不同純化濃縮方法制備的新城疫疫苗對(duì)SPF雞免疫效果的研究

陳靜怡 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 福州 350014

新城疫 （Newcastle Disease，ND），又叫亞洲雞瘟、偽雞瘟、禽副流感Ⅰ型（APM-1）。1926年首先發(fā)現(xiàn)于印度尼西亞的爪哇，不久又因在英國(guó)新城大面積暴發(fā)流行而被發(fā)現(xiàn)，因此命名為新城疫[1-2]，它是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）感染導(dǎo)致禽類發(fā)生高熱、全身性敗血癥，是危害養(yǎng)禽業(yè)的一種主要傳染病。

新城疫發(fā)病率高，經(jīng)濟(jì)損失大，市場(chǎng)上新城疫的疫苗種類雖然很多，但免疫效果依然不理想。因此，對(duì)于新城疫疫苗免疫效果的提升有許多報(bào)道，有的認(rèn)為需要制定合理的免疫程序，如王艷平[3]認(rèn)為活疫苗與滅活疫苗需交替使用。而滅活苗的免疫主要是肌肉注射，在新城疫滅活疫苗生產(chǎn)過(guò)程中，由于收獲的尿囊液中混有少量的蛋殼、尿酸鹽、雜蛋白質(zhì)（如卵黃等）、內(nèi)毒素等，因此，在疫苗使用過(guò)程中質(zhì)量難以穩(wěn)定，被免疫雞時(shí)常會(huì)出現(xiàn)不良的免疫副反應(yīng)。有一些雜質(zhì)對(duì)疫苗產(chǎn)生免疫抗體還會(huì)有影響，而且嚴(yán)重影響單位劑量的免疫效果，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致免疫失敗。另外，抗原中過(guò)多的雜質(zhì)使得抗原滅活過(guò)程消耗大量滅活劑甲醛，甲醛在雞體內(nèi)殘留將影響人類食品安全。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)比不同濃縮倍數(shù)對(duì)新城疫疫苗免疫效果的影響來(lái)確立最佳的濃縮倍數(shù)，為以后制備含新城疫病毒的二聯(lián)疫苗、三聯(lián)疫苗、四聯(lián)疫苗提供試驗(yàn)依據(jù)。不僅對(duì)疫苗廠家的生產(chǎn)有積極的意義，且對(duì)雞群免疫、食品安全有更重要的意義。

1材 料

1.1 特異性血清及抗原 新城疫病毒 （La sota株）的標(biāo)準(zhǔn)特異性陽(yáng)性血清由中國(guó)獸醫(yī)監(jiān)察所提供。新城疫抗原為福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司自制。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及其他 SPF雞胚：SPF蛋購(gòu)自山東濟(jì)南斯帕法斯公司，由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司孵化并飼養(yǎng)成所需日齡試驗(yàn)用雞。

1.3 主要設(shè)備 青島依愛(ài)孵化器，Millipore超濾濃縮儀，10K聚醚砜超濾膜包，恒溫恒濕箱，單孔微量移液器，八孔微量移液器，振蕩器，96孔U型微量板，高速剪切機(jī)等。

2方 法

2.1 疫苗的制備

2.1.1 抗原的純化濃縮 將制備好的抗原使用高速管式分離機(jī)采用15 000 r/min、3 kg/min進(jìn)行離心，離心后取樣500 mL標(biāo)記為抗原h(huán)，其余的抗原用Millipore濃縮系統(tǒng)使用10K聚醚砜膜包進(jìn)行濃縮，在濃縮進(jìn)行到2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍時(shí)分別取樣 500 mL，標(biāo)記為抗原 a、b、c、d、e、f。將制備好未經(jīng)離心的抗原用Millipore濃縮系統(tǒng)使用10K聚醚砜膜包進(jìn)行2倍濃縮，標(biāo)記為抗原g。

2.1.2 抗原的滅活與乳化 將以上各組抗原按照規(guī)程要求，加入0.1%甲醛溶液，37℃滅活 16 h，同時(shí)按照規(guī)程要求對(duì)滅活后的抗原進(jìn)行各項(xiàng)檢驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)達(dá)到要求。將達(dá)到要求的抗原按照一定乳化比例（水相與油相比）進(jìn)行乳化?？乖璦～h經(jīng)滅活乳化后分別標(biāo)記為疫苗A～H。

2.2 以不同抗原制備成的滅活疫苗免疫SPF雞后抗體水平檢測(cè)及攻毒對(duì)比試驗(yàn)

2.2.1 免疫試驗(yàn) 試驗(yàn)動(dòng)物分組：選擇95羽由公司自行飼養(yǎng)的30日齡健康SPF雞，隨機(jī)分成9組，A～H每組10羽，每羽分別胸部肌肉接種20 μL疫苗A～H；I組5羽為空白對(duì)照，每羽胸部肌肉注射PBS 20 μL。 免 疫 后 7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、45 d、70 d、90 d分別采血檢測(cè)免疫組與對(duì)照組雞的平均抗體水平，同時(shí)觀察疫苗的吸收情況。

