得到的芽14 d左右才能形成，長(zhǎng)得慢;普通的芽5 d左右便形成了，長(zhǎng)得快，可以區(qū)別開來(lái)。所以，外植體3為本次試驗(yàn)的最佳外植體。

2.3 不同激素類型、濃度配比對(duì)不定芽的誘導(dǎo)試驗(yàn)

將本次試驗(yàn)中選出的最佳外植體下胚軸（12 d）接種到由不同濃度激素配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，一定時(shí)間記錄愈傷組織的分化情況。從表4中可以看出，隨著6-BA濃度的提高，愈傷組織啟動(dòng)時(shí)間越快，愈傷組織的形成率也隨著提高。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為2.5 mg·L-1、IBA為0.01 mg·L-1時(shí)，愈傷組織密度達(dá)到最高，為0.79 g·cm-3，愈傷組織比較致密。

后續(xù)培養(yǎng)可看到愈傷組織分化出密密麻麻的芽原基，繼代培養(yǎng)14 d左右可形成小苗，再過(guò)14 d轉(zhuǎn)接到不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中。由表2得出，當(dāng)6-BA為2.5 mg·L-1、IBA為0.01 mg·L-1時(shí)，不定芽的分化率為39%，不定芽數(shù)目較高，為7.1個(gè)。7號(hào)培養(yǎng)基的愈傷組織密度、不定芽分化率、不定芽數(shù)都顯著高于5號(hào)培養(yǎng)基。因此，7號(hào)誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基MS+2.5 mg·L-1 6-BA+0.01 mg·L-1 IBA是最適合苦瓜外植體3愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

2.4 不定芽的伸長(zhǎng)

從表5可知，提高6-BA濃度不利于不定芽的伸長(zhǎng)，而適當(dāng)?shù)靥岣逫BA濃度，有利于不定芽的伸長(zhǎng)。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1、IBA為0.005 mg·L-1時(shí)，不定芽伸長(zhǎng)率為90%，芽平均長(zhǎng)度為0.87 mm。較低的激素有利于不定芽的生長(zhǎng)，但配比不合適的培養(yǎng)基會(huì)讓愈傷組織出現(xiàn)玻璃化和褐化，造成不定芽的死亡。且3號(hào)的不定芽伸長(zhǎng)率和芽均長(zhǎng)都顯著高于其他培養(yǎng)基。因此，最適合苦瓜不定芽伸長(zhǎng)的培養(yǎng)基是3號(hào)MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.005 mg·L-1 IBA。

2.5 生根培養(yǎng)

從表6中可以看出，隨著無(wú)機(jī)鹽濃度的降低，無(wú)菌苗的生根率和平均根數(shù)升高，但是存活率降低。所以，MS培養(yǎng)基比較有利于無(wú)菌苗的存活。隨著IBA濃度提高，無(wú)菌苗的生根率和平均根數(shù)、移栽成活率降低，配合MS的使用，當(dāng)IBA質(zhì)量濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，無(wú)菌苗的生根率、平均根數(shù)和移栽成活率達(dá)到最高，分別為42%、5.67條、74%。1號(hào)生根培養(yǎng)基的平均根數(shù)顯著高于2號(hào)、4號(hào)，移栽成活率顯著高于2號(hào)、3號(hào)。所以，1號(hào)生根培養(yǎng)基MS+0.1 mg·L-1 IBA是本次研究中最適合苦瓜無(wú)菌苗生根和移栽的培養(yǎng)基。

2.6 試管苗移栽

當(dāng)試管苗的根長(zhǎng)達(dá)到2.5～3.0 cm，如圖1-e，進(jìn)行煉苗移栽。每天澆1次水，2周后統(tǒng)計(jì)成活率，為74%，圖1-f即為成活。

3 討論與結(jié)論

起始外植體材料是影響植物離體再生的重要因素。外植體再生能力與外植體取材部位、切割方法、外植體的年齡以及材料的極性等因素相關(guān)[16]。外植體材料需具有大量再生能力強(qiáng)的細(xì)胞群存在，才能在生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的誘導(dǎo)下脫分化。羅燕華的試驗(yàn)表明苦瓜的幼葉、下胚軸和愈傷組織誘導(dǎo)分化很難，而子葉節(jié)卻可以直接誘導(dǎo)出叢生芽[4]。真葉、上下胚軸等外植體愈傷組織生長(zhǎng)速度比較緩慢[4]，而子葉、下胚軸和幼根的愈傷組織的生長(zhǎng)速度快[17]。在西瓜中，很多組織和器官都能作為西瓜的外植體，比如子葉、莖尖、幼葉、頂芽等，但即使是在同一植株上，其誘導(dǎo)率也存在差異[18]。本研究的最佳外植體為外植體3，即苗齡為12～14 d的下胚軸，和羅燕華[4]的結(jié)果不同，可能與采用的下胚軸的生長(zhǎng)狀態(tài)不同有關(guān);用子葉、頂芽和下胚軸（苗齡為6～8 d）沒有誘導(dǎo)出不定芽，原因可能是外植體內(nèi)源激素與培養(yǎng)基的激素配比不合適，而且不同外植體在誘導(dǎo)不定芽的能力上也是有區(qū)別的。

