Exendin-4對成年小鼠腦室下區(qū)神經(jīng)干細胞分化作用的體外研究*

趙 飛, 徐會友, 馬 柯, 江繼鵬, 張 健, 代 晨, 靳 穎, 李 平, 孫洪濤, 王振國△, 陳旭義△

(1. 錦州醫(yī)科大學研究生院， 遼寧 錦州 121000； 2. 武警特色醫(yī)學中心腦科中心， 武警部隊腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所， 天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復重點實驗室， 天津 300162)

成年哺乳動物大腦中的NSCs不斷產(chǎn)生新的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，這一過程被稱為成體神經(jīng)發(fā)生，主要發(fā)生在SVZ和海馬齒狀回[1]。在臨床上NSCs的這一能力提供了基于細胞的藥物療法，如帕金森病，阿爾茨海默病，亨廷頓舞蹈病和脊髓損傷[2]。但是，成熟腦中NSCs的行為仍知之甚少。理論上講，NSCs可以用于治療脊髓損傷和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病，因為分化的神經(jīng)元將有可能取代受傷的神經(jīng)元重建神經(jīng)回路。然而，實際情況中只有少數(shù)NSCs分化為神經(jīng)元，其大部分分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞[3]。研究如何促進NSCs分化為神經(jīng)元揭示其中所涉及的分子和信號通路的作用，對促進創(chuàng)傷和退行性神經(jīng)疾病治療的發(fā)展至關重要。

胰高血糖素樣肽-1 (glucagon-likepeptide1，GLP-1)是由腸道分泌的腸道胰島素，其增加細胞葡萄糖攝入以降低血糖[4]。最近的研究表明，GLP-1的功能不僅可以降低血糖，還可以作為神經(jīng)元存活，神經(jīng)突向外生長的神經(jīng)營養(yǎng)因子，保護突觸可塑性和記憶形成[5]。據(jù)報道，靜脈給予的GLP-1受體激動劑Ex-4可以穿過血腦屏障到達大腦發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)攝食，葡萄糖和脂質(zhì)代謝，控制體重，認知功能，心血管功能和情緒反應[6]。由于Ex-4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的多效性，我們開始研究Ex-4是否可以調(diào)節(jié)成熟小鼠腦SVZ中NSCs的增殖和分化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

5周齡C57BL/6J小鼠購于北京維通利華實驗動物有限公司(NO.2017-1218)。DMEM/F12培養(yǎng)基，堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)，表皮細胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)，B27無血清培養(yǎng)添加劑，0.25%胰蛋白酶/EDTA，Accutase酶等購自美國Hyclone公司，Ex-4購自美國Cayman公司，shRNA序列由中國上海Gene Pharma合成，BCA蛋白定量試劑盒，蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制，RIPA裂解液，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)購自美國Sigma公司，GLP-1R抗體，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體， GFAP抗體，β-tublin III抗體，nestin抗體，Western blot二抗和免疫熒光二抗購自美國Abcam公司，如無另行說明，其余試劑耗材購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 NSCs的提取培養(yǎng)

取5周齡C57BL/6J小鼠，分離側(cè)腦室的前壁置于補充有100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的PBS溶液中，在0.25%胰蛋白酶/ EDTA中消化機械解離。 通過70 μm細胞過濾器將細胞以800 r/min離心沉淀5 min。 然后將細胞重懸于含有1%B27， 20 ng/ml EGF和20 ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基中。 細胞培養(yǎng)3 d增殖形成神經(jīng)球。 用Accutase酶解離神經(jīng)球，取培養(yǎng)第3代的細胞用于實驗。

1.3 實驗設計

從5周齡C57BL/6J小鼠SVZ提取神經(jīng)球傳至第三代行免疫熒光染色鑒定nestin以及GLP-1R的表達，用不含細胞因子bFGF，EGF的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)以觀察其分化，在分化的第14日行β-tublin III，GFAP，GLP-1R和p-CREB的熒染色觀察。在敲低GLP-1R時，將靶序列以及對照序列包裝慢病毒載體，以40感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)配置含病毒的感染液，以105cells/ml的密度制備NSCs單細胞懸液接種于6孔板，加入6 μg/ml 的poly-brene于37℃，5%CO2條件下感染48 h，Western blot驗證shRNA的敲低效果。將細胞分為對照組，Ex-4組，GLP-1R 敲低組，GLP-1R敲低+Ex-4組，各組細胞用100 nmol/L Ex-4處理20 min后Western blot檢測細胞內(nèi)CREB的活化，在分化第14日行β-tublin III和GFAP的免疫熒光染色，用Image J軟件統(tǒng)計β-tublin III陽性細胞的比例，每組設置三個孔，每孔評估至少10個隨機區(qū)域。研究MAPK和PI3K通路時，將細胞以105cells/ml密度重懸于6孔板，將U0126以0.07 μmol/L預處理細胞30 min以抑制MAPK通路，將LY294002以50 μmol/L的濃度預處理2 h以抑制PI3K通路，將NSCs分為對照組，Ex-4組，U0126組，U0126+Ex-4組，LY294002組，LY-294002+U0126組，Ex-4處理24 h，Western blot檢測細胞中CREB的活化情況，每組設置三個孔。

