Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化健脾祛濕丸水提工藝

依孜提·帕力哈提 馬建文 劉怡 張麗娟 李玉婷 王萍

摘要：目的 ?采用Box-Behnken響應(yīng)面法，優(yōu)化健脾祛濕丸的水提工藝。方法 ?以丹酚酸B、多糖含量及浸膏得率的綜合評分為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法考察浸泡時(shí)間、加水倍量和提取時(shí)間對水提工藝的影響。結(jié)果 ?最佳提取工藝為：浸泡1 h，加11倍量水，回流提取3次，每次1.20 h。結(jié)論 ?優(yōu)選的工藝方便、穩(wěn)定、可行，可為后續(xù)研究提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：健脾祛濕丸;水提工藝;丹酚酸B;多糖;Box-Behnken響應(yīng)面法

中圖分類號：R283.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）05-0092-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.020 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Objective To optimize the water extraction process of Jianpi Qushi Concentrated Pills by using box-behnken response surface method. Methods Salvianolic acid B， total polysaccharide content and extract yield were set as the evaluation indexes. On the basis of single factor experiment results， the Box-Behnken response surface method was used to investigate the effects of soak time， adding water amount times and extracting time on the water extraction process. Results The optimum extraction technology was soaking for 1 h， with 11 times the amount of water extracted for three times， each time 1.20 h. Conclusion The optimum process is convenient， stable and feasible， which can provide references for follow-up study.

Keywords： Jianpi Qushi Concentrated Pills; water extraction process; salvianolic acid B; total polysaccharide; Box-Behnken response surface method

健脾祛濕丸處方來源于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院皮膚科劉紅霞教授經(jīng)驗(yàn)方，臨床用于脾虛濕盛所致的白疕（尋常型銀屑?。洳C(jī)為內(nèi)濕、外燥，燥濕共存、燥濕互化，這也是銀屑病不斷惡化、難以治愈的原因之一[1]。健脾祛濕丸由丹參、白花蛇舌草、甘草、茯苓等11味藥組成。方中丹參味苦，性微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血通經(jīng)、養(yǎng)血安神、涼血消癰、清心除煩功效[2]。丹酚酸B為丹參中含量最高的水溶性活性成分，近年研究發(fā)現(xiàn)其在擴(kuò)血管、抗血栓形成，改善微循環(huán)調(diào)節(jié)組織的修復(fù)與抑菌方面作用顯著，因此在皮膚病治療中的應(yīng)用日益廣泛[3-5]。中藥多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能及抗腫瘤等藥理作用，且?guī)缀鯖]有毒性，健脾祛濕丸處方中多味藥物含有多糖成分。

多糖作為中藥的主要活性成分之一，參與和介導(dǎo)了細(xì)胞各種生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié)，特別在調(diào)節(jié)免疫功能方面尤為重要[6-7]。因原方以醫(yī)院制劑——散劑的形式在臨床應(yīng)用多年，為提高藥物穩(wěn)定性，減少刺激性，遮蓋中藥散劑不良口感，方便患者服用，擬將此方開發(fā)為濃縮丸。

Box-Behnken響應(yīng)面法是一種多因素非線性試驗(yàn)條件優(yōu)選方法，可評估因素的非線性影響，在處方優(yōu)化中廣泛使用[8]。本試驗(yàn)依據(jù)健脾祛濕丸處方的功能、主治及組方藥物的理化性質(zhì)，運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化健脾祛濕丸的水提工藝，為本課題的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 ?儀器與試藥

Waters 2424高效液相色譜儀，美國Waters;SI-234電子天平（d=0.1 mg），丹佛儀器（北京）有限公司;Direct-QTM5型超純水儀，美國Millipore公司;DLSB-10/20低溫冷卻液循環(huán)泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;Dl-820智能超聲波清洗器，上海之信儀器有限公司;KDM型調(diào)溫電熱套，山東甄城光明儀器有限公司。

