基于無機載體的先交聯(lián)后吸附固定化脂肪酶的方法

林海蛟，張云，孫愛君，黃錦煜，胡云峰

(1.中國科學院南海海洋研究所∥中國科學院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室， 廣東 廣州 510301; 2.南方醫(yī)科大學口腔醫(yī)院， 廣東 廣州 510280; 3.中國科學院大學， 北京 100049)

脂肪酶(lipase, EC 3.1.1.3)是一種重要的酯水解工業(yè)用酶，能夠將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸.脂肪酶的來源廣泛，存在于動物、植物和微生物中.脂肪酶在食品、農業(yè)和醫(yī)藥等領域有廣泛應用，展現(xiàn)出很大的工業(yè)應用價值[1-4].但是，在實際應用中，游離脂肪酶對環(huán)境非常敏感，具有不穩(wěn)定性和易變性[5]，而且脂肪酶的價格一般很高，游離脂肪酶不易回收，這些缺陷使得脂肪酶的工業(yè)應用受到很大限制.

發(fā)展酶的固定化技術是為了克服游離脂肪酶的缺陷.常見的固定化方法有吸附法、包埋法、交聯(lián)法及共價結合法等.這4種方法各具優(yōu)缺點，因此單獨使用某一種固定化方法達不到最優(yōu)的固定化效果.本實驗采用先交聯(lián)后吸附的固定化方法來固定化脂肪酶.交聯(lián)法是利用雙功能或多功能試劑在酶分子間或者酶分子與載體間發(fā)生交聯(lián)反應而凝集成網狀結構的一種方法[6-7].吸附法是通過酶分子與載體表面以范德瓦耳斯力結合在一起的一種固定化方法，雖然結合力較弱但對酶的損害很小[7-8].因此，交聯(lián)法和吸附法結合進行固定化脂肪酶，能夠達到互補其短的效果.

在酶的固定化制劑的研究中，固定化載體的選擇是一個重要的因素[9-10].固定化載體的種類繁多，有無機載體、有機載體、納米載體等[10].相比其他載體，無機載體具有無毒、穩(wěn)定性好、價格低廉、來源豐富等優(yōu)點.在無機載體中，硅藻土尤為突出，具有價格低廉和性質穩(wěn)定等優(yōu)點.比如，高貴等[11]利用硅藻土來吸附固定化脂肪酶；楊艷紅等[12]以硅藻土為載體，利用吸附法固定化中性脂肪酶；顧旭炯等[13]以硅藻土為載體，利用吸附法同時固定糖化酶和α-淀粉酶雙酶體系.此前，研究人員大多使用吸附載體先對工業(yè)酶進行吸附，再使用交聯(lián)劑對吸附在載體上的工業(yè)酶進行交聯(lián)以提高固定化酶的穩(wěn)定性，但是這種方法中對工業(yè)酶的吸附主要是依賴吸附載體對酶的吸附能力.

在交聯(lián)法的使用當中，通常的方法是在酶分子與載體吸附或包埋固定化之后再進行交聯(lián)固定化.比如，徐珊等[14]以海藻酸鈉為載體包埋固定化脂肪酶，再用乙二醇縮水甘油醚交聯(lián)劑進行交聯(lián)；錢明華等[15]先利用大孔吸附樹脂吸附脂肪酶，再用環(huán)氧交聯(lián)劑聚乙二醇二縮水甘油醚進行交聯(lián)；許超群等[16]先利用殼聚糖吸附黑曲霉β-葡萄糖苷酶，再以戊二醛為交聯(lián)劑進行交聯(lián).然而，對于先對酶進行交聯(lián)再進行吸附固定化的研究較少.可能原因是戊二醛等化學交聯(lián)劑的化學交聯(lián)反應相對激烈，酶分子直接與交聯(lián)劑接觸可能導致酶活性損失較多.

本實驗室曾利用硅藻土先吸附后交聯(lián)法固定化脂肪酶[17]，此方法先用硅藻土載體吸附海洋脂肪酶，吸附結束后酶分子已經被固定在硅藻土的孔隙中，此時進行化學交聯(lián)能進一步增加酶分子與載體的結合穩(wěn)定性.本研究是在酶分子與載體吸附之前，先利用較為溫和的環(huán)氧雙功能交聯(lián)劑對脂肪酶進行交聯(lián)，避免造成酶活性損失較大，同時又保證交聯(lián)劑促使酶分子的交聯(lián)，使酶分子之間以穩(wěn)定的共價鍵形式結合在一起，提高了吸附前酶聚集的效率.