1.4 shRNA敲低GLP-1R

GLP-1R shRNA靶序列是5'-GCCCTCAAGTGGATGTATAGC-3'。 ctrl shRNA序列5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'作為對照序列，由Gene Pharma公司合成并包裝慢病毒顆粒。按照MOI分為對照組，20，40，60組并分別制備含病毒載體的感染液，將NSCs以105cells/well用感染液制備成單細胞懸液接種于6孔板上，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)10 h后更換新鮮培養(yǎng)基。于48 h觀察各組熒光表達情況，確定最佳MOI的感染效率，加入不同濃度的poly-brene 2、3、6 μg/ml重復感染步驟，觀察細胞生長情況和感染效率，確定最佳MOI為40，最佳poly-brene濃度為6 μg/ml，使用此感染條件重復感染收集細胞，Western blot檢測GLP-1R的敲低。

1.5 免疫熒光檢測NSCs分化為神經(jīng)元的比例

分化培養(yǎng)14 d用PBS漂洗細胞三次，用4%多聚甲醛固定15 min后PBS漂洗三次。用含有 0.1%TritonX-100的PBS 室溫孵育20 min用PBS洗滌，室溫下5%BSA封閉1 h，將一抗4℃孵育過夜。本研究使用以下一抗：抗nestin抗體，抗GFAP抗體，抗β-tublin III抗體和抗p-CREB抗體。用PBS洗滌細胞三次，選擇合適的熒光二抗在室溫下溫育2 h，然后用DAPI染色細胞核。熒光顯微鏡觀察細胞。從三個不同的孔計數(shù)β-tublin III和GFAP陽性細胞的數(shù)量，每孔評估至少10個隨機區(qū)域?；贒API陽性細胞的總數(shù)來計算神經(jīng)元占總細胞的百分比。

1.6 Western blot檢測細胞表型及CREB的活化

用PBS漂洗細胞，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液。在幾次凍融循環(huán)收集裂解溶液，通過在13 000 r/min離心20 min提取總蛋白質(zhì)。使用BCA蛋白質(zhì)測定系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)濃度。通過SDS-PAGE分離蛋白，100 V轉(zhuǎn)膜90 min將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用10%脫脂牛奶在PBST(含有0.1%Tween-20的PBS)中封閉膜1h。將PVDF膜在4℃下與一抗孵育過夜，使用的一抗有：抗GLP-1R抗體，抗GFAP抗體，抗β-tublin III抗體，抗nestin抗體，抗CREB抗體，抗p-CREB抗體和抗GAPDH抗體。過夜孵育后用PBST洗滌三次，用對應的二抗室溫下溫育2 h。用PBST洗滌PVDF膜三次，用M5 Hiper ECL Western HRP發(fā)光液顯現(xiàn)PVDF膜上的蛋白采集圖片。用Image J軟件定量條帶的灰度值。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 Ex-4促進NSCs向神經(jīng)元分化

從成年C57BL/6J小鼠腦SVZ中分離的細胞懸浮培養(yǎng)，在第3日形成神經(jīng)球(圖1A)。免疫熒光染色觀察到NSCs中nestin陽性(圖1B)。在分化14 d，相比于對照組(圖2左)，100 nmol/L Ex-4的處理產(chǎn)生了更多神經(jīng)元樣的細胞(圖2右)。Western blot提示此時Ex-4組的神經(jīng)元標志物β-tublin III的表達升高(圖3)。

Fig.1Immunofluorescence identification of NSCs drived from SVZ

A: SVZ-derived neural stem cells derived from 5-week-old mice proliferate to form neurospheres in a medium containing B27, bFGF, and EGF (×100); B: NSCs were labeled with nestin and DAPI (×250)

