拳參總黃酮體外抑菌作用的初步研究*

王桂玲 費洪榮 趙雪梅 趙 瑩

山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)科院)，山東 泰安 271016

拳參為蓼科蓼屬植物拳參(Polygonum bistorta L.)的根莖, 別名紫參、山蝦、草河車等，主要分布在吉林、河北、山東、湖北、陜西等地?？?、澀，性寒，具有清熱解毒、止血、消腫等功效，用于治療赤痢、熱瀉、肺熱咳嗽、癰腫、痔瘡出血、蛇蟲咬傷等。拳參根莖中含有多種化學成分如：黃酮類，萜類、醌類、多糖、粘液質、樹脂等。近年來有許多文獻報道了蓼科蓼屬植物在抗腫瘤、抗氧化、止痛、抗菌、抗炎等方面的應用[1-4]。本研究是以拳參中總黃酮作為研究對象，研究其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制效果，并測定最低抑菌濃度(MIC)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

RE-52A旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；MPZ1002電子天平(上海恒平科學儀器有限公司)；FDU-1200冷凍干燥機(上海愛朗儀器有限公司)；島津UV-2500紫外-可見分光光度計(島津國際貿易(上海)有限公司)；TMQ.R-3250自動臺式滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)；KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SW-CJ-2F超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；HHB11電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市實驗儀器廠)

1.2 材料和試劑

拳參(濟南藥業(yè)集團中藥飲片廠)；蘆丁標準品(天津一方科技有限公司)；HPD-400型大孔吸附樹脂(河北滄州寶恩化工有限公司)；菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌(泰山醫(yī)學院形態(tài)學實驗室提供)；DMSO(分析純)(天津市凱通化學試劑有限公司)；其它試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 溶液配制

2.1.1標準品溶液的制備 精密稱取蘆丁標準品1 mg，甲醇溶解，定容至10 ml容量瓶中，配成質量濃度為0.1 mg/ml的蘆丁標準品溶液，保存，備用。

2.1.2AlCl3溶液的制備 稱取AlCl325 g，甲醇溶解，定容至250 ml容量瓶中，配成10%AlCl3溶液，保存，備用。

2.1.3樣品的制備 準確稱取拳參40 g，按最佳工藝條件[5]提取，10倍量55%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，回收乙醇，水溶液部分用石油醚萃取2次，萃取后的溶液分成2份，一份溶液采用冷凍干燥，制成粗粉，即粗品。另外一份溶液用濃鹽酸調節(jié)pH為3的上柱液，然后以流速1 ml·min-1上預處理的HPD-400型大孔吸附樹脂柱，吸附完全后，先以蒸餾水洗脫至無色，再用55%乙醇洗脫[6]，收集洗脫液，回收乙醇，水溶液部分進行冷凍干燥，制成粗粉，即精品。

2.2含量測定

2.2.1確定最大吸收波長 精密吸取“2.1.1”項蘆丁標準品溶液0.5 ml，置于10 ml比色管中，加甲醇至1 ml，再加10%的AlCl3溶液2 ml，搖勻，放置10 min，在紫外分光光度儀上200～600 nm區(qū)間掃描，確定最大吸收波長為415 nm。

2.2.2標準曲線的制備 精密吸取“2.1.1”項蘆丁標準品溶液0 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml,分別置于10 ml比色管中，各加甲醇至1 ml，再分別加入10%的AlCl3溶液2 ml，搖勻，放置10 min，在415 nm波長處測定吸光度，平行測定3次求平均值，以質量濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線，經(jīng)線性回歸，得回歸方程：A=13.656C+0.0404，R2=0.9969，表明在0.02～0.1 mg/ml線性關系良好。

2.2.3樣品含量的測定 準確稱取拳參總黃酮粗品及精品各10 mg，甲醇定容至10 ml容量瓶中，分別用移液管移取1 ml，置10ml比色管中，各加入10%的AlCl3溶液2 ml，搖勻，放置10 min，在415 nm波長處測定吸光度，代入“2.2.2”項標準曲線，計算黃酮的含量。