丹酚酸B對照品（批號111562-201313，純度97.0%），中國食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈為色譜純（Fisher），磷酸等其他試劑均為分析純，水為超純水。丹參、綿萆薢、薏苡仁、白花蛇舌草、茯苓等飲片均購于亳州市中正中藥材飲片有限公司，經(jīng)檢驗(yàn)均符合2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）各藥項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定。

2 ?方法與結(jié)果

2.1 ?丹酚酸B含量測定

2.1.1 ?色譜條件

色譜柱：XBridge Shield RP18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）;流動相：0.1%磷酸-乙腈（79∶21）;進(jìn)樣量：10 ?L;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;檢測波長：286 nm[2]。色譜圖見圖1。

2.1.2 ?對照品溶液的制備

精密稱取適量丹酚酸B對照品，加甲醇-水（8∶2）混合溶液制成濃度為0.60 mg/mL的丹酚酸B對照品貯備液。

2.1.3 ?供試品溶液的制備

稱取處方中擬水提的藥物飲片91 g，加10倍量水，加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，取上清液30 mL，蒸干，加甲醇-水（8∶2）混合溶液溶解并定容至10 mL容量瓶，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 ?陰性對照溶液的制備

按處方量稱取除丹參外擬水提的藥物飲片，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.1.5 ?線性關(guān)系考察

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下對照品貯備液，加甲醇分別稀釋至0.048、0.096、0.144、0.192、0.240 mg/mL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=13 076 004.17X-12 390.2（r=0.999 8），表明丹酚酸B濃度在0.24～1.2 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.6 ?精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下對照品貯備液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得丹酚酸B峰面積RSD=0.82%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 ?重復(fù)性試驗(yàn)

稱取處方中擬水提的藥物飲片91 g，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算得丹酚酸B峰面積RSD=1.73%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.8 ?穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件下分別于制備后0、6、8、12、24、48 h測定，計(jì)算得丹酚酸B峰面積RSD=1.17%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 ?加樣回收率試驗(yàn)

取丹酚酸B含有量已知的供試品溶液6份，精密加入丹酚酸B對照品適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果平均回收率為97.57%，RSD=1.12%，表明加樣回收率良好。

2.2 ?總多糖含量測定

2.2.1 ?對照品溶液的制備

取D-無水葡萄糖對照品適量，加入超純水使其充分溶解，作為對照品貯備液（濃度為0.096 0 mg/mL）。

2.2.2 ?供試品溶液的制備

稱取處方中擬水提的藥物飲片91 g，按擬定的試驗(yàn)方案提取，備用。

2.2.3 ?苯酚溶液的制備

精密移取5 g苯酚溶液，用溫水溶解制成5%苯酚溶液，置于棕色量瓶中，低溫避光密封保存。

2.2.4 ?最大吸收波長的確定

精密吸取D-無水葡萄糖對照品溶液0.5 mL，供試品溶液0.1 mL，分別置100 mL量瓶中，加入超純水定容稀釋，充分搖勻后吸取稀釋液0.1 mL，置于10 mL試管中，用超純水補(bǔ)至1 mL，各加5%苯酚溶液1 mL及濃硫酸溶液5 mL，混勻，靜置10 min，放入沸水浴加熱20 min后取出，迅速冷卻至室溫，以相同方法制備空白液后進(jìn)行測定，在210～800 nm波長區(qū)域掃描，結(jié)果見圖2?？梢姡?90.8 nm波長處，對照品及供試品溶液均有最大吸收[9]。

2.2.5 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品貯備液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，按上述顯色方法分別測定其吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，D-無水葡萄糖濃度（C）為橫坐標(biāo)，得回歸方程A=0.788C-0.069 4（r=0.999 7），結(jié)果表明D-無水葡萄糖在0.028 8～0.067 2 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 ?精密度試驗(yàn)

