推拿對(duì)失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠的治療作用及其機(jī)制*

萬(wàn)小鳳， 唐成林， 趙丹丹， 安薈羽， 馬 翔， 譙童茜

(1. 重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院， 重慶 400016； 2. 中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400016)

骨骼肌是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的靶器官，一旦失去神經(jīng)支配，骨骼肌由于神經(jīng)的營(yíng)養(yǎng)作用喪失及自身廢用而發(fā)生萎縮，如不及時(shí)治療，將造成肢體功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及勞動(dòng)能力。由于神經(jīng)再生速度有限和失神經(jīng)肌萎縮的快速性、不可逆性，臨床治療上如何有效延緩失神經(jīng)肌萎縮將是一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。肌萎縮過(guò)程中，蛋白合成與蛋白降解之間的平衡被打破，肌蛋白分解率增加導(dǎo)致肌肉質(zhì)量顯著下降，肌纖維直徑減小[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)[3]，泛素蛋白酶體系統(tǒng)可調(diào)節(jié)肌原纖維蛋白的降解，在介導(dǎo)肌肉萎縮方面發(fā)揮著重要的作用，其中泛素蛋白連接酶 E3s(ubiquitin protein ligase E3s)是該系統(tǒng)的關(guān)鍵酶。肌肉環(huán)狀指基因1(muscle ring finger 1, MuRF1)和肌肉萎縮盒F基因(muscle atrophy F-box, MAFbx)作為泛素蛋白連接酶 E3s發(fā)揮作用，可導(dǎo)致肌球蛋白重鏈[4]和肌動(dòng)蛋白[5]等肌收縮蛋白的降解。蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)通過(guò)對(duì)叉頭框蛋白O(forkhead box O，F(xiàn)oxO)轉(zhuǎn)錄因子家族的抑制作用，來(lái)防止骨骼肌萎縮關(guān)鍵因子MuRF1和MAFbx的轉(zhuǎn)錄上調(diào)從而抑制蛋白質(zhì)降解[6-7]。最近的研究揭示microRNA(miRNA)在多種生物學(xué)和病理學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著基礎(chǔ)性作用[8-9]，包括對(duì)骨骼肌形態(tài)、功能等方面均具有重要的調(diào)節(jié)作用，其中miR-23a通過(guò)與MAFbx和MuRF1 mRNA的3'-UTR結(jié)合以抑制它們的翻譯，從而抵抗肌肉萎縮[10]。

運(yùn)用推拿治療肌肉方面的相關(guān)疾病，在臨床上取得了良好的效果，但其機(jī)制研究報(bào)道較少，推拿是否可以通過(guò)調(diào)控骨骼肌萎縮過(guò)程中miR-23a、Akt、MuRF1、MAFbx mRNA的表達(dá)進(jìn)而延緩骨骼肌蛋白降解，尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建立大鼠失神經(jīng)骨骼肌萎縮模型，觀察失神經(jīng)后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠的腓腸肌濕重比、肌纖維截面積和直徑的變化來(lái)判斷推拿干預(yù)對(duì)失神經(jīng)肌萎縮大鼠的治療作用，并通過(guò)觀察推拿對(duì)腓腸肌中miR-23a、Akt、MuRF1、MAFbx mRNA表達(dá)的影響，從蛋白質(zhì)降解角度探討推拿延緩失神經(jīng)肌萎縮的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)選取8周齡清潔級(jí)健康雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量250 ～280 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(川)2015-030。飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心IVC級(jí)動(dòng)物房，按照每籠5只飼養(yǎng)，室溫(22±2)℃，相對(duì)濕度50%～60%，明暗12 h交替，大鼠自由攝取飲食。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol總RNA提取試劑(北京天根生化科技有限公司)、RR047A反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq TMⅡ、Akt、MuRF1、MAFbx、β-Actin、miR-23a、U6引物合成(日本TAKARA公司)、AL204型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)、冰凍切片機(jī)(德國(guó) LEICA公司)、BX 53普通正置顯微鏡、CellSens Standard圖像采集軟件(日本OLYMPUS公司)、Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件、低溫高速離心機(jī)(SIGMA 公司)、Thermo ND 2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀(上海GENE公司)、T 100TMPCR儀(美國(guó)BIO RAD公司)、CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)BIO RAD公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及模型制備

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、推拿組，每組24只。每組大鼠用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，右股部手術(shù)區(qū)域常規(guī)備皮、消毒、鋪巾。無(wú)菌條件下于右后肢股后外側(cè)切口，沿臀大肌間隙鈍性分離、暴露坐骨神經(jīng)分岔處，找到脛神經(jīng)切斷，造成1 cm神經(jīng)缺損。模型由同一人同手法操作以減少實(shí)驗(yàn)誤差。

