缺氧誘導因子-1α與血管內皮生長因子及其受體2在大鼠3期壓力性損傷皮膚組織中的表達及意義*

王曉慧, 陳孝萍, 王紅萍, 潘瑩瑩, 姜麗萍△

(1. 上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院, 上海 200092； 2. 溫州醫(yī)科大學護理學院， 浙江 溫州 325000)

壓力性損傷(pressure injury，PI)是臨床長期臥床、脊髓損傷等患者常見并發(fā)癥，3期壓力性損傷是其中一個重要分期，主要表現(xiàn)為全層皮膚缺損，?？梢娖は轮窘M織、肉芽組織和傷口邊緣內卷；無筋膜，肌肉，肌腱，韌帶，軟骨和骨頭暴露；可有腐肉和或焦痂[1]。當前臨床上針對3期PI仍缺乏有效的治療手段，究其原因主要由于其形成機制尚未完全明確。目前認為，PI發(fā)生的本質是局部組織長期受壓，引起局部組織缺血缺氧、血液循環(huán)障礙，最終導致組織壞死。因此，微循環(huán)障礙在PI發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，而促進局部組織血管再生是促進PI愈合的一種重要思路。作為一種核轉錄因子，缺氧誘導因子-1α( hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)可通過調控下游多種靶基因參與機體血管生成、細胞增殖和遷移、細胞凋亡等病理生理過程，在創(chuàng)面愈合過程中具有重要意義。HIF-1α-VEGF-KDR是一條調控局部組織血管再生的經(jīng)典信號通路，但目前大部分研究主要關注其在糖尿病潰瘍、下肢靜脈潰瘍等慢性難愈性創(chuàng)面中的作用[2-4]，針對HIF-1α及下游靶基因在3期PI皮膚組織中的表達及促修復作用尚未見報道。因此，本實驗通過分析HIF-1α、VEGF與KDR在大鼠局部受壓皮膚組織中的表達，闡明缺氧和血管生成在3期PI形成中的作用及相互關系，初步探討3期PI的難愈機制。

1 材料與方法

1.1 材料

40只清潔級成年雄性SD大鼠體重300～350 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，許可證號：SOXK(滬)2007-0005。兔源性HIF-1α多克隆一抗購自NOVUS公司，鼠源性KDR單克隆一抗購自abcam公司，鼠源性VEGF多克隆一抗、鼠源性單克隆Actin一抗均購自Santa Cruz公司，山羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)二抗，山羊抗鼠-HRP二抗均購自美國Bioworld公司。Eclipse 80i型光學顯微鏡購自日本尼康公司，ChemiDoc XRS型凝膠成像儀、Mini-PROTEAN型電泳儀均購自美國Bio-Rad公司，F(xiàn)6/10型電動勻漿器購自德國FLUKO公司。

1.2 動物分組及處理

大鼠室溫分籠飼養(yǎng)，自由飲水進食，實驗前適應性喂養(yǎng)1周。將大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、受壓3 d組、受壓5 d組、受壓7 d組、受壓9 d組，每組8只。正常對照組大鼠不做任何處理，后4組大鼠參照文獻[5]的方法，應用缺血/再灌注磁片循環(huán)壓迫的方式，在大鼠兩側后肢股薄肌處建立深部組織損傷模型(受壓3 d組)和壓力性損傷模型(另3組)，以體現(xiàn)3期壓力性損傷形成及發(fā)展的過程。實驗中選擇表面磁通量為1.758×10-5wb的永久性圓片形磁鐵，直徑8 mm，厚度4 mm，質量2.4 g，購于浙江省東磁研究所。在壓力檢測顯示(5.0 ±2.0)mm厚度的條件下，肌肉所受到的壓強約40 kpa。受壓3 d組大鼠僅受壓3個循環(huán)(受壓12 h、放松12 h為1個循環(huán)，每天實施1個循環(huán))；受壓5 d組、受壓7 d組、受壓9 d組大鼠在受壓3個循環(huán)后，使用無菌刀片，統(tǒng)一劃破受壓皮膚，深度至真皮層，后繼續(xù)分別施壓至5、7、9個循環(huán)。

