多肽藥物關鍵水解酶體外高通量分析方法的建立

張 凡，田 浤，姚文兵

(中國藥科大學生命科學與技術學院 江蘇省生物藥物成藥性研究重點實驗室，南京 210009)

近年來，多肽藥物受到廣泛關注，在抗腫瘤、抗感染、糖尿病治療等領域發(fā)揮著越來越重要的作用[1-2]。但是，多肽藥物穩(wěn)定性差、半衰期短、在體內易受到蛋白酶水解等缺點限制了其生物學活性的發(fā)揮，因而導致許多具有生物活性的多肽分子不能作為藥物應用于臨床[3-4]。

多肽藥物的體內代謝途徑包括蛋白酶水解、受體介導胞吞作用和腎小球濾過作用[5-6]。其中蛋白酶水解不僅是影響多肽藥物半衰期的重要因素，也是影響多肽藥物生物學活性的關鍵因素之一。如二肽基肽酶4對胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)具有極強的降解作用，可導致其迅速降解為無生物學活性的9～39片段，同時降解生成的9～39片段是GLP-1受體拮抗劑，使得GLP-1與受體的親和力降至原來的1%，這種快速降解使天然GLP-1在人體內的半衰期僅有約3 min，無法直接應用于臨床[7-9]。因此，尋找多肽類藥物的關鍵水解酶，有助于闡明多肽藥物體內分解代謝過程，對多肽藥物的合理設計與改造具有重要意義。但是，由于蛋白酶的水解作用涉及范圍廣、蛋白酶種類繁雜、關鍵制約因素不明確，多肽藥物關鍵水解酶的分析一直缺少有效的方法[10-13]。

本文選擇體內分布廣泛、酶解譜較廣的8種血液蛋白酶作為研究對象，以高效液相色譜法為基礎，經反應條件模塊化優(yōu)化，建立多肽藥物關鍵水解酶體外分析方法。利用本文所建立的方法對已上市多肽藥物普蘭林肽的關鍵水解酶進行分析，并利用MST技術進行結果的驗證。

1 材 料

1.1 試 劑

人血液8種蛋白酶(表1，美國R&D Systems公司)；蛋白酶工具底物(南京金斯瑞生物科技有限公司)；普蘭林肽、腦鈉肽(純度>95%，北京藥渡經緯信息科技有限公司)；乙腈、三氟乙酸(美國Sigma公司)；所有試劑均為分析純且可由市售獲得。

1.2 儀 器

高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱XBridge C18(美國Agilent公司)；Monolith NT.115(德國NanoTemper公司)。

2 方 法

2.1 多肽藥物關鍵水解酶體外分析方法的建立

本實驗選擇人體血液中酶解譜較廣、底物較多、覆蓋識別序列較廣泛的8種蛋白酶，其中囊括內切酶與外切酶(見表1)。對8種蛋白酶反應體系的pH及緩沖液進行模塊化優(yōu)化。

Table1 Eight proteases in blood with a wide range of enzymatic hydrolysis property and corresponding tool substrates[14]

ECProteaseToolsubstrate3.4.11.2AminopeptidaseN(APN)Enkephalin3.4.17.2CarboxypeptidaseB(CPB)Cholecystokinin83.4.15.1PeptidyldipeptidaseA(ACE)Angiotensin13.4.14.5Dipeptidylpeptidase-4(DPP4)GLP-13.4.24.11Neprilysin(NEP)Enkephalin3.4.24.86Tumornecrosisfactorα-conver-tase(ADAM17)L-selectinprocessingsitepeptideS01.017Kallikrein-relatedpeptidase5(KLK5)S-2288syntheticpeptideS01.132Mannan-bindinglectin-associatedserineprotease3(MASP3)Syntheticpeptide

2.1.1 反應體系pH的優(yōu)化 實驗組按說明書中要求的pH及反應緩沖液將人源重組蛋白酶與對應的工具底物進行反應，反應條件為37 ℃，60 min，反應體系為200 μL，底物濃度為20 μmol/L，反應完成后，使用等比例1%三氟乙酸溶液終止反應，離心后取上清液進行HPLC檢測，將柱子用流動相預平衡10 min，流動相A為含0.065% TFA的超純水，流動相B為含0.05% TFA的乙腈，通過梯度洗脫進行分離，其中B相百分比在25 min內以1 mL/min的流速從5%線性增加至65%，檢測波長為214 nm。對照組更換反應pH為7.8和9.0的對應緩沖體系，按上述條件反應后上樣檢測，實驗重復3次。以0 min終止的樣品殘留率為100%，比較實驗組與對照組中工具底物的殘留率間是否具有顯著性差異，以判斷是否可以優(yōu)化為統(tǒng)一的反應條件。

2.1.2 反應體系緩沖液的優(yōu)化 將反應體系的pH變更為“2.1.1”項中優(yōu)化后的pH，緩沖體系分別使用0.01 mol/L PBS溶液和50 mmol/L Tris溶液(含適當強度的金屬離子)，按“2.1.1”項反應與檢測步驟進行實驗，實驗重復3次。