1.4 干預(yù)方法

除0 d推拿組以外，推拿組在術(shù)后第2日開始手法治療。于每日14：00進(jìn)行干預(yù)治療，先用自制的頭套將大鼠的頭部套住，待其情緒穩(wěn)定后，由專人沿著腓腸肌方向用拇指按揉法進(jìn)行推拿干預(yù)。標(biāo)準(zhǔn)：推拿手法緩和，均勻持久，2 000次，120～140次/分，每天治療1次，每次約15 min，推拿時(shí)以大鼠不亂動(dòng)亂叫的安靜狀態(tài)為標(biāo)準(zhǔn)，并以此作為老鼠的最佳刺激量，如果推拿期間大鼠亂動(dòng)可待其安靜后繼續(xù)推拿。模型組除不進(jìn)行推拿外，其他同推拿組。

1.5 標(biāo)本采集

模型組和推拿組分別于術(shù)后0 d(術(shù)后立即取材)、7 d、14 d、21 d隨機(jī)抓取6只動(dòng)物取材。大鼠10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，無(wú)菌條件下完整剝離雙側(cè)腓腸肌，PBS緩沖液沖洗后吸干肌肉表面殘留液體。將術(shù)側(cè)腓腸肌組織分為兩份，一份迅速放入液氮罐中，-80℃冰箱儲(chǔ)存待測(cè)；另一份4%多聚甲醛固定，用于形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

1.6 腓腸肌濕重比

取材時(shí)觀察術(shù)側(cè)腓腸肌萎縮情況，包括肌肉飽滿度、色澤等。觀察后完整取下雙側(cè)腓腸肌，用電子天平稱取雙側(cè)腓腸肌濕重，以自身健側(cè)作為對(duì)照，計(jì)算腓腸肌濕重比。

1.7 肌纖維截面積及直徑

腓腸肌4%多聚甲醛固定24 h，蔗糖梯度脫水3 d后送至重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織切片室完成HE染色，400倍光學(xué)顯微鏡觀察，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算肌纖維截面積和直徑。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腓腸肌Akt、MuRF1、MAFbx、miR-23a mRNA表達(dá)

-80℃冰箱取出冰凍保存的腓腸肌組織樣本約50 mg，與Trizol液充分研磨，加氯仿萃取，提取組織上清后加入等體積異丙醇離心沉淀，75%酒精漂洗3次后晾干，加入DEPC水待檢。檢測(cè)總RNA濃度及純度后按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟配制反應(yīng)體系，于T 100TMPCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按照SYBR Green法配制反應(yīng)體系后上機(jī)進(jìn)行qPCR反應(yīng)。CFXmanager 3.1軟件讀取Ct值后計(jì)算2-△△Ct。上下游引物序列見表1。

Tab. 1 Primer sequences of RT-PCR

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肌濕重比

0 d的模型組和推拿組腓腸肌肌肉飽滿紅潤(rùn)。隨著失神經(jīng)支配時(shí)間的延長(zhǎng)兩組術(shù)側(cè)腓腸肌均呈進(jìn)行性萎縮且色澤欠佳，肌濕重比逐漸下降，均顯著低于0 d(P<0.01)。失神經(jīng)7 d，濕重比下降明顯，隨后減緩，除0 d外，推拿組的肌濕重比均顯著高于模型組(P<0.05，表2)。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

HE染色光鏡下0 d模型組和推拿組骨骼肌橫切面可見肌細(xì)胞較大，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核緊貼于肌纖維的胞膜邊緣，細(xì)胞間隙較小；隨著失神經(jīng)支配時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組與推拿組肌細(xì)胞大小與0 d相比明顯縮小，細(xì)胞大小不一，形態(tài)不規(guī)則；推拿組與模型組比較，推拿組(除0 d外)細(xì)胞間隙明顯比模型組小，細(xì)胞大小較為均一(圖1 ，見彩圖頁(yè)Ⅰ)。切片后統(tǒng)計(jì)肌纖維截面積和直徑可知，0 d模型組和推拿組之間肌纖維截面積和直徑無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05)，7 d、14 d、21 d推拿組肌纖維橫截面積均顯著高于模型組(P<0.05，P<0.01，表3)，7 d、14 d、21 d推拿組肌纖維直徑均顯著高于模型組(P<0.05，P<0.01，表4)。

