植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶基因在大腸桿菌中 重組表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)分析

張慶芳,李美玉,王曉輝,胡善松,于爽,遲乃玉*

1(大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連，116622) 2(遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連，116622)

圖1 CuNiR中亞硝酸鹽還原的作用機(jī)理Fig.1 The mechanism of action of nitrite reduction in CuNiR

隨后，水復(fù)合材料能夠重新進(jìn)入催化體系并發(fā)揮其在亞硝酸鹽還原中的作用[7]。HORRELL等[8]研究了CuNiR分子與結(jié)構(gòu)特征，但未報道CuNiR酶學(xué)性質(zhì)的研究。本研究在酸菜湯汁中分離得到1株植物乳桿菌(Lactobacillussp.)，命名為LMY-20。合成了LMY-20菌株的nir基因，并對其蛋白進(jìn)行了表達(dá)純化及酶活性質(zhì)研究，重組NiR溫度穩(wěn)定性較好，為亞硝酸鹽還原酶基因的進(jìn)一步開發(fā)及利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌(Lactobacillussp. LMY-20)從東北酸菜湯汁中分離篩選得到，保藏于大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遼寧省海洋微生物工程實(shí)驗(yàn)室；表達(dá)載體pET28a(+)和E.coliDH5α由Synbio Technologies提供；E.coliBL21(DE3)、pMD-19-T Vector、PowerMaxTM Soil DNA Isolation Kit基因組大量提取試劑盒購自TaKaRa公司；DL2000 DNA Marker、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI、2xTaq PCR Master-Mix，購自北京TIANGEN生物公司；預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(PageRuler Prestained Protein Ladder)，購自MBI Fermentas公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒，購自上海生工。其他試劑為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨10、酵母粉4、K2HPO42、牛肉粉8、MgSO40.2、乙酸鈉5、檸檬酸三銨2、MnSO40.05、吐溫-80 1、瓊脂20、pH(6.2±0.2)。

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母浸提物5、NaCl 10。LA培養(yǎng)基：LB液體或固體培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為100 μg/mL卡那霉素。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

Veriti Dx PCR擴(kuò)增儀，Thermo Fisher Scientific公司；GS-158低溫臺式離心機(jī)，BECKMAN公司；J21-M高速冷凍離心機(jī)，BECKMAN公司；臺式冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司；CH1015超級恒溫水浴槽，上海恒平儀器廠；Inazge Mlaster RVDS電泳成像系統(tǒng)，Parmacia Biotech公司；DYY-Ⅲ形電泳槽，北京六一儀器廠；Milli-QAcademic超純水器、pH計，BECKMAN公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 目的基因的獲取與合成

Lactobacillussp. LMY-20于MRS培養(yǎng)基30 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后離心富集菌體，利用基因組大量提取試劑盒提取基因組DNA。所提DNA送到北京百邁克生物科技有限公司進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測，并使用Illumina Hiseq X10高通量測序平臺進(jìn)行雙端測序(PE150)，建庫大小為270 bp。對測序數(shù)據(jù)過濾低質(zhì)量后，利用Velvet軟件[9]進(jìn)行初步組裝得到最終基因組框架圖。組裝得到基因組序列總長度為3.27 Mb，GC含量為44.36%，測序深度為180×?；蝾A(yù)測與功能注釋由RAST(rapid annotation using subsystem technology)[10]完成，選取默認(rèn)參數(shù)。亞硝酸鹽還原酶基因的獲取由基因功能注釋結(jié)果及BLAST比對NiR參考蛋白序列(ERL45402.1，AHN70577.1，ATO54837.1，AFO84709.1，GAF39669.1，WP_094784585.1，PNE49716.1，PNE49716.1，WP_005922732.1，EAV38847.1，CUW15443.1，OEG23520.1，OJG98603.1)確定，由Synbio Technologies公司對菌株LMY-20的nir基因進(jìn)行基因全長合成并構(gòu)建于克隆載體pMD-19-T。

1.4.2 重組表達(dá)載體pET28a-nir的構(gòu)建

以pMD-19-T-nir為模板，nir-F：5-CTCGAGAAAA GACCATGGCCAA-3和nir-R：5-CTTAAGAATCCTGT TTGGAC-3為引物， PCR擴(kuò)增nir基因。PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min。循環(huán)參數(shù)為：94 ℃、30 s，65 ℃、45 s(即退火時每圈減少2 ℃)，72 ℃、 1 min、5個循環(huán)。循環(huán)參數(shù)為：94 ℃、30 s，55 ℃、 45 s，72 ℃、1 min，72 ℃、 10 s，25個循環(huán)，PCR反應(yīng)結(jié)束。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定純度和分子質(zhì)量的大小?；厥誔CR產(chǎn)物，將獲得的片段經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切后亞克隆至pET28a(+)載體的NcoI和XhoI位點(diǎn)之間，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR鑒定篩選出符合要求的陽性克隆，對陽性克隆進(jìn)行測序NcoI和XhoI雙酶切驗(yàn)證，將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒命名為pET28a(+)-nir。

