豬蛔蟲微管蛋白α-鏈基因（13E09）在不同發(fā)育期的mRNA表達研究

吳金妃 福州大北農生物技術有限公司 福州 350014

豬蛔蟲病是由寄生于豬小腸的豬蛔蟲引起的一種線蟲病，呈是世界性流行，不管是集約性養(yǎng)殖場還是散養(yǎng)戶都廣泛存在，3～6月齡的仔豬最易感，當豬感染后，不僅會生產(chǎn)發(fā)育不良，甚至可引起死亡[1]。所以說豬蛔蟲病是一種危害我國養(yǎng)豬業(yè)極為嚴重的寄生蟲病。

豬蛔蟲幼蟲和成蟲不同發(fā)育階段引起的癥狀和病變是各不相同的。幼蟲主要對肝臟和肺臟造成病變，而成蟲則是對胃腸道造成影響，有的蛔蟲還可進人膽管，造成膽管堵塞，引起黃疸等癥狀；另外成蟲能分泌毒素，作用于中樞神經(jīng)和血管，引起一系列神經(jīng)癥狀。成蟲奪取宿主大量的營養(yǎng)，使仔豬發(fā)育不良，生長受阻，被毛粗亂，常是造成“僵豬”的一個重要原因，嚴重者可導致死亡[1]。

鑒于蛔蟲簡單的生活史（直接發(fā)育），且繁殖能力強[2]，再加上蟲卵對各種外界環(huán)境的抵抗力強，以至于豬蛔蟲病的廣泛流行。目前對該病的研究主要圍繞藥物治療和預防兩方面。例如，Ho N F H等[3]應用活體蛔蟲和選擇性放射性標記研究了表皮吸收藥物后的組織分布及藥動學，以及抗蠕蟲藥的研發(fā)等等諸如此類對藥物的研究有許多，也取得了喜人成績，研制出了各種各樣的藥物，但由于長期或濫用藥物，蛔蟲的耐藥性與藥物的殘留等問題也隨之而來。因此，以研究基因功能為目的的免疫防治成為新的研究方向之一[4-7]。本實驗以β-actin基因為內參，采用半定量RT-PCR技術研究豬蛔蟲不同發(fā)育階段微管蛋白α-鏈基因（13E09）的表達豐度，為進一步了解豬蛔蟲的發(fā)育提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 豬蛔蟲不同發(fā)育階段蟲體的總RNA，由福建龍巖學院寄生蟲學實驗室提供。

1.2 主要試劑和設備 由TOYOBO公司提供的ReverTra Ace-a-TM試劑盒、由美國Bio-RAD公司生產(chǎn)的PCR儀和Bio-RAD電泳系統(tǒng)、由英國UVTTEC公司生產(chǎn)的凝膠圖像分析系統(tǒng)、由法國吉爾森公司生產(chǎn)的微量取液器 （2 μL、200 μL、1 000 μL）、由北京六一儀器廠生產(chǎn)的電泳儀（DYCP-31BN）、由美國Forma公司生產(chǎn)的Thermo Forma低溫冰箱。

1.3 試驗方案

1.3.1 逆轉錄反應 主要參照ReverTra Ace-a-TM試劑盒說明書進行，并進行一定的優(yōu)化，反應體系見圖 1。 反應條件為：30 ℃、10 min；42 ℃、40 min；99 ℃、5 min；4 ℃、5 min。

圖1 逆轉錄反應體系

1.3.2 內參β-actin基因的PCR擴增反應 選取β-actin作為本次試驗的內參基因，反應步驟和條件參考鄧艷（2006版）[8]并根據(jù)需要做適當優(yōu)化。此次引物合成由上海生物工程有限公司完成。引物模板見圖2，反應體系見圖3。反應條件為：94℃預變性5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，共25個循環(huán)；72℃后延伸10 min。

圖2 引物模板

1.3.3 PCR擴增

1.3.3.1 引物設計 使用已知的微管蛋白α-鏈基因（13E09）序列（基因登錄號：ES291007）作為本次目的基因引物的設計模板，通過primer的自動搜索功能和oligo軟件對目的引物進行篩選比對、分析和設計。該引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列為：上游引物5'TTCCTTCGGCAGATGTCA 3'；下游引物5'GCTTCCTGGTCTTTCACTCA 3。用DEPC水將合成的引物稀釋成10 pmol/uL的使用濃度，然后分裝保存（-20℃）待用。