2.3 miR-23a、Akt、MuRF1、MAFbx基因相對(duì)表達(dá)量

腓腸肌中MuRF1、MAFbx、Akt、miR-23a mRNA表達(dá)在0 d時(shí)模型組與推拿組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與0 d比較，隨著失神經(jīng)支配時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組和推拿組 MuRF1、MAFbx、Akt mRNA表達(dá)均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在第7日時(shí)達(dá)到高峰，隨后有所下降，21 d時(shí)模型組Akt mRNA表達(dá)接近0 d水平；其中7 d、21 d推拿組MuRF1 mRNA表達(dá)均顯著低于模型組(P<0.05，P<0.01，表5)，7 d、14 d、21 d推拿組MAFbx mRNA表達(dá)均顯著低于模型組(P<0.01，P<0.05，P<0.01，表6)，7 d、14 d、21 d推拿組Akt mRNA表達(dá)均顯著高于模型組(P< 0.05，P<0.01，表7)；與0 d比較，模型組和推拿組21 d(由于失神經(jīng)支配早期，肌肉中miRNA表達(dá)不顯著，故未選取7 d、14 d做檢測(cè))時(shí)miR-23a mRNA表達(dá)升高，推拿組miR-23a mRNA表達(dá)顯著高于模型組(P<0.05，表8)。

3 討論

中醫(yī)傳統(tǒng)認(rèn)為，失神經(jīng)導(dǎo)致的骨骼肌萎縮屬于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的“痿癥”范疇，推拿手法作為中國(guó)的傳統(tǒng)療法，是延緩失神經(jīng)肌萎縮的一種有效治療手段[11]。其通過(guò)手法對(duì)人體體表的刺激及產(chǎn)生熱效應(yīng)，從而加速氣血的運(yùn)行，起到疏通經(jīng)絡(luò)、行氣活血的作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)，推拿可以提高坐骨神經(jīng)損傷大鼠的痛覺敏感程度，有效抑制所出現(xiàn)的神經(jīng)源性疼痛；能夠提高患側(cè)腓腸肌的肌力及肌肉恢復(fù)率，從而促進(jìn)坐骨神經(jīng)損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能和感覺功能的恢復(fù)[13]。推拿還可以通過(guò)影響胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(insulin-like growth factor receptor I, IGF-I)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、生肌決定因子(MyoD)的表達(dá)，改變骨骼肌微環(huán)境，間接促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、分化，從而延緩骨骼肌的萎縮[14]。

Tab. 2 The wet weight ratio of the model groups and the massage groups for 0 d，7 d，14 d，21 d n =6 )

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vs0 d model group;△△P<0.01vs0 d massage group

Tab. 3 Cross-sectional area of the model groups and the massage groups for 0 d，7 d，14 d，21 d (μm2， n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vs0 d model group;△△P<0.01vs0 d massage group

Tab. 4 Diameter of the muscle fiber of the model groups and the massage groups for 0 d，7 d，14 d，21 d (μm， n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vs0 d model group;△△P<0.01vs0 d massage group

Tab. 5 The relative expression levels of MuRF1 in the gastrocnemius muscle of the model groups and the massage groups for 0 d，7 d，14 d，21 d n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vs0 d model group;△△P<0.01vs0 d massage group

Tab. 6 The relative expression levels of MAFbx in the gastrocnemius muscle of the model groups and the massage groups for 0 d，7 d，14 d，21 d n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vs0 d model group;△△P<0.01vs0 d massage group

Tab. 7 The relative expression levels of Akt in the gastrocnemius muscle of the model groups and the massage groups for 0 d，7 d，14 d，21 d n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vs0 d model group;△△P<0.01vs0 d massage group