1.4.3nir基因的表達(dá)

將構(gòu)建好的表達(dá)菌株接種到LB/Kan液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩過夜培養(yǎng)14 h，然后分別按1%的菌液量接種于含有100 mL LB/Kan液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h (菌液OD600達(dá)到0.4～0.6) 時[11]，加入異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)使最終濃度為1 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)時間4 h行誘導(dǎo)表達(dá)；同時以空載體和未誘導(dǎo)作對照。將菌液8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀菌體用PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌2次，將洗滌后的菌體重懸于10 mL預(yù)冷的PBS緩沖液(pH 7.4) 中，超聲裂解10 min，每次3 s，間隔5 s，功率200 W。然后10 000 r/min，4 ℃，離心20 min。分別上清液、沉淀為蛋白樣品經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 檢測，記錄并分析結(jié)果。

1.4.4 NiR蛋白包涵體的變性溶解與純化

上述沉淀物用20 mL包涵體洗滌液(2 mol/L尿素，1‰ 曲拉通X-100(體積分?jǐn)?shù))，1‰ 十二烷基肌氨酸鈉(體積分?jǐn)?shù))，1 mmol/L DTT，20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl)在4 ℃條件下洗滌3次，置8 000 r/min離心20 min；洗滌后的沉淀用10 mL蛋白質(zhì)變性液(6 mol/L 尿素，1 mmol/L DTT，1%(體積分?jǐn)?shù))十二烷基肌氨酸鈉)重懸包涵體，8 000 r/min離心30 min，棄掉沉淀；將上述變形后的蛋白液用復(fù)性液(20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，0.1%(體積分?jǐn)?shù))曲拉通X-100， 20%(體積分?jǐn)?shù))甘油)4 ℃攪拌透析24 h后，逐漸換到終體積分?jǐn)?shù)為10%甘油，4 ℃攪拌透析24 h。 透析袋中的目的蛋白包涵體經(jīng)變性溶解后為粗酶液[12-13]。粗蛋白Ni+-NTA親和層析柱(Novagen)進(jìn)行親和層析純化[14]，洗脫蛋白液4 ℃保存，蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE檢測，記錄并分析結(jié)果。

1.4.5 蛋白質(zhì)濃度測定

蛋白濃度通過Bradford蛋白濃度測定試劑盒(bradford protein assay kit) 測定。

1.4.6 NiR酶活性的測定[15-16]

測定酶活反應(yīng)體系(500 μL)(μL)：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.5) 50，0.1 mol/L NaNO225，0.1 mol/L MV 15，0.1 mol/L Na2S2O480，酶液300。37 ℃水浴中反應(yīng)10 min，劇烈振蕩終止反應(yīng)(以磷酸緩沖液為空白)。取10 μL用鹽酸萘乙二胺法測定亞硝酸鹽殘留量。亞硝酸還原酶活力單位通過在37 ℃ 下，每分鐘還原1 μmol亞硝酸鹽所消耗的酶量來表示。比活力用1 mg蛋白質(zhì)中酶的活力單位數(shù)來表示。

1.4.7 重組NiR的性質(zhì)分析

最適反應(yīng)溫度：在pH 6.5的PBS緩沖溶液條件下，在4、10、20、25、30、35、37、40、50、60、70 ℃下測定酶活，以37 ℃的酶活為100%計算相對酶活。

酶的熱穩(wěn)定性：將酶液分別置于不同溫度(4、10、20、25、30、35、37、40、50、60、70 ℃)下水浴40 min，在pH6.5的PBS緩沖溶液中和最適反應(yīng)溫度下檢測殘余酶活，并以未保溫時的酶活為100%計算相對酶活。

最適反應(yīng)pH值：在最適酶活反應(yīng)溫度下，分別用0.25 mol/L、pH 2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；0.25 mol/L、pH 6.5、7.0、 7.5、8.0的Tris-HCl緩沖液；分別用0.25 mol/L、pH 9.0、10.0、11.0的Na2HPO4-NaOH緩沖液中測定酶活，以pH 6.5的酶活為100%計算相對酶活，繪制酶活曲線。

酶的pH值穩(wěn)定性：將酶液分別置于上述緩沖液中水浴40 min，在最適反應(yīng)pH值和最適反應(yīng)溫度下檢測殘余酶活，并以未保溫時的酶活為100%計算相對活性，繪制酶活曲線。