2.2.2 疫苗吸收情況 免疫后第7 d觀察每羽雞的疫苗吸收情況；免疫后第35 d每組剖檢2羽SPF雞，觀察疫苗注射部位情況；對(duì)照組剖檢1羽。

2.2.3 攻毒對(duì)比試驗(yàn) 試驗(yàn)動(dòng)物分組：選擇95羽由公司自行飼養(yǎng)的30日齡健康SPF雞，免疫組每組10羽，I～VIII組分別免疫疫苗 A～H；空白對(duì)照組5羽，每羽胸部肌肉注射PBS 20 μL。在免疫后第28 d，免疫組和空白對(duì)照組每羽雞肌肉注射新城疫病毒強(qiáng)毒株北京株 0.5 mL（CVCCAV611株，含105.0ELD50）進(jìn)行攻毒，注射后連續(xù)觀察14 d。注射強(qiáng)毒后SPF雞死亡的，為攻毒未保護(hù)；SPF雞未死亡的，為攻毒保護(hù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 疫苗免疫后的吸收情況 免疫后第7 d和第35 d觀察疫苗的吸收情況，結(jié)果見表1。疫苗免疫后第7 d，9組的接種部位肉眼均可見有不同程度的疫苗未完全吸收現(xiàn)象，其中G組個(gè)別SPF雞在接種部位可見較嚴(yán)重紅腫，其他8組與對(duì)照組差異不顯著，注射部位附近均發(fā)現(xiàn)有少量出血點(diǎn)。

疫苗免疫后第 35 d，每組各剖檢2羽SPF雞進(jìn)行觀察 （對(duì)照組剖檢1羽），G組疫苗沒(méi)有被完全吸收，注射部位附近有少量乳黃色黏稠狀液體，并有少量出血點(diǎn)，而其他8組未發(fā)現(xiàn)有肉眼可見的變化。

表1 疫苗的吸收情況

3.2 疫苗免疫后的抗體水平 疫苗免疫后第7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、45 d、70 d、90 d 分別采血測(cè)HI抗體水平，結(jié)果見表2，并繪制出抗體水平變化曲線圖，見圖1。

表2 SPF蛋源試驗(yàn)雞新城疫HI抗體水平

圖1 乳化后各組疫苗抗體水平的消漲曲線

3.3 疫苗免疫后的攻毒保護(hù)情況 攻毒試驗(yàn)組在疫苗免疫后的第28 d，注射強(qiáng)毒進(jìn)行攻毒，攻毒保護(hù)結(jié)果見表3。

表3 SPF蛋源試驗(yàn)雞新城疫免疫攻毒保護(hù)情況

4討 論

由疫苗吸收試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)G組有較大的不良反應(yīng)，這可能是因?yàn)镚組疫苗沒(méi)有經(jīng)過(guò)離心純化直接進(jìn)行濃縮，在這過(guò)程中不僅抗原濃縮了，疫苗中的雜質(zhì)如蛋殼、卵黃等也進(jìn)行了濃縮，增加了疫苗中雜質(zhì)的含量，因此出現(xiàn)了較大的不良反應(yīng)，而進(jìn)行了離心純化的疫苗組與對(duì)照組 （接種PBS）沒(méi)有明顯差異，可見經(jīng)過(guò)離心純化后，疫苗內(nèi)雜質(zhì)明顯減少。

由疫苗免疫后的抗體水平試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)：未進(jìn)行濃縮的H組，抗體水平較低，特別是在14～45 d，H組與其他組的抗體水平差異極顯著。

從濃縮倍數(shù)方面分析，當(dāng)濃縮倍數(shù)越高時(shí)，抗體水平也越高，并且攻毒保護(hù)率可達(dá)9/10，而疫苗未經(jīng)濃縮的其抗體水平相對(duì)較低。未經(jīng)離心直接2倍濃縮的G組與經(jīng)過(guò)離心后2倍濃縮的A組，在抗體水平表現(xiàn)上雖然差異不顯著，但是未經(jīng)離心直接濃縮的由于雜質(zhì)含量較多，所以在疫苗免疫后其吸收效果也較不理想。因此，如果只是為了提高抗原含量而只進(jìn)行濃縮、未進(jìn)行離心是不可取的，它將會(huì)影響疫苗的免疫效果。

從圖1可知，各組在第7～14 d，抗體均有一個(gè)成倍增長(zhǎng)的過(guò)程，而第14～21 d，抗體的增長(zhǎng)速度放緩，約第21 d達(dá)到最高水平，而在第21 d后抗體水平逐漸下降，下降速度緩慢。并且發(fā)現(xiàn)濃縮倍數(shù)越高，下降速度越慢，濃縮倍數(shù)低下降速度快。各組的抗體水平在免疫后第14 d均表現(xiàn)出顯著差異，這說(shuō)明不同濃縮倍數(shù)對(duì)于抗體水平影響極大，這與王春華[4]的研究結(jié)果相一致。趙繼勛[5]認(rèn)為新城疫抗體只要達(dá)到8log2及以上就可以抵抗野毒的感染，而本試驗(yàn)中經(jīng)過(guò)離心后的抗原經(jīng)5倍以上濃縮，抗體水平最高，均可達(dá)到8log2以上。