1.3 標本采集

受壓3 d組大鼠于受壓3 d后(正常對照組大鼠于相同時間點)，另3組大鼠分別于受壓5、7、9 d后，腹腔注射100 g/L水合氯醛(300 mg/kg)麻醉。置于冰上迅速切取雙側股薄肌中心部位處的全層皮膚組織，大小為0．5 cm×0．5 cm。生理鹽水洗凈血液，40 g/L多聚甲醛固定、脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片(厚度為0．5 μm)。另同前切取部分皮膚組織約1 g，生理鹽水洗凈血液，濾紙吸干水分并剪碎，于 -80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取材完畢后腹腔注射過量100 g/L水合氯醛處死大鼠。

1.4 皮膚組織形態(tài)學觀察

取大鼠皮膚組織石蠟切片，常規(guī)HE染色，200倍光學顯微鏡下觀察皮膚組織形態(tài)學變化。

1.5 VEGF蛋白表達

采用免疫組織化學法檢測。另取各組大鼠皮膚組織切片，常規(guī)脫蠟脫水，加入體積分數(shù)3%過氧化氫-甲醇溶液抑制內源性過氧化物酶，室溫放置30 min。10 g/L牛血清白蛋白室溫封閉30 min，滴加鼠源性VEGF多克隆一抗，濕盒4℃過夜。滴加山羊抗鼠-HRP二抗，濕盒37℃孵育2 h，PBS沖洗3次，每次5 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。200倍光學顯微鏡下觀察VEGF蛋白表達 (棕黃色)。采用Image．Pro Plus 6．0圖像分析軟件(美國Media Cy-bernetics公司)分析每平方毫米組織中的VEGF陽性蛋白表達量(以灰度值表示)。

1.6 HIF-1α、VEGF、KDR蛋白表達

采用蛋白質印跡法檢測，以Actin作為內參照。將凍存的各組大鼠皮膚組織剪碎，加裂解液勻漿后，離心取上清液，應用考馬斯亮藍法測定提取的蛋白濃度。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后轉印至聚偏二氟乙烯膜上。50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入兔源性HIF-1α多克隆一抗、鼠源性VEGF多克隆一抗、鼠源性KDR單克隆一抗、鼠源性單克隆Actin一抗4℃過夜。洗滌后加入山羊抗兔-HRP二抗、山羊抗鼠-HRP二抗，室溫孵育2 h?；瘜W發(fā)光、顯影，凝膠圖像分析系統(tǒng)行灰度掃描分析，結果以HIF-1α與Actin灰度值、VEGF與Actin、KDR與Actin的比值表示。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 皮膚組織形態(tài)

正常對照組大鼠皮膚為復層鱗狀上皮，皮膚結構清晰，血管數(shù)量豐富，膠原纖維排列整齊，無明顯炎性細胞浸潤；受壓3 d組上皮層次清晰，血管數(shù)量較正常對照組減少，膠原纖維排列有序，炎癥細胞開始浸潤；受壓5 d組大鼠上皮層次較清晰，血管數(shù)量較受壓3 d組減少，膠原纖維排列紊亂，炎性細胞浸潤增強；受壓7 d組上皮增厚，血管數(shù)量較受壓5 d組減少，膠原纖維排列紊亂，炎性細胞大量浸潤；受壓9 d組上皮厚度明顯增加，血管數(shù)量少，膠原纖維排列紊亂，炎性細胞浸潤明顯(圖1)。上述結果表明，皮膚組織損傷造模成功。

Fig.1Skin tissue morphology of the gracilis in each group of rats (HE ×200)

2.2 免疫組化檢測VEGF蛋白表達

正常對照組、受壓3 d組、受壓5 d組、受壓7 d組、受壓9 d組大鼠皮膚組織中VEGF蛋白表達量分別為4.27±0.14、5.72±0.15、4.21±0.13、4.01±0.04、3.93±0.07。受壓3 d組大鼠皮膚組織中VEGF蛋白表達較正常對照組明顯增高(P<0.01)，隨著受壓時間延長，VEGF蛋白表達逐漸減少，受壓5 d組、受壓7 d組和受壓9 d組大鼠皮膚組織中VEGF蛋白表達量均明顯低于正常對照組(P< 0.05)。