金屬離子及EDTA對酶活性的影響：分別向反應(yīng)體系中加入終濃度為1、5 mmol/L的Zn2+, Cu2+, Ba2+, Na+, Fe3+, Mg2+, Al3+, Mn2+及EDTA，在標(biāo)準(zhǔn)條件下測定酶活，并和不添加任何金屬離子的酶活進(jìn)行比較，計算相對活性，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.4.8 動力學(xué)分析

在標(biāo)準(zhǔn)條件下，分別測定0.01～0.1 mol/L NaNO2存在條件下NiR的動力學(xué)參數(shù)。以O(shè)rigin 8.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，推算酶催化的Km及Vmax，依據(jù)測定蛋白含量，計算kcat及催化效率(kcat/Km)，所有測定設(shè)置3個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

以質(zhì)粒pMD-19-T-nir為模板，用引物nir-F和nir-R PCR擴(kuò)增nir基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳，可見約1.3 kb的特異性條帶(圖2)，大小與預(yù)期相符(1.262 kb)。

1～5-nir基因的PCR產(chǎn)物；M-DNA marker DL2000圖2 亞硝酸鹽還原酶基因PCR產(chǎn)物Fig.2 Electrophoretic profile of the PCR product of nir

2.2 重組表達(dá)載體pET28a(+)-nir的鑒定

重組表達(dá)載體pET28a(+)-nir經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約5.4 kb的載體片段和1.3 kb的目的基因片段(圖3)。對重組表達(dá)載體pET28a(+)-nir進(jìn)行DNA測序，結(jié)果顯示插入基因序列與設(shè)計序列完全一致，成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET28a(+)-nir。

M-DNA marker DL5000；1-pET28a(+)-nir的酶切產(chǎn)物；2-未酶切的pET28a(+)-nir圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-nir的酶切鑒定Fig.3 Identification of the pET28a(+)-nir plasmid digested with NcoI and XhoI

2.3 NiR目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將經(jīng)鑒定正確的原核重組表達(dá)質(zhì)粒載體pET28a(+)-nir轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coliBL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。菌體裂解物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，由圖4可知，泳道空載、未誘導(dǎo)宿主菌株和誘導(dǎo)菌株的破碎上清液均未見目的蛋白，而誘導(dǎo)菌株的破碎沉淀泳道約45 kDa位置處出現(xiàn)特異條帶，與預(yù)期表達(dá)的相對分子質(zhì)量(44.959 kDa)相符，說明目的蛋白NiR在宿主菌E.coliBL21(DE3)中成功表達(dá)，但只在沉淀中檢測到目的蛋白，由此可知，目的蛋白NiR在大腸桿菌中以包涵體形式不可溶表達(dá)。

1-誘導(dǎo)pET28a(+)-nir/BL21(DE3)沉淀；2-誘導(dǎo)pET28a(+)-nir/BL21(DE3)上清；3-未誘導(dǎo)pET28a(+)-nir /BL21(DE3) 沉淀；4-未誘導(dǎo)pET28a(+)-nir /BL21(DE3) 上清；M-蛋白質(zhì)marker圖4 目的蛋白NiR的SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE analysis of NiR protein

2.4 包涵體復(fù)性與Ni+-IDA親和純化

在低溫條件下，將離心所得的包涵體先用緩沖液洗滌，除去包涵體表面雜質(zhì)，再對包涵體進(jìn)行溶解，收集上清液。經(jīng)透析復(fù)性，去除高濃度尿素，逐漸恢復(fù)重組蛋白空間構(gòu)象，復(fù)性后的蛋白為粗酶液，其NiR酶活為33.97 U/mg。

蛋白復(fù)性液通過Ni+-NTA親和層析法純化重組NiR(圖5)。純化NiR總蛋白含量為10.3 mg，比活力為226.48 U/mg，總活力為2 332.72 U，總回收率為63.00%，純化倍數(shù)為7.32(表1)。

表1 重組NiR的純化Table 1 Summary of NiR enzyme

M-蛋白質(zhì)marker；1～4-Ni2+柱的80、100、150、300 mmol/L咪唑溶液洗脫液圖5 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE profile of purified NiR

2.5 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.5.1 pH對酶活性的影響

由圖6-a可知，重組NiR相對酶活在pH 2.0～12.0先升高后降低，在pH為6.5時達(dá)到最大值，之后相對酶活逐漸降低，因此，重組NiR的最適pH值為6.5。在37 ℃條件下，分別采用不同pH值的PBS緩沖液孵育重組NiR，結(jié)果表明，該酶在pH 6.5～8.0的穩(wěn)定性較好，相對酶活保持在60%以上。其中，在pH為7.0時最穩(wěn)定(圖6-b)。

a-最適pH; b-酶的pH穩(wěn)定性圖6 pH和酶的pH穩(wěn)定性對重組NiR酶活力的影響Fig.6 Effect of reaction pH and pH stability of the enzyme on NiR enzymes activity