1.3.3.2 Mg2+濃度優(yōu)化 分別采用 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L的Mg2+濃度進行引物 PCR擴增反應，其余條件一致。PCR反應完成后，各取5 uL擴增產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳分析。最后根據(jù)目的條帶的亮度和特異性來確定Mg2+的最佳濃度。Mg2+優(yōu)化PCR體系見圖4。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性 30 s， 引物退火 30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72℃后延伸10 min。

1.3.3.3 退火溫度的優(yōu)化 PCR擴增按照PCR程序設定的退火梯度進行，利用瓊脂糖凝膠電泳對5 μL PCR擴增產(chǎn)物進行分析，根據(jù)其亮度和特異性確定合適的退火溫度。PCR擴增條件與1.3.3.2相同。

圖3 內參β-actin基因的PCR擴增反應體系

1.3.3.4 循環(huán)數(shù)的優(yōu)化 分別以 26、28、30、32、34、36次作為反應體系的循環(huán)數(shù)，利用瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)對5 μL PCR擴增產(chǎn)物進行分析。用Quantity One軟件測量電泳條帶的光密度，選擇線性范圍內的循環(huán)數(shù)，且選擇目的條帶最亮的次數(shù)作為最佳次數(shù)。PCR反應體系同上，反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性 30 s，引物退火 30 s，72℃延伸30 s，分別按6個設定的循環(huán)數(shù)進行試驗優(yōu)化；72℃后延伸10 min。

圖4 Mg2+優(yōu)化PCR體系

1.3.4 不同發(fā)育階段豬蛔蟲感染期幼蟲差異基因的表達分析 通過以上實驗的優(yōu)化結果，各參數(shù)均選取最優(yōu)，進行PCR反應，從而研究不同發(fā)育階段幼蟲差異基因的表達情況。不同發(fā)育階段幼蟲差異基因的擴增均在同一PCR反應體系中進行，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，最后用Quantity One軟件測量各目的電泳條帶的光密度值備用。目的基因的mRNA的含量用目的基因和內參基因β-actin的積分光密度的比值來表示。

1.3.5 RT-PCR產(chǎn)物測序分析 將以上試驗所產(chǎn)生的RT-PCR產(chǎn)物送到上海生物工程有限公司進行測序，并且將測序出來的結果和已知的EST片段進行比較分析。

2 結果和分析

2.1 內參基因擴增結果 擴增結果見圖5。根據(jù)Quantity One軟件對電泳條帶進行光密度測定，得出β-actin的光密度值。結果雌蟲為17.24，雄蟲15.65，蟲卵 13.00，肺 L3 為 12.85，腸 L4 為 17.81，感染期幼蟲為19.97，用Excel軟件做統(tǒng)計學分析，結果顯示，內參β-actin基因光密度值在不同發(fā)育期差異不顯著（P=0.224>0.05），說明該基因在豬蛔蟲內穩(wěn)定表達。

2.2 Mg2+濃度優(yōu)化結果 Mg2+離子濃度對PCR的擴增有很大的影響，高濃度會降低PCR擴增的特異性，而低濃度則會影響PCR擴增的產(chǎn)率，甚至會導致PCR擴增失敗而沒有擴增條帶[9]，根據(jù)Mg2+濃度的優(yōu)化電泳結果分析（見圖6），該基因的最佳Mg2+濃度為1.5 mM。

圖5 β-actin基因在豬蛔蟲不同發(fā)育期的PCR產(chǎn)物電泳圖

圖6 不同Mg2+濃度PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3 退火溫度的優(yōu)化結果 在PCR擴增過程中，退火溫度是影響PCR特異性較重要的因素，設定的退火溫度要低到足以保證引物與目標基因的有效退火，高到足以減少非特異性結合。根據(jù)圖7的退火溫度優(yōu)化電泳結果分析，該目的基因的最佳退火溫度為48℃。

