口咽部正常菌群對(duì)肺炎支原體快速培養(yǎng)法試劑盒的影響

石連霞

摘要：目的? 觀察常見的口咽部正常菌群對(duì)肺炎支原體快速培養(yǎng)法試劑盒結(jié)果的影響，評(píng)價(jià)其臨床實(shí)用性和可靠性。方法? 用標(biāo)準(zhǔn)菌株和口咽部分離的臨床菌株作為研究對(duì)象，觀察不同細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)結(jié)果的影響。結(jié)果? 標(biāo)準(zhǔn)菌株肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、大腸埃希菌、白念珠菌在試劑盒中的培養(yǎng)陽(yáng)性率分別為0，10.00%，10.00%，10.00%，20.00%，臨床分離的野生型和耐藥型草綠色鏈球菌培養(yǎng)陽(yáng)性率分別為5.00%，80.00%;表皮葡萄球菌為15.00%，90.00%;肺炎克雷伯菌為25.00%，80.00%，白念珠菌為20.00%，85.00%;鮑曼不動(dòng)桿菌為90.00%，100.00%。除鮑曼不動(dòng)桿菌外其它四種耐藥型菌株的培養(yǎng)陽(yáng)性率明顯增高。結(jié)論? 口咽部若存在耐藥菌或多重耐藥菌以及對(duì)某些抗生素有天然耐藥機(jī)制的細(xì)菌時(shí)會(huì)造成肺炎支原體快速培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性，在試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告中應(yīng)注意其假陽(yáng)性的問題。

關(guān)鍵詞：肺炎支原體;快速培養(yǎng);假陽(yáng)性

中圖分類號(hào)：R446.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.11.053

文章編號(hào)：1006-1959（2019）11-0171-03

Abstract：Objective? To observe the effect of common oropharyngeal normal flora on the results of the rapid culture method of Mycoplasma pneumoniae and evaluate its clinical applicability and reliability.Methods? The clinical strains isolated from standard strains and oropharynx were used as research objects to observe the effects of different bacteria on the culture results. Results? The positive rates of standard strains of Streptococcus pneumoniae， Staphylococcus aureus， Haemophilus influenzae， Escherichia coli and Candida albicans in the kit were 0， 10.00%， 10.00%， 10.00%， 20.00%， clinical The positive rates of isolated wild-type and drug-resistant S. cerevisiae cultures were 5.00% and 80.00%， respectively; Staphylococcus epidermidis was 15.00%， 90.00%; Klebsiella pneumoniae was 25.00%， 80.00%， and Candida albicans was 20.00%，85.00%; Acinetobacter baumannii was 90.00%， 100.00%. The positive rate of culture of the four drug-resistant strains except Acinetobacter baumannii was significantly increased.Conclusion If there are resistant or multi-drug resistant bacteria in the oropharynx and bacteria with natural resistance to certain antibiotics， the results of the rapid culture method of mycoplasma pneumoniae will be false positive， and the problem of false positives should be noted in the test results report.

Key words：Mycoplasma pneumoniae;Rapid culture;False positive

肺炎支原體（mycoplasma pneumonia，MP）可引起氣管支氣管炎和肺炎，學(xué)齡期兒童和青壯年是易感人群。這種感染在每3～7年間可呈現(xiàn)地區(qū)性或世界范圍的流行。由于典型或非典型病原體引起的肺炎其臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果會(huì)不同，并且臨床常用的β內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)肺炎支原體無(wú)效，因此肺炎支原體肺炎獲得病原學(xué)診斷非常重要[1]。研究顯示，MP感染后 IgM抗體在1周后升高，在第3周達(dá)到峰值，其診斷MP敏感性為7.4%～33.3%，在部分成年患者中MP IgM可持續(xù)陰性。因此，如果將IgM檢查作為唯一的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)并不能提供正確的信息。與PCR方法相比時(shí)，收集呼吸道標(biāo)本采用培養(yǎng)法檢測(cè)MP敏感性為61.5%[2]。但是也有研究報(bào)道[3]，培養(yǎng)方法診斷MP感染時(shí)其不敏感性不能接受。國(guó)內(nèi)的一項(xiàng)研究報(bào)道[1]，兩種方法的陽(yáng)性率沒有區(qū)別。此外，診斷參數(shù)的價(jià)值包括特異性、敏感性、陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值以及陽(yáng)性似然比，培養(yǎng)法是3種方法中最高的[3]。然而，較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間影響了其臨床應(yīng)用價(jià)值。肺炎支原體快速培養(yǎng)法試劑盒其檢測(cè)原理是樣本洗脫在培養(yǎng)液中經(jīng)適宜溫度下恒溫培養(yǎng)，若標(biāo)本中含有肺炎支原體則快速繁衍增殖，通過快速生長(zhǎng)，其代謝產(chǎn)物分解葡萄糖產(chǎn)酸，使介質(zhì)pH值降低，培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色即為陽(yáng)性。既往研究顯示，肺炎支原體快速培養(yǎng)法比血清學(xué)檢測(cè)有更高的假陽(yáng)性率，有部分假陽(yáng)性樣本中能分離出一些臨床常見的口腔正常菌群或致病菌。本研究旨在利用標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離的耐藥菌研究不同細(xì)菌對(duì)MP快速培養(yǎng)法結(jié)果是否有干擾作用，以及不同采樣拭子對(duì)快速培養(yǎng)結(jié)果的影響。

