LY354740改善氯胺酮暴露引起青春期C57BL/6小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能損害與焦慮

溫博倫, 陳偉明, 陳曉彤, 詹鴻, 周立兵, 王壽平

(1.廣州醫(yī)科大學(xué) 附屬第三醫(yī)院麻醉科, 廣東 廣州 510150; 2.中山大學(xué) 孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院， 廣東 廣州 510000; 3.粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院， 廣東 廣州 510000)

氯胺酮是目前世界上兒童、青少年患者常用的全麻藥物之一，具有同時鎮(zhèn)靜及鎮(zhèn)痛的特點(diǎn)[1].然而其亦是社會上年輕人娛樂濫用的毒品之一.有研究報道氯胺酮可分別通過誘發(fā)谷氨酸毒性、激活炎癥通路、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷等多種方式引起神經(jīng)發(fā)育障礙、神經(jīng)元凋亡、壞死、功能異常等現(xiàn)象，此等病理生理改變均可導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病加速發(fā)展[2-5].另外，人體試驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)均表明長期濫用者均有不同程度的認(rèn)知功能障礙及不同類型的情緒障礙.青少年時期學(xué)習(xí)記憶、情緒、辨別是非等能力方面很容易受影響，屬于較脆弱或不穩(wěn)定期，如若合并有氯胺酮暴露史甚至濫用，很有可能造成比預(yù)期嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)功能的損害.因此，明確氯胺酮損傷機(jī)制并探索可能的防治措施具有重要臨床及社會意義.促代謝性谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptors, mGluRs)在突觸傳遞調(diào)控過程中扮演重要角色，通過與G蛋白耦聯(lián)調(diào)節(jié)離子型受體功能，對以谷氨酸為主遞質(zhì)傳遞進(jìn)行調(diào)控.有研究指出代謝性谷氨酸2型及3型受體(mGluR2/3s)激動劑LY354740能有效改善與認(rèn)知功能相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[2, 6]，至于其是否能改善氯胺酮誘發(fā)的認(rèn)知功能下降仍未有明確定論.本研究擬探究LY354740預(yù)先給藥處理是否能通過調(diào)控谷氨酸釋放，改善氯胺酮引起青春期C57BL/6小鼠學(xué)習(xí)記憶功能及情緒異常改變.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

選取健康雌性SPF 級C57BL/6 小鼠39只，6～8周齡，體質(zhì)量(20±5)g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(許可證號：SCXK 2013-0002)，于室內(nèi)溫度22℃，濕度50%，小鼠自由飲水和攝食.采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其分為3組(n=13):空白對照組(C組)、氯胺酮組(K 組)及LY354740干預(yù)組(L組).

1.2 方法

1.2.1 用藥干預(yù)小鼠制備

K 組和L 組均腹腔注射氯胺酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)30 mg/kg(質(zhì)量濃度為50 mg/mL，福建古田藥業(yè)有限公司)，每隔30 min 重復(fù)注射1次，每天注射氯胺酮3 次，連續(xù)2 周.L 組在首次注射氯胺酮前30 min注射LY354740(MCE公司，HY-18941，50 mg配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液)質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 mg/kg，C 組注射等量生理鹽水.于給藥前(D0)、第1天給藥后(D1)、第4天給藥后(D4)、第7天給藥后(D7)、第14天給藥結(jié)束(D14)共5個時間點(diǎn)對小鼠體質(zhì)量進(jìn)行測量，以評估生長狀況.

1.2.2 海馬組織谷氨酸濃度測定

每組從中各取3只，第1天給藥結(jié)束30 min行頸椎脫臼，冰面上迅速取新鮮海馬組織，按每克組織加入BioVision Glutamate Colorimetric Assay Kit中的Assay Buffer 2 mL，冰浴勻漿，4 ℃ 13 000g離心15 min，取上清液于滅菌EP管，按說明書步驟進(jìn)行谷氨酸濃度測定，結(jié)果以μmol/g表示.