Fig.2Cell morphology after 14 days of control (left) and Ex-4 (right), note the cells with more neuronal morphology in the right panel (×100)

Fig.3Expression of β-tublin III in control or Ex-4 group after 14 days of differentiation of NSCs

2.2 NSCs分化時神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中GLP-1R的表達

免疫熒光觀察到神經(jīng)球中nestin以及GLP-1R的陽性(圖4)。更換不含bFGF和EGF的培養(yǎng)基后NSCs開始分化，免疫熒光觀察到分化過程中nestin和GLP-1R的表達(圖5)。在分化的第14日，免疫熒光觀察到β-tublin III和GLP-1R的共標記，提示神經(jīng)元細胞中存在GLP-1R的表達(圖6)，GFAP和GLP-1R未發(fā)現(xiàn)共標記，提示神經(jīng)膠質(zhì)細胞中可能不存在GLP-1R的表達(圖7，圖4至圖7見彩圖頁Ⅱ)。

2.3 敲低GLP-1R后Ex-4對NSCs分化為神經(jīng)元的影響

為了研究Ex-4在NSCs分化中的作用，用shRNA敲低NSCs中的GLP-1R用Western blot檢測效果(圖8)。將敲低GLP-1R的NSCs用Ex-4處理分化14 d，用β-tublin III(灰色)和GFAP(紅色)標記細胞(圖9，見彩圖頁Ⅰ)。對每組β-tublin III陽性細胞的計數(shù)分析顯示，NSCs分化14 d時對照組僅有10%的神經(jīng)元，Ex-4組這一比例提升至22%，而GLP-1R 敲低+Ex-4組神經(jīng)元的比例為11%(表1)。這表明Ex-4促進NSCs向神經(jīng)元分化。

Fig.8NSCs after 48 h shRNA transfection(MOI=60, polybrene=6 μg/ml)

2.4 NSCs分化時Ex-4對CREB的活化作用

有研究指出Ex-4通過活化細胞內(nèi)CREB信號來產(chǎn)生神經(jīng)保護作用[7]。之前的研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1R在神經(jīng)元細胞中有所表達，但似乎不在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中表達。而CREB的活化狀態(tài)似乎也與之相關：Ex-4的處理可以顯著增加β-tublin III陽性細胞中CREB的活化(圖10，見彩圖頁Ⅱ)，GFAP陽性的星形膠質(zhì)細胞中沒有觀察到CREB的活化 (圖11，見彩圖頁Ⅱ)。Western blot數(shù)據(jù)表明，Ex-4可以顯著增加NSCs中CREB活化，敲低GLP-1R使Ex-4對CREB的活化作用消失(圖12，表1)。

Groupβ-tubulin III-positive cells (%)Activation of CREB (%)ctrl shRNA10.010±2.366100.167±7.985ctrl shRNA+Ex-422.333±2.875**445.833±19.793##GLP-1R shRNA10.963±2.71498.333±9.395GLP-1R shRNA+Ex-411.890±2.449100.833±10.187

**P<0.01vsGLP-1R shRNA+Ex-4 group;##P<0.01vsGLP-1R shRNA+Ex-4 group

Fig.12Effects of Ex-4 on CREB activation after knockdown of GLP-1R. NSCs were treated with 100 nmol/L Ex-4 for 20 minutes and Western blot was used to detect CREB activation. Representative Western blot were from three independent experiments

2.5 Ex-4通過PI3K途徑活化CREB發(fā)揮促其分化作用

有研究指出在人體的其他組織中，GLP-1R的活化通過PI3K和MAPK兩種途徑分別起不同的作用[8]，目前尚不清楚Ex-4如何活化NSCs中的CREB。本研究用U0126和LY294002分別阻斷了MAPK和PI3K途徑進一步研究了NSCs中CREB的活化狀態(tài)。數(shù)據(jù)表明，U0126的處理未對Ex-4介導的CREB活化產(chǎn)生影響(圖13，表3)，LY294002可以消除Ex-4對NSCs中CREB的活化作用(圖14，表3)，表明Ex-4可能通過PI3K途徑活化CREB以達到促進神經(jīng)元分化的作用。

Fig.13Activation of CREB after treated with U0126, NSCs were preincubated with 0.07 μmol/L U1026 for 30 min and then stimulated with 100 nmol/L Ex-4 for 20 minutes, p-CREB in each group was subsequently examined by western blot

Fig.14Activation of CREB after treated with LY294002, NSCs were preincubated with 50 μmol/L LY294002 for 2 h and then stimulated with 100 nmol/L Ex-4 for 20 minutes, p-CREB in each group was subsequently examined by western blot