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性關系考察 以腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)為例，在所建立的方法條件下對BNP進行不同濃度梯度線性考察，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.2.2 精密度

批間精密度和準確度 按上述線性分析方法，改變溶液濃度(30，50，70 μmol/L)，每一濃度測定3個樣本，按本文所建立的方法與標準曲線同批測定。計算每一濃度測定的相對標準偏差(RSD)。根據標準曲線計算底物濃度，為c0，配置濃度為c1。準確度=c1/c0×100%。

中間精密度 按上述線性分析方法，每一濃度測定3個樣本，按本文所建立的方法與標準曲線同批測定，連續(xù)測定3 d。按照“第1天A人用 A高效液相色譜儀，第2天B人用B高效液相色譜儀，第3天A人用B高效液相色譜儀”的方式進行測定。計算3種濃度3個批次樣品的批間RSD。

2.2.3 耐用性 微小改變柱溫(28，30，32 ℃)和流速(0.9，1，1.1 mL/min)，按上述線性分析方法對樣品進行分析，記錄保留時間。每一濃度測定3個樣本，分別測定每種條件下3個批次樣品保留時間的批間RSD。

2.3 普蘭林肽關鍵水解酶的檢測

2.3.1 普蘭林肽酶解殘留率的測定 利用本實驗所建立的方法進行普蘭林肽血液酶解殘留率的測定，通過比較酶解殘留率的大小進行關鍵水解酶的分析。

2.3.2 普蘭林肽與血液蛋白酶相互作用的檢測 利用異硫氰酸熒光素對普蘭林肽進行熒光標記，并與梯度濃度未標記的蛋白酶于37 ℃在黑暗條件下孵育10 min，吸入至Monolith NT.115標準玻璃毛細管中進行分析。在37 ℃下使用20% MST功率進行測量，激光開/關時間分別為5和20 s，所有實驗重復3次，使用NanoTemper軟件計算結果。

3 結果與討論

3.1 多肽藥物關鍵水解酶體外分析方法的建立

由于8種血液蛋白酶均為人源重組蛋白酶，對反應條件的精確度要求較高，而每種蛋白酶的反應條件如pH、反應緩沖體系各不相同，這不利于整套研究系統(tǒng)的建立，因此本實驗對反應條件進行優(yōu)化。

3.1.1 反應體系的pH優(yōu)化 在多肽的酶促反應過程中，體系的pH不僅對酶促反應過程進行調控，同時也是影響多肽藥物穩(wěn)定性與活性的重要因素。通過比較不同pH條件下對應工具底物反應完成后的殘留率，完成反應pH的優(yōu)化。反應體系pH更換后，對ACE的酶促反應影響最大，優(yōu)化前后工具底物殘留率分別為(15.39±1.74)%和(18.34±2.83)%，但兩組間差異不超過3%，且組間P=0.63，不具有顯著性差異。差異最小的為DDP4，優(yōu)化前后工具底物殘留率分別為(39.29±3.69)%和(37.28±2.84)%，組間P=0.98。其余底物在不同pH條件下與對應蛋白酶反應后殘留率如表2所示，組間均不具有顯著性差異。綜上，得到ADAM17最佳pH為9.0，其余7種蛋白酶的最佳pH均可為7.8的統(tǒng)一分析方法。

ProteaseRecommendationpHResidue/%OptimizationpHResidue/%PCPB7.525.42±2.927.825.20±1.800.95DPP48.039.29±3.697.837.28±2.840.98ACE6.515.39±1.747.818.34±2.830.63APN7.023.65±1.687.823.89±2.500.94NEP9.034.85±2.377.836.88±3.150.73KLK58.017.80±1.597.818.07±2.480.93MASP38.557.72±2.777.855.89±3.390.69ADAM179.084.17±1.509.084.25±1.930.97

3.1.2 反應體系緩沖液的優(yōu)化 通過比較不同緩沖液中對應工具底物反應完成后的殘留率，完成反應緩沖液的優(yōu)化。不同緩沖液中工具底物與對應蛋白酶反應殘留率的HPLC檢測結果見表3，結果表明除ADAM17在0.01 mol/L PBS緩沖液[殘留率為(26.31±2.33)%，n=3，P=1.47×10-4]中活性迅速降低以外，其余蛋白酶的反應緩沖液在更換為0.01 mol/L PBS后工具底物殘留率均無顯著降低。影響較大的CPB在優(yōu)化前后底物殘留率分別為(25.42±2.92)%和(28.20±1.99)%，兩組間差異不超過3%，且P達到0.46，不具有顯著性差異。差異最小的為ADAM17，優(yōu)化前后工具底物殘留率分別為(84.17±1.50)%和(83.91±0.96)%，組間P達到0.89。由此反應緩沖液可優(yōu)化為兩種：0.01 mol/L PBS緩沖液和50 mmol/L Tris緩沖液。