Group0 d7 dModel1.029±0.2571.850±0.829#Massage1.038±0.2892.770±0.698*△△

*P<0.05vsmodel group;#P<0.05vs0 d model group;△△P<0.01vs0 d massage group

骨骼肌一旦失神經(jīng)支配后,肌肉收縮功能就會(huì)喪失,血液淤積于靜脈系統(tǒng)內(nèi),有毒代謝產(chǎn)物增多,泛素蛋白酶體系統(tǒng)被啟動(dòng)，導(dǎo)致MAFbx、MuRF1的上調(diào)，從而引起肌肉蛋白降解[15-17]，當(dāng)?shù)鞍捉到獯笥诤铣?，肌萎縮發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)[18-19]，去神經(jīng)支配、糖皮質(zhì)激素、禁食、糖尿病和癌癥引起肌肉萎縮時(shí), 都能誘導(dǎo)MuRF1 和MAFbx的表達(dá)。敲除小鼠骨骼肌中MAFbx或MuRF1可以減輕由失神經(jīng)支配誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮程度，抑制肌肉重量的下降。這兩種基因?qū)铀偌∪獾鞍踪|(zhì)丟失以及通過(guò)蛋白質(zhì)分解調(diào)節(jié)肌肉的大小至關(guān)重要。Sacheck[20]等研究表明, 在失神經(jīng)早期，MAFbx、MuRF1 mRNA被大量誘導(dǎo)，且都出現(xiàn)在肌肉質(zhì)量顯著下降之前;王鵬飛[21]等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MAFbx的表達(dá)也在失神經(jīng)早期迅速升高，2周之后開始下降，與骨骼肌濕重下降速率相平行，表明二者的基因表達(dá)與骨骼肌萎縮關(guān)系密切。Akt通過(guò)促進(jìn)FoxO的磷酸化使其失活，阻止FoxO依賴性萎縮相關(guān)基因MAFbx和MuRF1的表達(dá)來(lái)抑制骨骼肌中蛋白質(zhì)的降解[8、22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因鼠中肌肉特異性過(guò)表達(dá)Akt會(huì)抑制蛋白質(zhì)降解，促使肌肉肥大且肌肉力量增加[24]，而當(dāng)Akt活性受到抑制時(shí)，下游的FoxO、MuRF1、MAFbx表達(dá)上升導(dǎo)致蛋白降解增加，骨骼肌萎縮[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，骨骼肌失神經(jīng)支配過(guò)程中，Akt mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，失神經(jīng)支配7 d時(shí)，MuRF1、MAFbx mRNA表達(dá)量顯著升高，隨后有所下降，其表達(dá)趨勢(shì)與文獻(xiàn)報(bào)道相一致；與模型組比較，推拿干預(yù)后Akt mRNA表達(dá)水平顯著升高，MuRF1、MAFbx mRNA表達(dá)水平顯著降低，提示推拿手法可能通過(guò)抑制大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌中蛋白降解速率來(lái)延緩失神經(jīng)肌萎縮。

目前，對(duì)骨骼肌中的 miRNA是miR-1、miR-133 和 miR-206研究相對(duì)較多，它們對(duì)控制骨骼肌細(xì)胞的增殖和分化具有重要作用[26-27]，而對(duì)miR-23a研究相對(duì)較少。研究發(fā)現(xiàn)[28]，在失神經(jīng)支配肌肉中的miRNA誘導(dǎo)會(huì)出現(xiàn)延遲，失神經(jīng)支配后3 d是肌肉尚未萎縮的時(shí)間，其特征在于萎縮相關(guān)基因誘導(dǎo)的高峰，而miRNA主要受抑制。在失神經(jīng)支配7 d之后，肌肉已經(jīng)萎縮并且誘導(dǎo)miRNA參與萎縮程序的微調(diào)。Ching-Hua Hsieh[29]等人在失神經(jīng)支配4個(gè)月的大鼠比目魚肌中發(fā)現(xiàn)大量miRNA普遍上調(diào)和大量轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的差異性下調(diào)，其中miR-23a呈現(xiàn)高表達(dá)。Shogo Wada[10]等人通過(guò)生物信息學(xué)的方法鑒定MAFbx和MuRF1是miR-23a潛在的靶標(biāo)，并在實(shí)驗(yàn)中證明，miR-23a與MAFbx、 MuRF1的 3’-UTRs相互作用以抑制其翻譯,從而抵抗肌肉的萎縮。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，失神經(jīng)21 d時(shí)推拿組miR-23a mRNA表達(dá)量高于模型組，由于miR-23a可以對(duì)MuRF1、MAFbx的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行微調(diào)節(jié)，說(shuō)明推拿可能通過(guò)促進(jìn)miR-23a mRNA的表達(dá)，在一定程度上可以減少蛋白質(zhì)的降解，從而延緩失神經(jīng)肌萎縮。

綜上所述，骨骼肌失神經(jīng)支配后，MuRF1、MAFbx mRNA表達(dá)的增加會(huì)加速骨骼肌蛋白的降解，加劇肌肉萎縮的進(jìn)程，推拿可通過(guò)上調(diào)miR-23a、Akt mRNA的表達(dá)，來(lái)抑制MuRF1、MAFbx mRNA的表達(dá)，減少骨骼肌蛋白的降解，這可能是推拿能有效延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的機(jī)制之一，其可為臨床治療提供理論依據(jù)，進(jìn)而推廣使用這一優(yōu)秀傳統(tǒng)療法。