1.2.3 行為學(xué)檢測

余下小鼠繼續(xù)前述方法每日重復(fù)給藥.末次注射24 h 后進(jìn)行行為學(xué)測試，包括曠場實(shí)驗(yàn)測試、Morris 水迷宮，以評估認(rèn)知功能.①末次注射后第1天行曠場試驗(yàn).從小鼠放置在中央格時計(jì)時，記錄5 min內(nèi)中央?yún)^(qū)活動時間、周邊區(qū)活動時間、總路程及平均速率.②曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)束后1 d行Morris水迷宮測試.在定位航行實(shí)驗(yàn)中，記錄小鼠游泳速率和逃避潛伏期.在定位航行試驗(yàn)第4 天完成之后行空間探索試驗(yàn).此時平臺從第NW象限移除.小鼠從定位航行實(shí)驗(yàn)平臺放置象限相對的象限即SE象限入水，每次進(jìn)入小鼠游泳60 s 后停止.記錄原平臺區(qū)域穿越次數(shù)和到達(dá)原平臺區(qū)潛伏期.

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 造模用藥與干預(yù)措施

造模用藥與干預(yù)措施未引起青春期C57BL/6小鼠明顯生長發(fā)育抑制，各組小鼠各時點(diǎn)體質(zhì)量比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，圖1).

D0和D1各組n=13，D4、D7和D14各組n=10.

At D0 and D1,n=13 in each group; at D4, D7 and D14,n=10 in each group.

圖1 各時間點(diǎn)各組小鼠體質(zhì)量變化比較

Fig.1 Changes of body weight in mice at different time points

2.2 LY354740預(yù)先給藥可抑制氯胺酮誘發(fā)的海馬組織谷氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升

與C組比較，K組的谷氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，L組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，圖2).

與C組比較，1)P<0.01.

2.3 LY354740預(yù)先給藥能改善氯胺酮導(dǎo)致的焦慮水平上升

各組小鼠的平均速度、總移動路程均沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).與C組相比，K、L組在中心區(qū)活動時間均相應(yīng)縮短，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，且K組穿越中央?yún)^(qū)次數(shù)明顯減少(P<0.01)，而L組穿越中央?yún)^(qū)次數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).L組中央?yún)^(qū)指標(biāo)相比K組有明顯改善，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，圖3).

2.4 LY354740預(yù)先給藥能改善氯胺酮所導(dǎo)致的空間學(xué)習(xí)記憶能力損害

(1)5 d的水迷宮實(shí)驗(yàn)中各組的平均速度均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).

與C組比較， 1)P<0.01；與K組比較，2)P<0.05.

Compared with group C, 1)P<0.01; compared with group K, 2)P<0.05.

A:移動總路程；B:平均運(yùn)動速度，評價小鼠在曠場中自主運(yùn)動情況；C:中央?yún)^(qū)停留時間；D:中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)，以評價焦慮水平指標(biāo).E:a、b、c依次為C組、K組、L組小鼠運(yùn)動路徑.

A: Total distance moved during the trial; B: Mean velocity for evaluating autonomous movement of mice; C: Duration in centre; D: Entries in centre, an index for evaluating anxiety; E:a, b and c respectively representing tracks of mice in group C, group K and Group L.

圖3 各組小鼠在曠場實(shí)驗(yàn)指標(biāo)及路徑

Fig.3 Results and tracks of open field test

(2) 定位航行實(shí)驗(yàn)中，與C組比較，K組在第3、4天的逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)，L組第4天無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與K組相比，L組第4天逃避潛伏期縮短(P<0.05).

(3) 空間探索實(shí)驗(yàn)中，與C組相比，K組到達(dá)原平臺位置潛伏期明顯延長(P<0.01)，穿越原平臺次數(shù)減少(P<0.05)，而L組回到原平臺位置潛伏期延長(P<0.05)，穿越原平臺次數(shù)未有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與K組相比，L組回到原平臺位置潛伏期明顯縮短，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，穿越原平臺次數(shù)則未有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，圖4).

3 討論

氯胺酮是一種非競爭性NMDA受體拮抗劑，由于其價格低廉，并且同時提供鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛效果，目前在許多發(fā)展中及落后國家、地區(qū)仍在廣泛使用.有相當(dāng)多的研究及報道指出氯胺酮麻醉與術(shù)后認(rèn)知功能障礙發(fā)生關(guān)系密切.氯胺酮濫用在青少年、成年人群體并沒有明顯減少的趨勢，其濫用者均會出現(xiàn)不同程度的認(rèn)知功能損害，不僅影響個人身心健康，而且對家庭及社會產(chǎn)生沉重負(fù)擔(dān).由于目前對氯胺酮損害認(rèn)知功能的機(jī)制尚未明確，因此仍需要積極尋找防治措施.

與C組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與K組比較，3)P<0.05，4)P<0.01.

Compared with group C, 1)P<0.05, 2)P<0.01; compared with group K, 3)P<0.05, 4)P<0.05.