3 抑菌實驗

3.1 菌懸液的制備

在潔凈工作臺上，將供試菌株(金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大腸桿菌Escherichia coli)接入試管斜面培養(yǎng)基上。然后置于(35±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng) 18～24 h，將供試菌株活化，然后用滅菌的生理鹽水配制濃度為107～108cfu·ml-1的菌懸液，備用。

3.2 藥敏片的制備

取定性濾紙，用打孔機打成6 mm直徑的圓形小紙片，將濾紙片放入清潔干燥的培養(yǎng)皿中，高壓消毒滅菌后，備用。

3.3 總黃酮粗品及精品溶液的制備

分別稱取拳參總黃酮粗品及精品適量，各置于1.5 mlEP管中，各加入1 mlDMSO，超聲溶解，整個操作過程嚴格無菌。

3.4 總黃酮粗品及精品的抑菌活性測定

采用Kirby-Baue紙片擴散法：在無菌潔凈工作臺上，用涂抹法將各供試菌液接種在培養(yǎng)基上，制成含菌平板。用無菌鑷子夾取濾紙片浸泡在總黃酮粗品及精品及DMSO溶液中，然后夾取濾紙片放入培養(yǎng)皿中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h，空白對照為DMSO，觀察紙片周圍有無抑菌圈，并測量抑菌圈的直徑，以抑菌圈直徑d大小進行判斷(d>6 mm表示有抑菌作用；d≤6 mm表示無抑菌作用；mm6

表1 拳參總黃酮粗品及精品對供試菌的抑菌圈直徑

由表1可以看出，拳參總黃酮的粗品及精品對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有一定的抑制作用，根據(jù)抑菌圈直徑判斷，總黃酮精品對兩種菌抑制作用明顯，屬于高度敏感，總黃酮粗品對兩種菌抑制作用屬于中度敏感。

表2 拳參總黃酮精品對供試菌的最低抑菌濃度

由表2可以看出，拳參總黃酮精品對兩種菌都有較強的抑制作用，MIC 值分別為：金黃色葡萄球菌為0.08257 mg/ml，大腸桿菌為0.08257 mg/ml。

3.5 總黃酮粗品及精品最低抑菌濃度(MIC)測定

稱取拳參總黃酮粗品及精品溶液按二倍稀釋法稀釋成各種濃度，方法為各取滅菌EP管14支，各按照1至14編號。首先向管中各加入500 μl的DMSO，加500 μl的藥液于第1管中，混勻，從1號管中吸取500 μl溶液放入2號管，混勻，接著從2號管中吸取500 μl溶液放入3號管，依次逐管稀釋到第13管，第14管加入DMSO做空白對照。用無菌鑷子夾取濾紙片在各管溶液中進行浸泡，然后夾取濾紙片放入已接種菌液的培養(yǎng)皿中，DMSO為空白對照，放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h，觀察紙片周圍有無抑菌圈，并測量抑菌圈的直徑。以能抑制細菌生長的最低濃度為拳參總黃酮對該細菌的最低抑菌濃度(MIC)。結果如表2、3，圖1～4所示。

表3 拳參總黃酮粗品對供試菌的最低抑菌濃度

由表3可以看出，拳參總黃酮粗品對2種菌也有一定的抑制作用，MIC值分別為：金黃色葡萄球菌為0.2815 mg/ml，大腸桿菌為0.2815 mg/ml。

圖1 拳參總黃酮精品抑制金黃色葡萄球菌效果照片 圖2 拳參總黃酮精品抑制大腸桿菌的效果照片

圖3 拳參總黃酮粗品抑制金黃色葡萄球菌的效果照片 圖4 拳參總黃酮粗品抑制大腸桿菌的效果照片

抑菌實驗研究表明，拳參總黃酮粗品及精品對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有一定的抑制作用。拳參作為常用的中草藥，在我國分布廣泛，資源豐富，且含有多種活性成分，其含有的成分具有毒副作用小，不易產生耐藥性的特點，實驗結果表明拳參總黃酮在抗菌方面具有廣泛的應用潛力，有良好的應用前景。本研究為拳參藥理作用的進一步開發(fā)提供了實驗依據(jù)，同時也為拳參資源進一步開發(fā)和利用提供了參考。