因為吸附與交聯(lián)先后順序存在差異，本研究對先交聯(lián)后吸附法制備固定化脂肪酶的工藝技術進行了較為系統(tǒng)的研究.此先交聯(lián)后吸附的固定化方法能夠給后續(xù)酶的固定化研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：海洋(假絲酵母)脂肪酶(上海鼓臣生物有限公司)、硅藻土、聚乙烯醇PVA(天津市大茂化學試劑廠)、橄欖油(上海麥克林生化科技有限公司)、無水乙醇、異辛烷(天津市津東天正精細化學試劑廠)、新戊二醇二縮水甘油醚(上海麥克林生化科技有限公司).

儀器：PB-10酸度計(德國Sartorus公司)、Allegra X-30R Centrifuge型離心機(Beckman, Coulter)、移液槍(吉爾森公司)、DJS-2012R型恒溫搖床(上海實維實驗儀器技術有限公司)、電熱鼓風箱(上海一恒科學儀器有限公司)、渦旋振蕩器(Tomos)、DK-8D水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)、SCIENTZ-IID 型超聲破碎儀(寧波新芝生物公司)、超聲清洗儀(寧波新芝生物公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 脂肪酶活力的測定

酶活力：在測定條件(40 ℃，pH 7.0)下，每s催化1 mol底物轉化為脂肪酸所需的酶量[18].

相對酶活力：在同一組實驗中，設定酶活力最高的一組為100%，其余組別的酶活力與之相比，用百分比表示[17].

酶活力的測定：采用改進銅皂分光光度法[19-20].

1.2.2 固定化酶活力回收率[20-23]

酶活力回收率=

1.3 脂肪酶交聯(lián)實驗方法

1.3.1 交聯(lián)劑的篩選

將脂肪酶粉劑溶解于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，配制成質量濃度為2 g/mL的脂肪酶酶液.離心后取10 mL置于50 mL的離心管中，分別加入戊二醛、乙二醇縮水甘油醚、新戊二醇二縮水甘油醚和聚乙二醇二縮水甘油醚4種交聯(lián)劑，放在恒溫搖床上交聯(lián)一定時間.交聯(lián)結束后加入硅藻土載體吸附，再繼續(xù)放在恒溫搖床中固定化.吸附結束后將固定化酶抽濾、常溫烘干、測定酶活力.

1.3.2 交聯(lián)劑質量分數優(yōu)化

在10 mL酶液中加入質量分數分別為0、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的新戊二醇二縮水甘油醚.放在恒溫搖床交聯(lián)一定時間，吸附條件不變，吸附結束后將固定化酶抽濾、常溫烘干、測定酶活力.

1.3.3 交聯(lián)pH優(yōu)化

配制濃度為0.02 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，調節(jié)pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5.將質量為0.1 g酶粉劑溶解于上述系列緩沖液，加入質量分數為1.0%的新戊二醇二縮水甘油醚交聯(lián)劑，放在恒溫搖床交聯(lián)一定時間，吸附條件不變，吸附結束后將固定化酶抽濾、常溫烘干、測定酶活力.

1.3.4 交聯(lián)溫度優(yōu)化

將脂肪酶溶解于pH 5.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，加入質量分數為1.0%的新戊二醇二縮水甘油醚的交聯(lián)劑，分別在20、25、30、35、40、45、50、55 ℃的恒溫搖床中交聯(lián)一定時間，吸附條件不變，在吸附結束后將固定化酶抽濾、常溫烘干、測定酶活力.

1.3.5 交聯(lián)時間優(yōu)化

將脂肪酶溶解于pH 5.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，加入質量分數為1.0%的新戊二醇二縮水甘油醚，在35 ℃的恒溫搖床中分別交聯(lián)1、2、4、6、8 h，吸附條件不變，吸附結束后將固定化酶抽濾、常溫烘干、測定酶活力.