1材料與方法

1.1一般資料? 選擇5株有溯源性的標(biāo)準(zhǔn)菌株和10株來(lái)自天津市寧河區(qū)醫(yī)院住院患者口咽部標(biāo)本分離的臨床菌株（野生型和耐藥型菌株各5株）作為研究對(duì)象，其中革蘭陽(yáng)性球菌6株，革蘭陰性桿菌6株，酵母菌3株。標(biāo)準(zhǔn)菌株來(lái)源于美國(guó)菌種保藏中心（ATCC），由天津市臨床檢驗(yàn)中心提供。臨床菌株分離自住院患者呼吸道標(biāo)本，所有菌株經(jīng)法國(guó)梅里埃Vitek 2compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定到種后留存?zhèn)溆?。質(zhì)控菌株ATCC15531肺炎支原體購(gòu)自美國(guó)MBL公司。

1.2試劑和儀器? 肺炎支原體6 h快檢試劑盒（快速培養(yǎng)法）購(gòu)自武漢菁華時(shí)間科技有限公司。MJX-250BⅢ細(xì)菌培養(yǎng)箱購(gòu)自天津泰斯特儀器有限公司。一次性塑料棉拭子為肺炎支原體快檢試劑盒配套產(chǎn)品，哥倫比亞血瓊脂平板購(gòu)自梅里埃（上海）生物制品有限公司，念珠菌顯色平板購(gòu)自鄭州安圖生物工程有限公司。

1.3方法? 將待檢菌株傳代分別接種至哥倫比亞血瓊脂平板和念珠菌顯色平板35℃孵育過夜，用無(wú)菌棉拭子挑取數(shù)個(gè)單菌落置于0.9%NaCl中制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海?xì)菌個(gè)數(shù)相當(dāng)于1.5×108/ml）。肺炎支原體試劑盒樣本取材操作步驟按照說明書進(jìn)行，將棉拭子在無(wú)菌生理鹽水中浸濕后沾取菌液，在試管內(nèi)壁擠壓拭子上多余的液體，然后將棉拭子放入培養(yǎng)小瓶?jī)?nèi)攪動(dòng)混勻數(shù)次，去除拭子的瓶外部分，旋緊瓶蓋（35±1）℃孵育箱中培養(yǎng)6 h，液體培養(yǎng)基由紅色變?yōu)榍辶恋狞S色為陽(yáng)性。培養(yǎng)液不變色或變淡為陰性，培養(yǎng)后試劑變黃色但是出現(xiàn)渾濁或出現(xiàn)絮狀物判斷為假陽(yáng)性。每次試驗(yàn)在質(zhì)控在控的情況下記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理? 使用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料多個(gè)率的比較采用行×列表的？字2檢驗(yàn)，多個(gè)樣本之間的兩兩比較采用多個(gè)樣本率之間的多重比較。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)肺炎支原體快速檢測(cè)試劑的影響? 本研究使用的5株ATCC來(lái)源的標(biāo)準(zhǔn)菌株中，肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、大腸埃希菌、白念珠菌在肺炎支原體快檢培養(yǎng)法試劑盒的培養(yǎng)陽(yáng)性率分別為0，10.00%，10.00%，10.00%，20.00%，各細(xì)菌間的培養(yǎng)陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（？字2=2.22，P=0.69）。

2.2臨床菌株對(duì)肺炎支原體快速檢測(cè)試劑的影響? 在臨床菌株試驗(yàn)中，5種細(xì)菌同時(shí)選擇野生型和耐藥型菌株進(jìn)行比較研究。對(duì)臨床常用抗生素全敏感的野生型菌株：草綠色鏈球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、白念珠菌在肺炎支原體快速檢測(cè)試劑中培養(yǎng)后結(jié)果陽(yáng)性率顯著低于耐藥型菌株（P<0.01）。野生型和耐藥型菌株比較，草綠色鏈球菌分別為5.00%，80.00%;表皮葡萄球菌為15.00%，90.00%;肺炎克雷伯菌為25.00%，80.00%，白念珠菌為20.00%，85.00%;各組兩兩比較統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P<0.01）。但鮑曼不動(dòng)桿菌野生型和耐藥型之間的培養(yǎng)陽(yáng)性率分別為90.00%，100.00%，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

