核磁共振氟譜法測定氟他胺含量的實驗設計

鄧冬艷， 宋紅杰， 齊 悅

(四川大學 化學學院，成都 610064)

0 引 言

氟他胺(FLA，2-甲基-N-[4-硝基-3-三氟甲基苯基]丙酰胺)為非甾體類雄激素拮抗劑。該藥物及其初級羥基代謝產(chǎn)物可通過第二性器官的靶細胞中的細胞色素P-450系統(tǒng)減少C-19甾體的代謝。能在細胞水平與雄激素競爭雄性激素受體，抑制雄激素依賴性的腫瘤細胞生長，進而達到抑制前列腺癌生長的目的，能較好地緩解前列腺癌骨轉(zhuǎn)移所帶來的疼痛[1-3]。目前，報道的氟他胺的分析方法包括分光光度法[4]、氣相色譜法[5]、高效液相色譜法[6-7]、電化學法[8-10]以及化學發(fā)光法[11]等。這些方法通常存在冗雜的樣品制備、繁瑣分析方法的構(gòu)建等缺點。而基于核磁共振波譜法分析研究氟他胺尚未見報導。目前核磁共振技術已經(jīng)被納入中國藥典，廣泛用于藥品含量的定量分析。由于氟他胺含有氟原子，設想利用靈敏度高的核磁共振氟譜法(19F NMR)對氟他胺進行定性與定量分析。

核磁共振檢測不破壞樣品結(jié)構(gòu)，能夠保持體系的完整。而核磁共振氟譜測試無需使用氘代試劑，可以在任何溶液體系下進行檢測。由于含氟化學藥品的不斷增加，定性用核磁共振氟譜日益受到關注，但是19F NMR定量技術用于含氟化學藥品含量測定的研究還很少[12-15]。從天然豐度等方面考慮，核磁共振氟譜的檢測靈敏度和氫譜相當(≈0.83倍)[13]，其測試時間及樣品濃度均遠小于13C、15N與31P譜。但是相比于核磁共振氫譜，氟譜具有更寬的化學位移范圍，信號峰重疊少，易于分辨并進行峰強度的比較。同時，常見含氟化學藥品中大多數(shù)只含有1種或2種不同化學環(huán)境的氟原子，使得19F NMR譜復雜程度遠小于1H NMR譜。由此，利用19F NMR定量技術進行含氟化學藥品的含量測定具有顯著優(yōu)勢，可為準確測定該類藥品的含量提供一種快速、準確且干擾較小的研究方法。

本文設計了利用核磁共振氟譜技術測定氟他胺含量的實驗。實驗通過設定適宜的測試參數(shù)，選取三氟甲苯為內(nèi)標物，利用化學位移標定歸屬，進一步由特征峰的相對積分值進行定量分析。該實驗方法簡單，重復性好，易于實現(xiàn)。

1 實 驗

1.1 主要試劑、材料與儀器

試劑與材料：本實驗中所用全部試劑均為分析純及以上。氘代氯仿購自青島騰龍微波科技有限公司，氟他胺及三氟甲苯(1.188 6 g/mL)購于阿拉丁試劑公司。

試驗儀器：核磁共振波譜儀(AVANCE III HD, 400 MHz, Bruker, Germany)。儀器相關信息，1H 400.13 MHz；19F 376.47 MHz。

1.2 樣品制備

1.2.1 內(nèi)標物溶液的配制

吸取0.10 mL三氟甲苯至9.90 mL 氘代氯仿配成11.886 mg/mL的儲備液待用。

1.2.2 氟他胺標準溶液的配制

稱取氟他胺標準品至氘代氯仿配制濃度為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mg/mL的標準溶液，分別加入0.05 mL內(nèi)標物溶液，然后移至核磁管內(nèi)。

1.3 檢測方法

1.3.11H NMR測定

氫譜分析條件：測定溫度25 °C；檢測頻率400.13 MHz；譜寬7 211.54 Hz；脈沖寬度12.0 μs；采集時間4.54 s；延遲時間1.0 s；增益值80.6；采集100次。

對配制好的氟他胺標準溶液進行核磁氫譜測定，設置參數(shù)后做1H NMR譜圖。吸收峰準確定標，調(diào)整峰相位，使峰形左右對稱，調(diào)整基線。

1.3.219F NMR測定

氟譜分析條件：測定溫度25 °C；檢測頻率376.47 MHz；譜寬5 647.59 Hz；脈沖寬度13.5 μs；采集時間11.6 s；延遲時間1.0 s；增益值203；采集64次。

對配制好的氟他胺標準溶液進行核磁氟譜測定。設置參數(shù)后做19F NMR譜圖。吸收峰準確定標，調(diào)整峰相位，使峰形左右對稱，調(diào)整基線。