1.3.6 交聯(lián)正交實驗

在單因素實驗的基礎上選擇對固定化影響較大的因素設計3水平4因素的正交實驗，以相對酶活力為指標，正交實驗的因素與水平見表1.

表1 交聯(lián)正交實驗因素與水平

Table 1 Cross-linking orthogonal experimental factors and levels

pHθ/℃w/%t/h14.5300.1125.0350.5235.5401.03

1.4 脂肪酶吸附實驗方法

1.4.1 吸附溫度優(yōu)化

交聯(lián)固定化結束后，加入硅藻土載體，分別在20、25、30、35、40、45、50、55 ℃的恒溫搖床中吸附一定時間.吸附結束后將硅藻土取出，抽濾、烘干、測定酶活力.

1.4.2 吸附載體量優(yōu)化

交聯(lián)固定化結束后，分別加入質量為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g的硅藻土載體，在35 ℃的恒溫搖床中吸附一定時間，其他條件與1.4.1同.

1.4.3 吸附時間優(yōu)化

交聯(lián)固定化結束后，加入質量為1.5 g的硅藻土載體，在35 ℃的恒溫搖床中分別吸附1、2、4、6、8 h，其他條件與1.4.2同.

1.4.4 吸附正交實驗

在單因素實驗的基礎上選擇對固定化影響較大的因素設計3水平4因素的正交實驗，以相對酶活力為指標，正交實驗的因素與水平見表2.

表2 吸附正交實驗因素與水平

Table 2 Adsorption orthogonal experimental factors and levels

θ/℃m/gt/h1301.042351.553402.06

1.5 固定化酶的酶學性質鑒定

1.5.1 最適反應溫度

保持反應緩沖液不變，分別在不同的溫度(25 ℃～55 ℃，每隔5 ℃設一個梯度)下測定固定化酶與游離酶的酶活力.

1.5.2 最適反應pH

用濃度為0.05 mol/L的磷酸鈉緩沖液分別設置5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的pH梯度，在40 ℃下測定固定化酶和游離酶的最適反應pH.

1.5.3 熱耐受性

分別將固定化酶和游離酶在不同的溫度環(huán)境(30 ℃～70 ℃，每隔10 ℃設置一個梯度)放置3 h，再測定酶活力，探究固定化酶和游離酶對熱的耐受性.

1.5.4 pH耐受性

分別將固定化酶和游離酶在不同的pH環(huán)境(5.0～9.0，每隔1.0設置一個梯度)放置3 h，再測定酶活力，探究固定化酶和游離酶對酸堿的耐受性.

1.5.5 儲存穩(wěn)定性

將制備好的固定化酶抽濾、烘干，放置在4 ℃冰箱保存.每隔一定時間測定其酶活力，以第1次測得的酶活力為100%，探究固定化酶的儲存穩(wěn)定性.

1.5.6 操作穩(wěn)定性

將制備好的固定化酶抽濾、烘干，準確稱取質量0.1 g，在40 ℃，pH 7.0的條件下連續(xù)反應6次，以第1次測得的酶活力為100%，探究固定化酶的操作穩(wěn)定性.

2 結果與分析

2.1 固定化條件對交聯(lián)效果的影響

2.1.1 交聯(lián)劑的篩選

本實驗選擇了戊二醛、新戊二醇二縮水甘油醚、聚戊二醇二縮水甘油醚和乙二醇縮水甘油醚4種交聯(lián)劑進行篩選，設置不添加任何交聯(lián)劑的空白組作為對照.結果顯示以新戊二醇二縮水甘油醚為交聯(lián)劑時，固定化效果最好，因此選擇新戊二醇二縮水甘油醚作為后續(xù)實驗的交聯(lián)劑.在這4種交聯(lián)劑中，由于戊二醛具有一定毒性，與酶的交聯(lián)反應劇烈，對酶蛋白活性的損害比較大，因此比空白組酶活力低.其余3種交聯(lián)劑屬于新型環(huán)氧交聯(lián)劑，環(huán)氧基團與酶的交聯(lián)反應相對溫和可控，對酶的活性損害較小.