ProteaseRecommendationBufferResidue/%OptimizationBufferResidue/%PCPB25mmol/LTris25.42±2.920.01mol/LPBS28.20±1.990.46DPP425mmol/LTris39.29±3.690.01mol/LPBS41.30±2.390.66ACE50mmol/LTris15.39±1.740.01mol/LPBS13.36±1.600.41APN50mmol/LMES23.65±1.680.01mol/LPBS23.05±2.270.84NEP50mmol/LTris34.85±2.370.01mol/LPBS36.30±2.100.66KLK50.1mol/LNaH2PO417.80±1.590.01mol/LPBS19.68±1.900.47MASP350mmol/LTris57.72±2.770.01mol/LPBS56.45±2.670.75ADAM1750mmol/LTris84.17±1.5050mmol/LTris83.91±0.960.89

3.2 方法學驗證

3.2.1 線性關系考察 以腦鈉肽(BNP)濃度為橫坐標(x,μmol/L)，高效液相信號峰強度為縱坐標(y,mAU)線性回歸，得BNP線性標準曲線方程為：y=56.31x-328(r=0.998 5)，結果表明，BNP濃度在10～80 μmol/L范圍內線性關系良好。

3.2.2 精密度和準確度 精密度和準確度通過分析已知濃度的參比溶液進行3次重復來確定，當樣品濃度分別為30，50，70 μmol/L時，批間精密度分別為2.24%，0.77%和1.57%，中間精密度分別為6.68%，1.57%和3.62%，二者均在10%以下，結果表明該系統(tǒng)對BNP的定量分析精密度良好，說明該系統(tǒng)對BNP的定量分析準確。3種濃度BNP溶液測定的準確度在98%～100%，證明方法準確度良好，可進行后續(xù)檢測。

3.2.3 耐用性 分別改變方法的溫度與流速得到耐用性檢測結果，30，50，70 μmol/L的3種濃度樣品分別在28 ℃，30 ℃，32 ℃條件下進行結果檢測，保留時間的RSD分別為0.23%，0.25%和0.24%，均在1%以下；3種濃度的樣品分別在0.9，1.0，1.1 mL/min條件下檢測，保留時間的RSD分別為2.33%，2.36%，2.38%,均在3%以下，表明方法的耐用性良好。

多肽藥物的體外關鍵水解酶檢測方法通過方法學驗證精確高效，可以用于關鍵水解酶的測定。

3.3 普蘭林肽關鍵水解酶的檢測

3.3.1 普蘭林肽酶解殘留率的測定 利用前文建立的多肽藥物關鍵水解酶體外分析方法對已上市多肽藥物普蘭林肽進行關鍵水解酶的檢測(見表4)，其中使普蘭林肽殘留率最低的兩種蛋白酶分別是KLK5與DPP4，其殘留率分別為(41.87±1.72)%及(92.00±0.66)%，低于另外6種蛋白酶，證明利用本研究建立的分析方法能夠得到普蘭林肽的關鍵水解酶為KLK5及DPP4。

ProteaseResidueofpramlintide/%ACE100.00±0.00APN95.37±0.99KLK541.87±1.72MASP3100.00±0.00NEP94.53±2.08DPP492.00±0.66CPB95.98±1.14ADAM1796.83±0.39

3.3.2 普蘭林肽與血液蛋白酶相互作用的檢測 本實驗發(fā)現普蘭林肽被KLK5及DPP4的水解目前尚未有相關文獻報道，因此，通過MST進一步測定體系中多肽和蛋白酶之間的結合現象以驗證上述結果。結果顯示，普蘭林肽與KLK5和DPP4結合的Kd小于其他蛋白酶，證明具有較高的親和力(表5)。MST和HPLC測定結果一致，實驗結果證實HPLC篩選獲得的關鍵水解酶KLK5和DPP4的確對普蘭林肽有較高親和力。

ProteaseEquilibriumdissociationconstant(Kd,μmol/L)KLK50.04±0.00NEP1.26±0.43ACE7.96±0.68CPB2.29±0.11DPP40.01±0.00APN5.98±0.28MASP31.08±0.36ADAM171.02±0.14

4 結 論

多肽藥物的酶解穩(wěn)定性考察一直以來受到學者廣泛關注，本實驗基于8種酶解譜廣、分布廣泛的血液蛋白酶，利用高效液相的方法建立了統(tǒng)一的多肽藥物體外關鍵水解酶分析方法，反應條件分別優(yōu)化為pH 7.8或9.0及緩沖溶液為0.01 mol/L PBS或50 mmol/L Tris緩沖液，在不影響實驗結果的前提下，統(tǒng)一復雜的血液酶酶解反應條件。利用此方法得到的普蘭林肽關鍵水解酶同MST檢測結果一致，均為KLK5和DPP4。普蘭林肽是胰淀粉樣類似物，能夠調節(jié)血糖水平，通過靜脈注射的體內消除半衰期為24～45 min，未來可基于關鍵水解酶尋找酶切位點指導普蘭林肽的穩(wěn)定性優(yōu)化，從而延長其半衰期。因此，本研究所建立的方法能夠為臨床前多肽類藥物的高通量穩(wěn)定性篩選提供方法參考與指導。