精密吸取適量D-無水葡萄糖對照品溶液，按上述方法顯色后連續(xù)測定6次，得到RSD=0.25%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 ?重復(fù)性試驗(yàn)

按擬定的試驗(yàn)方案平行制備供試品溶液6份，在490.8 nm波長處測定按“2.2.4”項(xiàng)下方法顯色后的吸光度，得到RSD=1.05%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.2.8 ?穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密移取0.1 mL按上述方法制備的供試品溶液，分別于制備后0、40、80、120、160、200、240 min按上述方法顯色，測定吸光度，結(jié)果RSD=0.343 9%，表明供試品溶液在4 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.2.9 ?加樣回收率試驗(yàn)

取已知D-無水葡萄糖濃度的供試品溶液，取樣品與對照品含量為l∶1平行制備6份待測溶液，按上述方法顯色并測定其吸光度，結(jié)果平均加樣回收率為100.17%，RSD=0.48%，表明加樣回收率良好。

2.3 ?浸膏得率測定

將50 mL水提液精密吸取至已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后放入105 ℃烘箱內(nèi)干燥3 h，置于干燥器冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算其浸膏得率[10]。浸膏得率（%）=浸膏質(zhì)量×供試品溶液體積÷提取藥物飲片的總質(zhì)量×移取供試品溶液體積×100%。

2.4 ?提取工藝研究

以浸泡時(shí)間、加水倍量和提取時(shí)間為自變量，以丹酚酸B、總多糖含量和浸膏得率的綜合評分為因變量，根據(jù)評價(jià)指標(biāo)對水提工藝的影響擬定權(quán)重，以綜合評分作為提取效果的評判依據(jù)。根據(jù)各指標(biāo)對水提工藝的影響，給予丹酚酸B含量40%的權(quán)重比例，總多糖含量和浸膏得率各給予30%的權(quán)重比例，分別測定各指標(biāo)成分含量并計(jì)算綜合評分。即：丹酚酸B含量評分=丹酚酸B含量÷最大丹酚酸B含量×40，總多糖含量評分=總多糖含量÷最大總多糖含量×30，浸膏得率評分=浸膏得率÷最大浸膏得率×30，綜合評分=丹酚酸B含量評分+總多糖含量評分+浸膏得率評分。

2.4.1 ?單因素試驗(yàn)

分別對提取次數(shù)、浸泡時(shí)間、加水倍量、提取時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果來確定Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平范圍[11]。

2.4.1.1 ?提取次數(shù)考察

稱取處方中擬水提的藥物飲片91 g，將浸泡時(shí)間固定為0.5 h，加水倍量固定為10倍，提取時(shí)間固定為1 h，依次考察提取1、2、3次的結(jié)果，測得綜合評分呈遞增趨勢（見圖3），故最佳提取次數(shù)為3次。

2.4.1.2 ?浸泡時(shí)間考察

稱取處方中擬水提的藥物飲片91 g，將提取次數(shù)固定為1次，加水倍量固定為10倍，提取時(shí)間固定為1.0 h，依次考察浸泡0.5、1.0、1.5、2.0 h的綜合評分，結(jié)果測得浸泡時(shí)間為1.0 h時(shí)綜合評分最高（見圖4）。故選擇最佳浸泡時(shí)間為1.0 h，將浸泡0.5、1.0、1.5 h作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)范圍。

2.4.1.3 ?加水倍量考察

稱取處方中擬水提的藥物飲片91 g，將提取次數(shù)固定為1次，浸泡時(shí)間固定為0.5 h，提取時(shí)間固定為1.0 h，依次考察加水6、8、10、12倍的綜合評分。當(dāng)加水倍量為10倍時(shí)，綜合評分最高（見圖5），故選擇最佳加水倍量為10倍，將8、10、12加水倍量作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)范圍。