本實驗結果顯示所篩選出的最佳交聯(lián)劑為新戊二醇二縮水甘油醚，而此前先吸附后交聯(lián)實驗中篩選出的最佳交聯(lián)劑為乙二醇縮水甘油醚[17].可能原因是新戊二醇二縮水甘油醚和乙二醇縮水甘油醚相比，與脂肪酶發(fā)生的化學反應更有利于脂肪酶的共價交聯(lián)聚集和酶活力的保留.

2.1.2 交聯(lián)劑質量分數優(yōu)化

使用質量分數分別為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的新戊二醇二縮水甘油醚，交聯(lián)吸附后測定酶活力.隨著交聯(lián)劑質量分數增加，固定化效果逐漸提升，在質量分數為1.0%時達到最佳固定化效果；之后隨著質量分數增加酶活力呈下降趨勢，因此最適交聯(lián)劑質量分數為1.0%(圖1A).新戊二醇二縮水甘油醚交聯(lián)劑在低劑量時，酶分子之間結合較弱.隨著交聯(lián)劑質量分數升高酶分子之間結合逐漸增強，在交聯(lián)劑質量分數過高時，交聯(lián)反應比較激烈[18]，過高的交聯(lián)劑質量分數加劇了酶活力損失，導致酶活力下降.

2.1.3 pH對交聯(lián)固定化的影響

使用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液進行pH對脂肪酶交聯(lián)固定化影響實驗.隨著pH的增大酶活力也逐漸增大，在pH 5.0時達到最高值，之后酶活力隨著pH增大而下降.說明強酸性環(huán)境對海洋脂肪酶的交聯(lián)固定化有很大的影響(圖1B).

2.1.4 溫度對交聯(lián)固定化的影響

隨著交聯(lián)溫度升高，固定化脂肪酶的酶活力也逐漸提升，35 ℃時達到最高值；之后酶活力隨著溫度升高而緩慢下降(圖1C).溫度從低溫逐漸升高時，酶分子的熱運動逐漸變快[22]；但是過高的溫度會使蛋白質變性，當溫度升高到35 ℃之后，酶蛋白的結構和功能受到影響，因此酶活力下降.

A: 交聯(lián)劑質量分數對脂肪酶固定化的影響；B: pH對脂肪酶固定化的影響；C: 交聯(lián)溫度對脂肪酶固定化的影響；D: 交聯(lián)時間對脂肪酶固定化的影響.A: Effect of crosslinker’s concentration on the immobilization of lipase; B: Effect of pH on the immobilization of lipase; C: Effect of temperature on the immobilization of lipase; D: Effect of immobilizing time on the immobilization of lipase.

2.1.5 時間對交聯(lián)固定化的影響

隨著交聯(lián)時間的增加酶活力逐漸增大，在2 h時達到最大值，之后酶活力隨時間增加而下降(圖1D).隨著交聯(lián)的進行，交聯(lián)劑逐漸發(fā)揮作用使酶分子發(fā)生聯(lián)結，在2 h時達到峰值.隨后繼續(xù)交聯(lián)可能會使已經聯(lián)結的酶分子分離或失活，從而導致酶活力下降.

2.1.6 交聯(lián)正交實驗結果

設置4因素3水平的正交表，得出最佳交聯(lián)pH是5.5，最佳交聯(lián)溫度是35 ℃，最佳交聯(lián)劑質量分數是0.5%，最佳交聯(lián)時間是2 h.主次影響因素：pH?溫度?時間?質量分數(表3).

表3 交聯(lián)正交實驗結果與分析Table 3 Cross-linked orthogonal experiment results and analysis

2.2 脂肪酶吸附實驗

2.2.1 溫度對吸附固定化的影響

隨著溫度升高固定化酶的酶活力逐漸提升，在35 ℃達到最大值后逐漸下降(圖2A).溫度對吸附的影響機理與對交聯(lián)的影響相似，在一定范圍內，溫度升高時酶分子的熱運動變快，吸附效果也逐漸提升.35 ℃后，溫度提升可能會使蛋白質變性或者酶從載體上脫落，從而導致吸附效果下降，因此最適吸附溫度為35 ℃.