A:前4 d定位航行平均速度；B:空間探索平均速度；C:定位航行4 d各組逃避潛伏期變化： D、E:空間探索指標(biāo);F:游泳軌跡圖.

A: Mean velocity in the 4-day navigation test; B: Mean velocity in spatial exploration test; C: Latency to the platform in the 4-day navigation test; D and E: Indexes for evaluating spatial exploration test; F: Swimming tracks of mice among groups.

圖4 水迷宮實(shí)驗(yàn)各組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)及軌跡圖

Fig.4 Results and tracks of water maze test

陳晨等[7]的一項(xiàng)研究表示亞麻醉劑量對老年大鼠認(rèn)知功能并沒有影響，而麻醉劑量則會導(dǎo)致認(rèn)知功能下降.小劑量氯胺酮進(jìn)入腦內(nèi)首先拮抗的是分布在GABA能神經(jīng)元上的N甲基-D-天冬氨酸(N-methyl D-aspartic acid receptor, NMDA)受體，對邊緣系統(tǒng)產(chǎn)生興奮作用.此種效果使得小劑量單次應(yīng)用氯胺酮預(yù)防術(shù)后認(rèn)知功能障礙成為可能.本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用反復(fù)多次小劑量的氯胺酮后，小鼠出現(xiàn)興奮行為，而并非鎮(zhèn)靜，檢測結(jié)果提示海馬區(qū)興奮性谷氨酸增加與后期出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能損害及焦慮水平上升有關(guān).本結(jié)果與一些氯胺酮誘發(fā)嚙齒動物認(rèn)知功能損害的研究均提示學(xué)習(xí)記憶功能障礙可能與氯胺酮誘發(fā)的谷氨酸濃度明顯升高有關(guān)[8-9]，暗示谷氨酸興奮性毒性參與認(rèn)知功能損害.

mGlu2/3型受體激動劑LY354740能激動在突觸前膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上的mGlu2/3型受體，改善突觸傳遞[10].顧兵等[11]亦指出激動mGlu2/3型受體能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用.本研究結(jié)果顯示，LY354740預(yù)先給藥能預(yù)防隨后氯胺酮暴露誘發(fā)的小鼠海馬區(qū)谷氨酸質(zhì)量濃度明顯升高.該組數(shù)據(jù)未與模型組產(chǎn)生明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與樣本量較小有關(guān)，但其變化趨勢仍提示mGlu2/3型受體參與谷氨酸調(diào)控，能改善氯胺酮導(dǎo)致的焦慮情緒及空間學(xué)習(xí)記憶功能.有研究者應(yīng)用谷氨酸脫羧酶抑制劑增加內(nèi)源性mGlu2/3型受體激動物質(zhì)N-乙酰-天冬氨酰谷氨酸的質(zhì)量濃度，減少細(xì)胞間隙谷氨酸質(zhì)量濃度，可以減輕另一種NMDA受體拮抗劑MK801對認(rèn)知功能的損害作用[12]，說明mGlu2/3型受體有很大可能成為緩解谷氨酸興奮性毒性相關(guān)疾病的重要治療靶點(diǎn).

一項(xiàng)對mGlu2/3型受體激動劑LY2140023治療精神分裂癥的臨床試驗(yàn)中，與標(biāo)準(zhǔn)抗精神病藥對比，LY2140023沒有對陽性或陰性癥狀產(chǎn)生更大的治療作用，但不能否定的是mGlu2/3型受體仍然是神經(jīng)保護(hù)、抗精神病方面有前景的治療靶點(diǎn)[13].近年，表觀遺傳學(xué)在麻醉毒性的預(yù)防與治療及神經(jīng)精神疾病治療中的指導(dǎo)性日益增加，表觀遺傳可為此類疾病的防治提供啟示[14].mGlu2/3型受體作為精神疾病治療的靶點(diǎn)仍具有巨大的潛力[15]，因而目前需要更深入的研究或者開發(fā)新的mGlu2/3型受體相關(guān)藥物.

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明氯胺酮引起海馬區(qū)谷氨酸質(zhì)量濃度升高，可導(dǎo)致青春期C57BL/6小鼠的認(rèn)知功能損害，LY354740預(yù)先給藥能有效減輕氯胺酮所導(dǎo)致的焦慮及學(xué)習(xí)記憶缺陷，可能與其激動mGlu2/3型受體減少海馬區(qū)谷氨酸，減輕谷氨酸興奮性神經(jīng)毒性有關(guān).