Groupβ-tubulin III-positive cells (%)Activation of CREB (%)ctrl shRNA10.010±2.366100.167±7.985ctrl shRNA+Ex-422.333±2.875**445.833±19.793##GLP-1R shRNA10.963±2.71498.333±9.395GLP-1R shRNA+Ex-411.890±2.449100.833±10.187

**P<0.01vsU0126 group;##P<0.01vsDMSO+Ex-4 group

3 討論

促進腦SVZ的NSCs向神經(jīng)元分化是腦損傷，阿爾茨海默病等疾病治療的關鍵[9]。體外試驗證明Ex-4可促進成年C57BL/6J小鼠腦SVZ的NSCs向神經(jīng)元分化。分子生物學分析顯示Ex-4通過GLP-1R/PI3K/CREB途徑起作用。這表明GLP-1R激動劑在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷以及神經(jīng)退行性疾病中具有獨特的作用。

Ex-4已被證明可以增強胚胎干細胞產(chǎn)生胰島素的細胞分化[10]，然而，幾乎沒有證據(jù)表明Ex-4在CNS中具有再生活性。本研究證明了Ex-4具有調(diào)節(jié)成熟小鼠腦SVZ中NSCs活性的潛力。研究發(fā)現(xiàn)Ex-4的受體GLP-1R在成年小鼠腦SVZ中NSCs中的表達，且Ex-4的處理導致表達神經(jīng)元標記β-tublin III的細胞百分比增加。表明Ex-4可以促進NSCs向神經(jīng)元譜系分化。

有研究在多種模擬神經(jīng)元的細胞模型中證明了GLP-1R激動劑的神經(jīng)保護作用，例如過表達GLP-1R的人神經(jīng)母細胞瘤細胞系能夠免受氧化應激誘導的細胞死亡[11]。 GLP-1減少谷氨酸誘導的大鼠海馬神經(jīng)元死亡并保護PC12細胞免受甲基乙二醛誘導的氧化應激損傷等[12]。本研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)NSCs的分化過程中，正常分化為神經(jīng)元的細胞極少，其中大部分為神經(jīng)膠質(zhì)細胞。Ex-4的處理可以顯著提高NSCs分化為神經(jīng)元的比例。本研究觀察到在NSCs以及分化的早期GLP-1R的表達，在分化第14日，僅在神經(jīng)元細胞中觀察到GLP-1R表達，神經(jīng)膠質(zhì)細胞中似乎不存在GLP-1R的表達。有研究指出Ex-4可以通過GLP-1R活化細胞內(nèi)的CREB來保護神經(jīng)元的存活。本研究也觀察到Ex-4對神經(jīng)元中CREB的活化作用，而對神經(jīng)膠質(zhì)細胞中的CREB活性沒有影響。這一發(fā)現(xiàn)似乎能夠解釋Ex-4的促神經(jīng)分化作用：在分化的早期產(chǎn)生的神經(jīng)元細胞較多，隨著時間的延長神經(jīng)元逐漸被增殖的膠質(zhì)細胞所取代，Ex-4通過GLP-1R活化神經(jīng)元中的CREB從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，因此在分化的第14日仍能觀察到較多的神經(jīng)元細胞存活。

已有研究報道指出在外周神經(jīng)組織中CREB的活化可以產(chǎn)生神經(jīng)保護作用[13]，但目前尚不清楚在NSCs中Ex-4是通過何種途徑使CREB活化。研究表明，PI3K信號通路的阻斷使Ex-4的活化作用失效，但是阻斷MAPK途徑未使Ex-4的作用消失，表明Ex-4可以通過PI3K-CREB途徑促進神經(jīng)元的分化，維持其神經(jīng)表型。

總之，本研究證實了GLP-1R在成熟小鼠腦的SVZ中的表達，發(fā)現(xiàn)Ex-4可以顯著促進NSCs分化成神經(jīng)元表型。分子生物學研究顯示Ex-4通過GLP-1R/PI3K/CREB途徑起作用。這意味著GLP-1R激動劑對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷以及神經(jīng)退行性疾病具有獨特的治療作用。

致謝：衷心感謝武警特色醫(yī)學中心腦科研究所提供的細胞培養(yǎng)設備，Western blot電泳和顯影儀器、倒置顯微鏡以及熒光顯微鏡，感謝武警特色醫(yī)學中心全體師生的支持和幫助。