腎衰Ⅱ號方對5/6腎切除大鼠殘余腎組織凋亡相關蛋白表達的影響

王蒙 楊柳易 楊婧 王琛

摘要：目的 ?觀察腎衰Ⅱ號方對5/6（ablation /infarction，A/I）腎切除慢性腎衰竭（CRF）大鼠殘余腎組織凋亡相關蛋白表達的影響。方法 ?SD雄性大鼠采用5/6（A/I）腎切除術制備CRF大鼠模型，隨機分為模型組、腎衰Ⅱ號方組、西藥組，每組15只，另取15只大鼠作為假手術組。各組給予相應干預，60 d后Western blot檢測凋亡相關蛋白p53、Bax、Cleaved-parp的表達，免疫組化檢測p53、Bax蛋白的表達，透射電鏡觀察腎組織超微結構。結果 ?與假手術組比較，模型組大鼠腎皮質和腎髓質p53、Bax、Cleaved-parp蛋白表達明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組大鼠腎皮質和腎髓質p53、Bax、Cleaved-parp蛋白表達明顯降低（P<0.05）。免疫組化結果顯示，p53、Bax蛋白表達主要位于腎小管，模型組大鼠炎性細胞浸潤明顯，蛋白表達較假手術組明顯升高，各給藥組較模型組炎性細胞浸潤減輕，p53和Bax蛋白表達降低。透射電鏡結果顯示，假手術組大鼠腎皮質和腎髓質未見細胞凋亡，超微結構正常，模型組大鼠核固縮，細胞凋亡出現，超微結構紊亂，各給藥組較模型組超微結構改善，少見細胞凋亡發(fā)生。結論 ?腎衰Ⅱ號方可抑制5/6（A/I）腎切除CRF大鼠細胞凋亡，其作用機制可能與下調p53、Bax、Cleaved-parp蛋白表達相關。

關鍵詞：腎衰Ⅱ號方;慢性腎衰竭;腎間質纖維化;腎功能;凋亡;大鼠

中圖分類號：R285.5 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）05-0064-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.014 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Objective To observe the effects of Shenshuai Ⅱ Prescription （SSP） on the apoptosis-related protein expressions in the chronic renal failure （CRF） rats induced by 5/6 （ablation/infarction， A/I） nephrectomy. Methods SD male rats were induced CRF rat model by 5/6 （A/I） nephrectomy and were randomized into model group， SSP group and Western medicine group， with 15 rats in each group. Another 15 rats were recruited as sham-operation group. After 60 days of intervention， the apoptosis-related protein expressions of p53， Bax and Cleaved-parp were tested by Western blot， the protein expressions of p53 and Bax were tested by immunohistochemistry and renal tissue ultrastructure was observed by transmission electron microscope. Results Compared with sham-operation group， the expressions of p53， Bax， and Cleaved-parp in the renal cortex and the medulla increased significantly in model group （P<0.05）. Compared with the model group， the protein expressions of p53， Bax and Cleaved-parp in renal cortex and renal medulla significantly decreased （P<0.05）. The results of immunohistochemistry showed that the protein expressions of p53 and Bax were mainly located in renal tubules. The inflammatory cell infiltration was obvious in the model group， and the protein expressions were significantly higher than those in the sham-operation group. The inflammatory cell infiltration was reduced in the medicine-administered groups compared with the model group， and the protein expressions of p53 and Bax decreased. Transmission electron microscopy showed that there was no apoptosis in the renal cortex and renal medulla of the sham-operation group， the ultrastructure was normal， the model group was pyknosis， apoptosis occurred， and the ultrastructural disorder was disordered. The ultrastructure of each medicine-administered group was improved compared with the model group， and apoptosis was rare. Conclusions SSP can inhibit apoptosis in CRF rats induced by 5/6 （A/I） nephrectomy， which can be associated with down-regulation of protein expressions of p53， Bax， and Cleaved-parp.