植物組培中的一個(gè)很重要的條件是植物培養(yǎng)基種類和成分。培養(yǎng)基的成分與植物是否能成功生長(zhǎng)有直接關(guān)系。生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素能很好地促進(jìn)叢生芽的發(fā)生[5]。影響植物愈傷組織的形成的一個(gè)重要因素是不同的激素組合配比。王國(guó)莉等[15]在2組激素組合MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA和MS+2.0 mg·L-1 玉米素（ZT）+0.1 mg·L-1 萘乙酸（NAA）中，3種基因型苦瓜的誘導(dǎo)率都是最高的，每10個(gè)外植體得到30個(gè)左右的叢生芽。潘紹坤等[19]研究苦瓜再生植株時(shí)發(fā)現(xiàn)，加入IAA和吲哚丁酸（IBA）的每個(gè)處理的不定芽再生率都很高。筆者發(fā)現(xiàn)，2.5 mg·L-1 6-BA配合0.01 mg·L-1 IBA可以使‘海研二號(hào)苦瓜的下胚軸（12 d）愈傷組織不定芽分化率達(dá)到最高。高濃度的6-BA雖然對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效果很好，對(duì)不定芽的分化起關(guān)鍵性作用，但也造成叢生芽不易伸長(zhǎng)、畸形和玻璃化的現(xiàn)象。而且轉(zhuǎn)接次數(shù)越多，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，苦瓜也可能出現(xiàn)基因變異，會(huì)影響后續(xù)的再生能力。以上結(jié)果表明了作物的種類和基因型、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類、濃度都是影響外植體再生的重要因素。

苦瓜具有很高的食用和藥用價(jià)值，不論是在品質(zhì)改良，或是提高抗性等方面，苦瓜都有著很大的潛力。而常規(guī)育種技術(shù)難以獲得的新種質(zhì)，可以利用分子育種改良品質(zhì)、提高抗病、抗逆或抗蟲性，獲得新的優(yōu)良品種，這將會(huì)為苦瓜的遺傳育種開辟新的道路。所以，苦瓜的離體再生體系的研究將會(huì)加速育種進(jìn)程。而與其他葫蘆科的植物相比，由苦瓜外植體誘導(dǎo)不定芽的過(guò)程還是十分困難，不定芽的誘導(dǎo)率為39%，甜瓜再生率在45%[20]、67%[21]、88.67%[22]，西瓜為83.32%[23]、87.78%、82.78%和 86.11%[24]，黃瓜為50.0%、56.3%[25]、96.2%[26]，南瓜為19.8%和20.1%[27]、64.5%[28]，且不定芽畸形和玻璃化等不正?，F(xiàn)象出現(xiàn)頻繁。如何進(jìn)一步提高苦瓜不定芽的誘導(dǎo)率，解決不定芽的不正?，F(xiàn)象，建立一個(gè)穩(wěn)定高效的再生體系，是值得研究的問(wèn)題。

通過(guò)嚴(yán)格的無(wú)菌操作、對(duì)苦瓜外植體培養(yǎng)條件的篩選和改善、觀察和統(tǒng)計(jì)愈傷組織和不定芽伸長(zhǎng)情況及不定芽數(shù)量，初步建立了苦瓜離體再生體系，為今后苦瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 柴瑞華，肖春瑩，關(guān)健，等.苦瓜總皂苷降血糖作用的研究[J].中草藥，2008，39（5）：746-747.

[2] SZALAI K，SCHLL I，F(xiàn)RSER-WALDL E.Occupational sensitization to ribosome-inactivating proteins in researchers[J].Clinical and Experimental Allergy，2005，35（10）：1354-1360.

[3] URASAKI N，TAKAGI H，NATSUME S，et al.Draft genome sequence of bitter melon （Momordica charantia），a vegetable and medicinal plant in tropical and subtropical regions[J].DNA Research，2017，24（1）：51.

[4] 羅燕華.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苦瓜遺傳轉(zhuǎn)化研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2006.