2.4.1.4 ?提取時(shí)間考察

稱取處方中擬水提的藥物飲片91 g，將提取次數(shù)固定為1次，浸泡時(shí)間固定為0.5 h，加水倍量為10倍，依次考察提取0.5、1.0、1.5、2 h的綜合評分，當(dāng)提取時(shí)間為1 h時(shí)，綜合評分達(dá)到最高（見圖6），故選擇最佳提取時(shí)間為1.0 h，將提取時(shí)間0.5、1.0、1.5 h為響應(yīng)面設(shè)計(jì)范圍。

2.4.2 ?Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

稱取處方中擬水提的藥物飲片91 g，提取次數(shù)固定為3次，以浸泡時(shí)間、加水倍量和提取時(shí)間為考察指標(biāo)進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素與水平見表1。采用Design-Expert8.0.4軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，結(jié)果見表2，方差分析見表3，響應(yīng)面圖見圖7。

2.4.3 ?模型擬合

采用方差分析對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程Y=90.55-0.56A+5.31B+2.67C+4.22AB+4.10AC+2.27BC-9.13A2-8.34B2-4.16C2。從表3方差分析結(jié)果可以看出：B因素及因素之間的交互影響AB、AC、A2、B2、C2對綜合評分具有顯著影響，其影響程度為B>C>A;失擬項(xiàng)P>0.05，說明失擬不顯著，因此所得回歸方程能較好地分析及預(yù)測該研究的水提工藝。

2.4.4 ?驗(yàn)證試驗(yàn)

通過回歸方程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到最佳提取工藝條件為：稱取處方中擬水提的物飲片91 g，浸泡時(shí)間為1.10 h，加10.88倍量水，提取1.27 h。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)和成本節(jié)約，確定最佳工藝為：稱取處方中擬水提的藥物飲片9 g，浸泡時(shí)間為1.00 h，加11.00倍量水，提取1.20 h。按優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果綜合評分為90.54，與預(yù)測值（92.38）接近，且丹酚酸B轉(zhuǎn)移率為72.46%，總多糖轉(zhuǎn)移率為84.37%，表明該模型預(yù)測性較好，可用于優(yōu)化健脾祛濕丸的水提工藝[12]。

3 ?討論

銀屑病是一種多基因遺傳背景下T細(xì)胞異常的免疫性慢性皮膚病。中藥治療具有不良反應(yīng)少、效果良好等優(yōu)點(diǎn)，故在免疫性疾病的治療中受到越來越多的關(guān)注。中藥多糖對巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞均有明顯調(diào)節(jié)作用[13]。薏苡仁多糖可顯著提高免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)[14];茯苓多糖可在炎性疾病中激活T細(xì)胞向Treg分化，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫失衡[15-16];丹參多糖可顯著抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、干擾素-α及白細(xì)胞介素-1β基因表達(dá)，具有保護(hù)機(jī)體免受細(xì)胞因子過量表達(dá)而受到損傷的作用，顯示出較好的免疫調(diào)節(jié)活性[17];甘草多糖可誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮，避免脂多糖干擾，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[18]。

健脾祛濕丸方中丹參的有效成分包括脂溶性與水溶性兩部分。以丹參酮為代表的醌類化合物為主要的脂溶性成分，丹參酮類化合物具有脂溶性高、半衰期短和生物利用度低等缺點(diǎn)，故臨床應(yīng)用受到限制。酚酸類是主要的水溶性成分，且以丹酚酸B含量最高，在丹參的功效作用中占有重要地位，故以其作為指標(biāo)性成分。本研究參照2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）丹參項(xiàng)下HPLC測定方法，以乙腈- 0.1%磷酸（22∶78）作為流動相對丹酚酸B含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)分離度不符合要求，故將流動相比例調(diào)整為21∶79。

本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化健脾祛濕丸水提工藝，所建立的模型預(yù)測性較好，最佳提取工藝為：浸泡1 h，加11倍量水，回流提取3次，每次1.20 h。

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（收稿日期：2018-09-17）

（修回日期：2018-10-08;編輯：陳靜）