2.3 Western blot 檢測HIF-1α蛋白表達

受壓3 d組大鼠皮膚組織中HIF-1α蛋白表達量明顯高于正常對照組(P<0.01)，受壓5 d組皮膚組織HIF-1α蛋白表達量較正常對照組明顯增高(P<0.05)，受壓7 d組皮膚組織HIF-1α蛋白表達量較正常對照組增高(P>0.05)，受壓9 d組皮膚組織HIF-1α蛋白表達量與正常對照組相近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖3，表1)。

Fig.2Immunohistochemistry was used to detect the expression of vascular endothelial growth factor protein (VEGF) in the skin tissue of the gracilis of rats in each group (Diaminobenzidine-hematoxylin ×200)

2.4 Western blot 檢測VEGF蛋白表達

受壓3 d組大鼠皮膚組織中VEGF蛋白表達量較正常對照組明顯增高(P<0.01)；受壓5 d組、受壓7 d組大鼠皮膚組織中VEGF蛋白表達量與正常對照組相近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，受壓9 d組大鼠皮膚組織中VEGF蛋白表達量低于正常對照組(P<0.05，圖3，表1)。

2.5 Western blot 檢測KDR蛋白表達

受壓3 d組大鼠皮膚組織中KDR蛋白表達量較正常對照組明顯降低(P<0.05)；受壓5 d組、受壓7 d組和受壓9 d組大鼠皮膚組織KDR蛋白表達量明顯均低于正常對照組(P均<0.01，圖3，表1)。

Fig.3The expressions of KDR, VEGF and HIF-1α in the gracilis in each group of rats were detected by Western blot

1: Normal control group; 2: 3 d group; 3: 5 d group; 4: 7 d group; 5: 9 d group

Group HIF-1α VEGF KDRControl0.92±0.131.23±0.161.86±1.483 d1.71±0.18** 1.68±0.16**1.33±1.09*5 d1.22±0.18*1.18±0.141.05±0.72**7 d1.12±0.071.02±0.050.79±0.28**9 d0.91±0.180.93±0.09*0.54±0.71**

HIF-1α: Hypoxia-inducible factor-1α; VEGF: Vascular endothelial growth factor; KDR: Kinase insert domain receptor

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

3 討論

3期壓力性損傷主要特點是形成開放性創(chuàng)面，病程長，愈合慢，且極易惡化，嚴重影響患者生活質量。研究表明[6]，局部組織微循環(huán)障礙是導致創(chuàng)面愈合減慢的重要原因之一。HIF-1α是誘導細胞對低氧適應的重要轉錄因子，也是參與血管生成的重要調控因子。因此，分析HIF-1α、VEGF和KDR等血管生成調節(jié)因子在大鼠局部受壓皮膚組織中的表達及變化，可為3期壓力性損傷形成機制研究奠定堅實基礎。

血管是組織細胞氧氣和營養(yǎng)物質重要來源，局部組織缺血導致微環(huán)境中氧氣和營養(yǎng)物質缺乏被認為是創(chuàng)面愈合減慢的重要原因[7]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)為一種可通過刺激血管內皮增殖和遷移，改變血管通透性，促進血管生成的重要調節(jié)因子，是血管生成的重要標記物[7]。本研究HE染色結果顯示，隨著受壓時間延長，組織損傷程度逐漸加重，大鼠局部受壓皮膚組織出現(xiàn)逐步退化病理現(xiàn)象，表現(xiàn)為表皮不斷增厚，血管數(shù)量不斷減少，和黃芳[8]等研究結果一致。組織形態(tài)學變化說明在相同壓力下，組織損傷程度主要與受壓時間密切相關。免疫組化結果顯示，VEGF在受壓3 d組表達增加，隨著受壓時間延長，表達逐漸降低，血管數(shù)量變化趨勢和HE染色結果一致，提示及時解除壓力及促進血管再生改善組織微循環(huán)是防止局部組織損傷進一步惡化的重要舉措。