圖7 不同退火溫度PCR產(chǎn)物電泳圖

2.4 循環(huán)數(shù)對PCR產(chǎn)物光密度值的影響 根據(jù)電泳結果顯示，13E09基因在32循環(huán)數(shù)內擴增在指數(shù)增長期。試驗中13E09基因采用33循環(huán)數(shù)進行試驗。循環(huán)數(shù)優(yōu)化結果見圖8-圖9。

2.5 以β-actin基因為內參，對目的基因（13E09）在不同發(fā)育期的半定量RT-PCR結果

2.5.1 電泳分析 利用瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)對5 μL PCR擴增產(chǎn)物進行分析，用凝膠成像系統(tǒng)拍照，見圖10。

2.5.2 光密度和表達情況分析 采用Quantity One軟件對每個電泳條帶的光密度測量，用各目的基因的積分光密度和內參基因β-actin的積分光密度的比值來代表目的基因在不同發(fā)育期的表達量。結果表明，該目的基因除在感染期幼蟲呈高豐度表達外，在腸L4期幼蟲有多量表達，在雄蟲、蟲卵期也有少量表達。實驗結果見表1和圖11。

圖8 不同退火循環(huán)數(shù)下13E09基因PCR產(chǎn)物電泳圖

圖9 13E09基因不同循環(huán)數(shù)條帶IOD值分析

表1 β-actin和13E09 PCR產(chǎn)物電泳相應條帶的IOD值

圖10 13E09基因在豬蛔蟲不同發(fā)育期表達情況的電泳分析

2.6 測序結果分析 將測序所得的序列與已知的目的基因EST序列片段進行比對，兩堿基序列100%一致，證明RT-PCR擴增片段是未發(fā)生堿基突變的目的片段，測序結果見附件。測序所得序列在GenBank中的非冗余數(shù)據(jù)庫進行blast分析，發(fā)現(xiàn)與編碼捻轉血矛線蟲微管蛋白α-鏈的基因序列有93%的相似性。

圖11 豬蛔蟲感染期幼蟲各目的基因在不同發(fā)育期的表達情況分析

3討 論

RT-PCR方法因其較好的靈敏性和特異性而常被用來檢測極少量的反轉錄產(chǎn)物或者只有少量的樣品分析[10]。在大多數(shù)的研究中，研究者們關注的是在表達水平上減少或者增加，而非檢測少量的變化或者精確的分子數(shù)量。因此，盡管隨著技術的發(fā)展，在精確性上極大的提高了，但半定量RT-PCR仍被廣泛的運用。半定量RT-PCR原理是將總RNA逆轉錄成cDNA，然后擴增目標cDNA和內參cDNA，根據(jù)PCR產(chǎn)物量來計算樣品中mRNA的相對數(shù)量。半定量RT-PCR最關鍵的是優(yōu)化最佳的實驗條件。近年來，半定量RT-PCR常用來定量測定特異性的mRNA豐度[11-13]。

本實驗是在已構建的豬蛔蟲感染期幼蟲cDNA文庫的基礎上，采用半定量RT-PCR方法分析13E09基因在5個發(fā)育期的表達情況，結果顯示，該基因除了在感染期幼蟲呈高豐度表達外，在腸L4幼蟲也有多量表達，在雄蟲、蟲卵期也也有少量表達。

將目的基因在GenBank中的非冗余數(shù)據(jù)庫進行blast分析，發(fā)現(xiàn)13E09基因與Caenorhabditis.briggsae編碼CBR-MEC-12蛋白的基因和編碼捻轉血矛線蟲微管蛋白α-鏈（Haemogregarina contortus TubuLin alpha chain）的基因序列有93%的相似性。

從蛔蟲的發(fā)育史可以看出，感染性蟲卵在被宿主食入后，小腸內孵出后開始了一系列的移行經(jīng)肝、肺后返回小腸[14]。半定量RT-PCR結果顯示，13E09基因在感染期幼蟲和腸L4中有突出表達，也是表達于幼蟲在宿主體內進行一系列移行的時期。已有報道表明微管蛋白個別氨基酸的改變可引起微管蛋白結構的變化，從而導致蟲體對以微管為靶點的藥物抗性的產(chǎn)生。因此，微管蛋白的研究對豬蛔蟲病的免疫預防具有重要意義。