2.5.2 溫度對酶活性的影響

由圖7-a可知，重組NiR最適溫度為37 ℃，在25～40 ℃時具有85%以上的相對酶活。在pH 6.5條件下，分別在不同溫度下孵育重組NiR，結(jié)果表明，該酶在4～40 ℃的溫度穩(wěn)定性較好，相對酶活保持在65%以上(圖7-b)，具有廣泛的溫度適應(yīng)性。

a-最適溫度；b-酶的熱穩(wěn)定性圖7 溫度和酶的熱穩(wěn)定性對重組NiR酶活力的影響Fig.7 Temperature and thermal stability of the enzyme on NiR enzymes activity

2.5.3 金屬離子及EDTA對酶活性的影響

Fe3+、Cu2+和Na+對重組NiR有促進(jìn)作用，其中Na+促進(jìn)作用明顯； Mg2+、Mn2+和Zn2+對該酶的酶活力有輕微抑制作用，該酶的酶活力被Al3+、EDTA和苯甲基磺酰氧(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)強(qiáng)烈抑制(表2)。

2.6 動力學(xué)分析

在標(biāo)準(zhǔn)方法和條件下，在pH 6.5和37 ℃下研究NiR動力學(xué)參數(shù)Km和Kcat。Km和Kcat的值分別為0.38 mmol/L和0.27×103s-1(圖8)。NiR的催化效率可以用kcat/Km計算，計算值為1.4×106mmol/(L·s)。

表2 金屬離子及EDTA對酶活性的影響Table 2 Effects of various reagents on the activity of NiR

注：數(shù)值為平均值±SD。

圖8 在pH 6.5和37 ℃下NiR降解NaNO2的動力學(xué)Fig.8 Kinetics of NiR degradation of nitrite at pH 6.5 and 37 ℃

3 討論

亞硝酸鹽還原酶大多數(shù)為胞內(nèi)酶，受分離純化技術(shù)的影響，該酶的應(yīng)用受到了極大限制[17]。E.coli表達(dá)系統(tǒng)具有成本低、繁殖快、表達(dá)量高、遺傳背景研究深入清楚以及有大量可利用的表達(dá)載體、宿主和純化系統(tǒng)等優(yōu)點(diǎn)，成為目前應(yīng)用最廣的表達(dá)體系[18-19]。但由于宿主蛋白的異源表達(dá)可能缺乏某些蛋白質(zhì)折疊所需的輔助因子或調(diào)節(jié)蛋白折疊機(jī)制及環(huán)境不適等，使次級鍵在折疊過程中較難正確形成，易形成失去原有蛋白質(zhì)特性和功能的包涵體[20-21]。本研究采用超聲波冰浴破壁法裂解細(xì)菌，細(xì)胞破壁效果較好，用洗滌液洗滌包涵體，經(jīng)變性液溶解變性，再經(jīng)復(fù)性液復(fù)性，最后用鎳親和層析法得到了濃度和純度較高的目的蛋白。

本實(shí)驗(yàn)中我們選擇了帶有NcoI酶切位點(diǎn)的表達(dá)載體pET-28a，該表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)C端有一個能編碼6個組氨酸的融合標(biāo)簽His-Tag，6×His通常不影響表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性，因而不必通過酶水解獲得目的蛋白，使表達(dá)的整個過程更為簡單，同時該融合標(biāo)簽可用于目的蛋白的檢測和純化。在融合標(biāo)簽His-Tag后還相連一個終止密碼子TGA，它保證了目的蛋白和His-Tag的完整表達(dá)[22-24]。截至目前，文獻(xiàn)報道亞硝酸鹽還原酶主要集中于甜菜、小麥、菠菜等植物中[17, 25]，而微生物亞硝酸鹽還原酶報道較少[26]。本研究成功將亞硝酸鹽還原酶基因連接至原核表達(dá)載體pET-28a上，然后將重組載體pET-28a-nir轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主E.coliBL21中，利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE檢測顯示為不可溶的包涵體表達(dá)，隨后進(jìn)行包涵體復(fù)性及鎳柱親和層析純化蛋白，并研究了重組NiR的性質(zhì)。結(jié)果表明，該酶具有廣泛的溫度適應(yīng)性和穩(wěn)定性，為NiR的應(yīng)用及工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。