[5] 馮銳，張慧英，劉百龍.苦瓜試管苗的快速繁殖[J].北方園藝，2007（3）：165-166.

[6] VELIVELA Y，NARRA M，ELLENDULA R， et al.In vitro plant regeneration from petiole explants and assessment of genetic fidelity using issr markers in Momordica charantia L.[J].Plant Cell Biotechnology and Molecular Biology，2016，17（1&2）：49-56.

[7] THIRUVENGADAM M，REKHA K T，YANG C H，et al.High-frequency shoot regeneration from leaf explants through organogenesis in bitter melon （Momordica charantia L.）[J].Plant Biotechnology Reports，2010，4（4）：321-328.

[8] 吳海斌，羅劍寧，何曉莉，等.苦瓜高頻組培再生體系的建立[J].園藝學(xué)報(bào)，2014，41（S）：2725.

[9] THIRUVENGADAM M，PRAVEEN N，CHUNG I M.An efficient agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of bitter melon （Momordica charantia L.）[J].Australian Journal of Crop Science，2012，6（6）：1094-1100.

[10] TANG Y，LIU Y.Promote adventitious buds induction from stem segments of bitter melon（Momordica charantia L.）[J].Journal of Agricultural Science，2011，3：2.

[11] PEER MAHAMMAD SHAIK，RAJU SAMRAJU，RAVI CHITHAKARI，et al.TDZ induced in vitro plantregeneration of Momordica balsamina and Momordica charantia，important medicinal cucurbits[J].International Journal of Current Research，2016，8（5）：31067-31070.

[12] SULTANA R S，RAHMAN M M.Cells structure and morphogenesis of embryogenic aggregates in suspension culture of bitter melon （Momordica charantia L.）[J].International Journal of Biosciences，2012：97-105.

[13] THIRUVENGADAM M，PRAVEEN N，CHUNG I M.In vitro regeneration from internodal explants of bitter melon （Momordica charantia L.） via indirect organogenesis[J].African Journal of Biotechnology，2012，11（32）：8218-8224.

[14] 林義章，羅燕華，張志忠.苦瓜子葉節(jié)叢生芽的誘導(dǎo)[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2006（2）：60-63.

[15] 王國(guó)莉，范紅英，林潤(rùn)銀，等.不同基因型苦瓜離體植株再生體系的建立[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（28）：12125-12127.

[16] COLLADO R，VEIT?A N，BERM?DEZ-CARABALLOSO I，et al. Efficient in vitro plant regeneration via indirect organogenesis for different common bean cultivars[J].Scientia Horticulturae，2013，153：109-116.

[17] 黃勇.苦瓜（Momordica charantia L.）組織培養(yǎng)及四倍體誘導(dǎo)研究[D].重慶：西南大學(xué)，2007.

[18] 董焱，張潔，張海英，等.西瓜未成熟胚高效再生體系的建立[J].中國(guó)瓜菜，2014，27（3）：10-13.

[19] 潘紹坤，王永清.苦瓜離體快速繁殖技術(shù)體系的研究[J].北方園藝，2006（4）：148-150.

[20] 武云鵬，張若緯，彭冬秀，等.薄皮甜瓜‘花雷再生體系的建立[J].中國(guó)瓜菜，2018，31（11）：36-39.

[21] 田芳，姚兆群，陳美秀，等.甜瓜‘黃旦子再生體系的建立[J].北方園藝，2017（9）：85-88.

[22] 胡瑩，冷平，王福軍，等.京玉1號(hào)甜瓜高效再生體系的建立[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，14（1）：99-103.

[23] 董焱，張潔，張海英，等.西瓜未成熟胚高效再生體系的建立[J]. 中國(guó)瓜菜，2014，27（3）：10-13.

[24] 閔子揚(yáng)，阮萬(wàn)輝，張屹，等.三倍體無(wú)籽西瓜子葉節(jié)再生體系建立與嫁接育苗技術(shù)探究[J].中國(guó)瓜菜，2017，30（1）：8-11.

[25] 李文璐，姜守陽(yáng)，張楠，等.黃瓜高效再生體系的建立[J].北方園藝，2014（20）：96-100.

[26] 李艷華.黃瓜離體再生和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立與優(yōu)化[D].河南新鄉(xiāng)：河南科技學(xué)院，2016.

[27] 閔子揚(yáng)，李涵，鄒甜，等.南瓜未授粉子房離體培養(yǎng)及植株再生[J].植物學(xué)報(bào)，2016，51（1）：74-80.

[28] 張玉園，魯曉曉，周俊國(guó)，等.南瓜子葉節(jié)離體再生體系構(gòu)建[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（12）：26-29.