2.2.2 載體質量對吸附固定化的影響

隨著載體質量的增加固定化酶的酶活力逐漸提升，在質量為1.5 g時達到最大值后快速下降，因此最適載體質量為1.5 g(圖2B).等體積等濃度的酶液中加入不同質量的載體，載體所吸附的酶分子濃度也不相同，亦相當于加入不同濃度的酶液進行吸附固定化.載體質量較少時，單位質量載體所吸附的酶分子過多，造成硅藻土載體孔隙堵塞；載體質量過多時，單位質量載體所吸附的酶分子又過少，所以酶活力開始下降.

2.2.3 時間對吸附固定化的影響

隨著吸附時間的增長酶活力逐漸增大，在6 h達到最高，之后下降(圖2C).隨著吸附時間的延長，硅藻土的孔隙吸附的酶分子逐漸增多，酶活力增強；而當硅藻土載體過長時間浸泡在酶液中，孔隙吸附的酶分子飽和導致阻塞，酶促反應使酶分子不能充分展開，所以酶活力降低.

2.2.4 吸附正交實驗

設置3因素3水平的正交表，得出最佳吸附溫度是40 ℃，最佳吸附載體質量是1.5 g，最佳吸附時間是5 h(表4).主次影響因素：溫度?載體質量?時間.綜合交聯(lián)和吸附最優(yōu)結果，在該條件下固定化酶的酶活力為1.89 μkat，酶活力回收率為72.89%.

A: 溫度對脂肪酶吸附固定化的影響；B: 載體質量對脂肪酶吸附固定化的影響；C: 吸附時間對脂肪酶吸附固定化的影響.

A: Effect of temperature on the immobilization of lipase; B: Effect of quality of kieselguhr on the immobilization of lipase; C: Effect of immobilizing time on the immobilization of lipase.

圖2 吸附條件對吸附固定化的影響

2.3 酶學性質鑒定

2.3.1 最適反應溫度

固定化酶和游離酶分別在25、30、35、40、45、50、55 ℃的溫度下測定酶活力，以便測得其最適反應溫度.隨著反應溫度的升高，固定化酶與游離酶的酶活力都逐漸升高，而且都在45 ℃時達到峰值.但是游離酶在最適反應溫度45 ℃之前酶活力波動較大，溫度超過45 ℃后酶活力急速下降.而固定化酶在25 ℃～45 ℃時酶活力受溫度影響較小，超過45 ℃后酶活力下降幅度小.特別是在55 ℃的高溫下反應固定化酶能維持80%的酶活力，而該溫度下游離酶的酶活力下降到70%左右.因此，相比游離酶，固定化酶的熱穩(wěn)定性有所提高(圖3A).

2.3.2 最適反應pH

固定化酶和游離酶液分別在pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的條件下測定酶活力.固定化酶的最適反應pH為8.0，而游離酶最適反應pH為6.5.相比游離酶，固定化酶的最適反應pH提高了1.5.游離酶的酶活力變化在65%～100%的范圍內，說明游離酶對pH比較敏感，在不同pH環(huán)境中反應不穩(wěn)定.而固定化酶的酶活力變化范圍在95%～100%內，說明固定化酶在不同pH環(huán)境中反應比較穩(wěn)定(圖3B).

2.3.3 熱耐受性

固定化酶和游離酶分別在30、40、50、60、70 ℃的環(huán)境中放置3 h，再分別測定剩余的酶活力.環(huán)境溫度越高，固定化酶和游離酶剩余的酶活力越低.在30 ℃～60 ℃的環(huán)境中，兩者的酶活力穩(wěn)步下降；但是當溫度超過60 ℃時，游離酶的酶活力急劇下降，而固定化酶的酶活力下降相對緩慢.因此固定化酶的高溫熱耐受性比游離酶有所提高(圖3C).

2.3.4 pH耐受性

固定化酶和游離酶分別在pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的環(huán)境中放置3 h，再分別測定剩余的酶活力.在pH 5.0～8.0，固定化酶剩余的酶活力明顯比游離酶高.因此，在酸性和中性反應環(huán)境中，固定化酶的pH耐受性比游離酶好(圖3D).

2.3.5 儲存穩(wěn)定性

將固定化酶儲存于4 ℃冰箱，每隔一定時間測定其酶活力.固定化酶在4 ℃冰箱儲存穩(wěn)定性較好，雖然隨著儲存時間增長酶活力有些許下降，但是下降趨勢平緩，第42天時保持90.26%的酶活力，2個月后剩余87%以上的酶活力(圖3E).因此本研究中制備的固定化酶在低溫條件下具有較好的穩(wěn)定性，酶活性損失較小.