HIF-1α是參與缺氧應答反應的關鍵轉錄因子，也是缺氧環(huán)境下血管生成的核心調控因子，參與缺氧受損組織中血管生成的整個過程。研究顯示[9]，在正常有氧環(huán)境下，HIF-1α因降解增加和轉錄抑制處于低濃度狀態(tài)；當組織細胞缺氧時，HIF-1α通過各種缺氧應答基因的刺激迅速激活并呈高度表達狀態(tài)。Milad和Chang研究發(fā)現(xiàn)[2,10]，在老年人缺血性傷口和糖尿病潰瘍中，HIF-1α表達極少，引起新生血管數(shù)量減少，是導致傷口愈合減慢的重要原因。而目前國內關于HIF-1α在壓力性損傷創(chuàng)面形成過程中表達變化的研究鮮有報道。本實驗WB結果顯示，正常對照組HIF-1α蛋白表達較少，受壓3 d組蛋白表達明顯增加，說明在外源性壓力的作用下，局部組織出現(xiàn)缺血缺氧，局部低氧刺激HIF-1α蛋白表達，與馮帥南[11]和LIU[12]等研究結果一致。從受壓5 d起，各組大鼠皮膚組織HIF-1α蛋白表達開始減少，且隨受壓時間延長，組織損傷程度越來越嚴重，而HIF-1α表達水平逐漸下降，提示HIF-1α蛋白表達減少可能是引起Ⅲ期壓瘡愈合減慢的重要因素之一。研究表明[13]，在糖尿病傷口中，高血糖產(chǎn)生的糖基化產(chǎn)物可能是抑制HIF-1α表達的重要因素之一。而在3期壓力性損傷中HIF-1α蛋白表達減少的機制目前尚不清楚，有待于進一步探討。

VEGF是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，KDR是VEGF主要功能受體，兩者結合后可上調環(huán)氧化酶和NO表達，加強內皮祖細胞向缺血部位遷移，促進內皮細胞的分裂、增殖，增加微血管通透性，促進血管再生[14]。

目前已知，VEGF的表達受多種因素的調控，缺氧、癌基因、細胞因子和炎癥因子、硫酸肝素等均對其具有重要調節(jié)作用[15]。在長期受壓引起的壓力性損傷中，缺血缺氧是一種常見的狀態(tài)[16]。研究表明[3]，VEGF和KDR是HIF-1α下游重要的靶基因，在缺氧條件下HIF-1α可通過作用于VEGF和KDR編碼基因調控區(qū)的缺氧反應元件結合位點，增加VEGF和KDR mRNA表達并增強mRNA穩(wěn)定性。李慶勇[17]在顱腦損傷動物研究中發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可誘導腦創(chuàng)傷后VEGF蛋白表達，使用HIF-1α特異性抑制劑2-ME-2 進行干預后，VEGF表達明顯下降。本實驗中，VEGF和HIF-1α表達趨勢一致，受壓3 d組VEGF表達較正常對照組表達增加，說明機體在早期局部低氧的刺激下啟動自身保護機制，HIF-1α高表達后通過上調下游VEGF表達促進血管新生，誘導局部組織對低氧的適應，防止組織損傷進一步惡化。從受壓5 d開始，隨著受壓時間延長，HIF-1α表達降低，相應引起下游VEGF和KDR蛋白含量逐漸下降，表明持續(xù)性壓力引起局部組織缺血缺氧已超過機體自身代償機制，低氧誘導的新生血管已不能滿足組織自身修復的需要，對機體造成不可逆性損傷。本實驗中，免疫組化顯示VEGF蛋白表達部位，說明局部損傷皮膚組織血管調控蛋白的變化，其表達趨勢和WB一致，同時使用兩種方法論證3期PI形成、發(fā)展過程中VEGF的表達變化。

此外，本實驗中KDR表達趨勢與HIF-1α不完全一致，提示KDR表達不全受HIF-1α調控，可能還存在別的影響因素。研究顯示[18]，VEGF和受體完全結合后，才能發(fā)揮相應生物學效應。受壓3 d時，組織形態(tài)學結果顯示局部組織血管數(shù)量并未隨HIF-1α和VEGF表達增高而增加，筆者推測可能與KDR蛋白低表達有關，受體數(shù)量減少限制VEGF促血管生成作用發(fā)揮。

綜上所述，本實驗初步驗證血管生成相關調節(jié)因子HIF-1α、VEGF和KDR在3期壓力性損傷形成中的作用，HIF-1α介導的VEGF和KDR蛋白表達減少引起組織血管生成減少，可能是3期壓力性損傷愈合減慢的重要原因。從HIF-1α角度進行干預，可能是3期壓力性損傷治療的新靶點和新策略。此外，3期壓力性損傷病因復雜，課題組接下去將以HIF-1α為切入點進一步深入探討3期PI形成的具體機制，以期為臨床上PI治療靶點尋找提供更加有力的依據(jù)。