1.3.3 標準曲線的繪制及重復性實驗的測定

將配制好的濃度為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mg/mL的氟他胺系列標準溶液，分別加入50 μL三氟甲苯內(nèi)標物溶液，進行19F NMR測定。對氟他胺和三氟甲苯內(nèi)標物的特征峰進行積分，標識為S1和S2。然后以樣品積分面積與內(nèi)標物的積分面積比S1/S2為縱坐標，以樣品的濃度與內(nèi)標物的濃度比C1/C2為橫坐標，繪制標準曲線。

取上述同一氟他胺標準品溶液放入核磁管進行氟譜掃描，按照1.3.2的操作方法連續(xù)測定5次，每次譜圖反復積分3次，記錄氟他胺定量峰與三氟甲苯內(nèi)標峰積分面積比值，計算相對標準偏差(RSD)。

2 結(jié)果與討論

2.1 氟他胺核磁共振氫譜分析

測定氟他胺標準品1H NMR，結(jié)果如圖1所示。標定氘代氯仿的殘余溶劑峰δ為7.26×10-6，可得氟他胺氫譜信號峰主要出現(xiàn)在(1.0～8.5)×10-6之間，各信號峰的歸屬分析結(jié)果表明其符合化合物結(jié)構(gòu)。

圖1 氟他胺標準品在氘代氯仿中的1H NMR譜圖

2.2 內(nèi)標物和定量峰的選擇

根據(jù)內(nèi)標物的選擇要求[13]，擬選取的三氟甲苯具有較高的純度，化學性質(zhì)穩(wěn)定；與被測物質(zhì)氟他胺的化學性質(zhì)相近，不與樣品中的物質(zhì)發(fā)生反應。

由圖2可知，內(nèi)標物的特征峰與被測物的特征峰完全分離，不存在干擾；對不同的物質(zhì)峰進行歸屬，在化學位移δ=-61.10×10-6和δ=-63.72×10-6出現(xiàn)兩個較大的尖銳峰，且無其他雜峰干擾。因此，三氟甲苯可選作內(nèi)標物。同時，三氟甲苯分子只含有一種氟原子，根據(jù)圖2內(nèi)插圖可得，δ=-63.72×10-6處信號為三氟甲苯的特征峰，則δ=-61.10×10-6處為氟他胺的特征峰，該峰峰形尖銳，易于積分用于定量分析，故選作定量峰。本工作選擇氘代氯仿作為溶劑，能夠很好地溶解氟他胺和三氟甲苯，且氘代氯仿不含氟，亦不會干擾內(nèi)標物和分析物的譜峰。內(nèi)標物及分析物的19F NMR譜見圖2。

圖2 氟他胺與三氟甲苯在氘代氯仿中的19F NMR譜(注: a為氟他胺，b為三氟甲苯；內(nèi)插為三氟甲苯在氘代氯仿中的19F NMR譜)

2.3 線性關系考察

準確配制濃度為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mg/mL的氟他胺系列標準溶液，分別加入50 μL內(nèi)標物溶液，測試19F NMR譜圖，結(jié)果如圖3所示。

圖3 核磁共振氟譜測定氟他胺的積分面積與濃度線性關系

結(jié)果表明，氟他胺濃度為0.2～10.0 mg/mL時，S1/S2與C1/C2呈現(xiàn)良好的線性關系，回歸方程為y=0.574x-0.053，相關系數(shù)R2=0.996。表明以三氟甲苯為內(nèi)標物，核磁共振氟譜法用于氟他胺的定量測定線性關系良好，該方法是可行的。

2.4 定量限與檢出限

采用設定的氟譜測試條件，本實驗以信噪比S/N>10作為定量限的標準，以S/N>3作為檢出限的標準。由此，計算得到氟他胺的定量限為18 μg/mL，檢出限為50 μg/mL。而線性關系曲線中氟他胺溶液的最低濃度為0.2 mg/mL，滿足定量限的要求。

2.5 重復性實驗

取上述同一氟他胺標準品溶液(2.0 mg/mL)放入核磁管進行氟譜掃描，按照1.3.2的操作方法連續(xù)測定5次，每次譜圖反復積分3次，記錄氟他胺定量峰與三氟甲苯內(nèi)標峰積分面積比值。所得的RSD為1.94%。表明該方法的精密度良好，實驗結(jié)果見表1。

表1 氟他胺精密度實驗結(jié)果

3 結(jié) 語

本實驗以三氟甲苯為內(nèi)標物，利用化學位移標定歸屬，進一步由相對積分值進行定量分析。利用核磁共振技術，以化學位移δ=-61.10×10-6處的氟他胺的單峰作為定量峰，得到其峰面積比與其濃度比線性回歸方程為y=0.574x-0.053，線性關系良好，實現(xiàn)了氟他胺的核磁共振的準確含量測定。該實驗設計不僅拓展了19F核磁共振定量方法在含氟藥物含量測定中的應用，而且有效加強了學生對核磁共振定量分析方法的理解及相應科學實驗的思維方式和創(chuàng)新能力。