2.3.6 操作穩(wěn)定性

將固定化酶進行連續(xù)反應，測試其機械穩(wěn)定性.隨著操作次數增加，酶活力逐漸降低，第4次操作后酶活力能保留83%，第5次后保留60%以上(圖3F).因此本實驗制備的固定化酶有較好的操作穩(wěn)定性.

3 討論

本研究中，先使用新型雙環(huán)氧試劑新戊二醇二縮水甘油醚對脂肪酶進行交聯(lián)固定化，而后使用硅藻土載體進行吸附固定化.通過正交實驗，確定了最佳交聯(lián)固定化工藝條件：最佳交聯(lián)pH 5.5，最佳交聯(lián)溫度35 ℃，最佳交聯(lián)劑質量分數0.5%，最佳交聯(lián)時間2 h.最佳吸附固定化工藝條件：最佳吸附溫度40 ℃，最佳吸附載體質量1.5 g，最佳吸附時間5 h.在此工藝條件下，所制備的固定化脂肪酶活力為1.89 μkat，酶活力回收率為72.89%.

在獲得交聯(lián)-吸附最佳條件后，利用該條件制備出固定化脂肪酶，并對脂肪酶的性質進行鑒定.得出:①所制備的固定化酶與游離酶的最適反應溫度都是45 ℃.熱穩(wěn)定性基本接近，但是在溫度高于60 ℃時，固定化酶的熱穩(wěn)定性明顯高于游離酶.②固定化酶的最適pH為8.0，而游離酶的最適pH為6.5，最適反應pH提高1.5.此外，固定化酶的pH穩(wěn)定性比游離酶有了大的提高，在pH 5.0～8.0下保持很好的穩(wěn)定性.③固定化酶在4 ℃冰箱保存60 d，依然保持87%以上的酶活力，說明該固定化酶有良好的儲存穩(wěn)定性.④固定化酶連續(xù)操作5次后保持60%以上的酶活性，而游離酶只能操作1次，說明該固定化酶具有較好的操作穩(wěn)定性.

A:最適反應溫度；B:最適反應pH；C:熱耐受性；D:pH耐受性；E:儲存穩(wěn)定性；F:操作穩(wěn)定性.

本研究是使用交聯(lián)-吸附相結合的實驗方案，相比于單一固定化方法，交聯(lián)法和吸附法的結合克服了各自的缺點同時又發(fā)揮了各自的優(yōu)點.同時，本研究選擇了新型的環(huán)氧交聯(lián)劑-新戊二醇二縮水甘油醚.此前的固定化工作中，通常選用戊二醛作為雙功能交聯(lián)劑[25-27]，但是戊二醛與酶蛋白的交聯(lián)反應非常劇烈而且不可控，對酶蛋白活力的損害較大[14].相比戊二醛，新型的環(huán)氧交聯(lián)劑與酶蛋白的交聯(lián)反應較為溫和，條件更為可控.在此次交聯(lián)劑種類篩選實驗中，也證明了使用新型的環(huán)氧交聯(lián)劑效果明顯優(yōu)于戊二醛.

本研究采用先交聯(lián)后吸附的固定化方法，所制備的固定化酶的回收率為72.89%，高于先吸附后交聯(lián)的固定化方法.比如，本實驗室曾利用硅藻土先吸附后交聯(lián)海洋脂肪酶[17]，酶活力回收率為67.31%；孫玉英等[28]使用吸附-交聯(lián)法固定化混合酶，酶活力回收率為65.00%；魚園等[29]以硅藻土為載體吸附固定化磷脂酶D，酶活力回收率為65.00%.

綜上所述，本研究對先交聯(lián)后吸附法制備固定化脂肪酶的工藝技術和所制備的固定化酶的性質進行了系統(tǒng)的研究，為后續(xù)的基于硅藻土的交聯(lián)-吸附法固定化工業(yè)酶研究提供了參考，相較于先吸附后交聯(lián)的固定化方法具有一定的優(yōu)勢，有較好的工業(yè)應用前景.