3討論

針對(duì)肺炎支原體快速培養(yǎng)試劑盒的臨床研究有很多，但大多數(shù)集中在其與血清學(xué)抗體檢測(cè)、PCR法基因檢測(cè)等方法學(xué)的比較研究[4，5]。對(duì)快速培養(yǎng)法的敏感性、特異性的研究也有很多不同的報(bào)道。趙漢青等[6]研究顯示，從培養(yǎng)陽(yáng)性但PCR檢測(cè)陰性的標(biāo)本中進(jìn)行真菌和細(xì)菌16S rRNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)真菌污染是引起MP快速鑒定培養(yǎng)基特異性差的主要原因。郭義兵[7]研究發(fā)現(xiàn)，某些細(xì)菌能夠分解尿素，產(chǎn)生二氧化碳改變培養(yǎng)液PH值，從而影響結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)，不論是使用標(biāo)準(zhǔn)菌株還是臨床分離菌株，口咽部常見細(xì)菌和真菌如果對(duì)常用抗菌藥物敏感（主要是β內(nèi)酰胺類藥物），則對(duì)肺炎支原體6 h快速檢測(cè)試劑盒結(jié)果無(wú)明顯影響。如果培養(yǎng)液中加入的是對(duì)β內(nèi)酰胺類藥物耐藥的細(xì)菌或多重耐藥菌則會(huì)嚴(yán)重干擾檢測(cè)結(jié)果造成較高的假陽(yáng)性率，這可能是由于該試劑盒中加入的抗生素不能抑制所耐藥細(xì)菌有關(guān)。這與李昌慶等[8]的研究結(jié)果有所不同，其研究結(jié)果顯示，咽拭子中若含有口腔細(xì)菌則會(huì)使肺炎支原體培養(yǎng)假陽(yáng)性率增高。但該研究未明確口腔菌群是否為耐藥菌。因此，在結(jié)果判讀時(shí)，有必要將陽(yáng)性培養(yǎng)物涂片后革蘭染色鏡檢，這樣可在一定程度上排除耐藥性細(xì)菌和真菌對(duì)結(jié)果的干擾。

從本研究來(lái)看，肺炎支原體6 h快檢試劑對(duì)的口腔常見的對(duì)抗生素敏感的正常菌群和呼吸道常見致病菌有良好的抗干擾作用，而且酵母菌對(duì)該試劑培養(yǎng)結(jié)果也無(wú)明顯的影響。但是耐藥菌株增加了肺炎支原體培養(yǎng)的假陽(yáng)性。因此，在使用該試劑盒進(jìn)行MP培養(yǎng)時(shí)要注意口腔耐藥菌的影響。

參考文獻(xiàn)：

[1]Biondi E，McCulloh R，Alverson B，et al.Treatment of mycoplasma pneumonia：a systematic review[J].Pediatrics，2014，133（6）：1081-1090.

[2]Katsushima Y，Katsushima F，Suzuki Y，et al.Characteristics of Mycoplasma pneumoniae infection identified on culture in a pediatric clinic[J].Pediatr Int，2015，57（2）：247-252.

[3]Zhao F，Liu L，Tao X，et al.Culture-Independent Detection and Genotyping of Mycoplasma pneumoniae in Clinical Specimens from Beijing，China[J].PLoS One，2015，10（10）：e0141702.

[4]Ma YJ，Wang SM，Cho YH，et al.Clinical and epidemiological characteristics in children with community-acquired mycoplasma pneumonia in Taiwan：A nationwide surveillance[J].J Microbiol Immunol Infect，2015，48（6）：632-638.

[5]路暢，馬藝銘.快速血清學(xué)檢驗(yàn)和微生物快速培養(yǎng)檢測(cè)診斷小兒肺炎支原體感染的價(jià)值分析[J].臨床檢驗(yàn)雜志（電子版），2018，7（3）：382-383

[6]趙漢青，閆超，孫紅妹，等.肺炎支原體快速液體培養(yǎng)法的評(píng)價(jià)和存在的問題[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2016，36（7）：517-518.

[7]郭義兵.影響肺炎支原體液體培養(yǎng)假陽(yáng)性的因素分析[J].醫(yī)藥前沿，2016，6（13）：393-394.

[8]李昌慶，李岑，熊燕，等.肺炎支原體液體培養(yǎng)法的實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)評(píng)價(jià)[J].四川醫(yī)學(xué)，2016，37（12）：1362-1366.

收稿日期：2019-2-13;修回日期：2019-2-23

編輯/成森