Keywords： Shenshuai Ⅱ Prescription; chronic renal failure; renal interstitial fibrosis; renal function; apoptosis; rats

慢性腎臟病（chronic kidney disease， CKD）已經成為繼心腦血管疾病、糖尿病，惡性腫瘤之后又一嚴重威脅人類健康的疾病。在低、中等收入國家，CKD患者的死亡率已達14.3%[1]。腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是各種慢性腎臟病進展至終末期腎衰竭的共同通路和主要病理基礎。隨著對RIF病理機制的深入研究，發(fā)現細胞凋亡在其形成和進展中扮演著重要的促進作用。Xu等[2]發(fā)現，凋亡相關斑點樣蛋白中通過內質網應激途徑激活凋亡，促進RIF。Zhou等[3]報道，TAK1通過調節(jié)p38誘導的細胞凋亡促進了RIF的進展。因此，抑制凋亡可能是延緩RIF進展的有效策略。

腎衰Ⅱ號方是上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院治療慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）的經驗方。研究表明，腎衰Ⅱ號方能通過增加腎血流和改善氧耗，下調血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）和上調神經型一氧化氮合酶（nNOS）蛋白的表達，保護腎功能，延緩RIF的進展[4-5]。本課題前期研究表明，腎衰Ⅱ號方能降低5/6腎切除CRF大鼠血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、血尿酸（UA）水平，升高內生肌酐清除率（CCr）[6]，但腎衰Ⅱ號方是否對凋亡相關蛋白有調控作用尚不清楚。因此，本實驗在前期研究基礎上，觀察腎衰Ⅱ號方對5/6（ablation/infarction，A/I）腎切除大鼠殘余腎組織凋亡相關蛋白p53、Bax、Cleaved-parp的影響，進一步揭示本方延緩RIF機制。

1 ?材料與方法

1.1 ?動物

8周齡健康雄性SD大鼠，SPF級，體質量190～210 g，購于西普爾-必凱（上海）實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（滬）2008-0016。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心，溫度（22±2）℃，12 h光照，相對濕度（55±2）%。飼料為市售固體普通飼料，飲用水為自來水，自由攝食飲水。

1.2 ?藥物

腎衰Ⅱ號方（黨參15 g，淫羊藿15 g，丹參15 g，當歸15 g，制大黃15 g，黃連6 g，紫蘇葉15 g，川芎15 g，桃仁15 g，蟲草菌絲5 g），飲片購于上?？禈蛑兴庯嬈?。全方按臨床常用劑量等比例配制，各藥按一定比例配方后由上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院制劑科制備成濃煎藥液（6.09 g原藥材/mL）;氯沙坦鉀片，杭州默沙東制藥有限公司，批號20170414，蒸餾水制備混懸液（5.5 mg/mL）。

1.3 ?主要試劑及儀器

p53單克隆抗體（批號2524T）、Cleaved-parp單克隆抗體（批號9532S），美國Cell Signaling Technology公司;Bax單克隆抗體，英國Abcam公司，批號ab32503;Gapdh抗體，美國Proteintech公司，批號60004-1-Ig;HRP標記山羊抗兔或抗小鼠IgG（H+L），碧云天生物科技公司，批號A0208、A0216;電泳及轉膜裝置，美國BIO-RAD公司。

1.4 ?造模及分組

隨機選取65只大鼠制備5/6腎切除CRF大鼠模型[7]。適應性喂養(yǎng)1周，2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉，固定于恒溫手術臺上，局部剃毛常規(guī)消毒，于左肋弓下0.5 cm、脊柱向左旁開1 cm處切開一垂直于脊柱長約1.5 cm切口。在無菌條件下經后腹膜選取左腎并暴露腎臟，將腎包膜分離后，把左腎動脈的2/3分支結扎（單個結扎后支及前降支），縫合，1周后摘除右腎。剔除造模失敗和死亡大鼠后，造模成功存活45只，造模成功率為69%。將45只成模大鼠分為9籠，編號1～9，每籠5只，編號1～5。分別測量每只大鼠體質量，利用SPSS19.0軟件建立數據庫，錄入籠號和編號，并以體質量作為變量，通過設定隨機種子、產生隨機數、對隨機數編秩、對隨機數秩次排列、隨機確定等步驟確定1～15為模型組，16～30為腎衰Ⅱ號方組，31～45為陽性藥組，每組15只。另取15只大鼠作為假手術組。

1.5 ?干預

按60 kg成人標準體質量常規(guī)用量的20倍給藥，陽性藥組予氯沙坦鉀混懸液（5.5 mg/mL）灌胃，腎衰Ⅱ號方組予腎衰Ⅱ號方濃煎藥液灌胃，藥物灌胃劑量參照本課題組既往研究用量[5]，給藥體積2 mL。假手術組和模型組給予生理鹽水2 mL灌胃。每日1次，連續(xù)60 d。干預期間自由攝食飲水。

1.6 ?檢測指標

1.6.1 ?樣本采集與處理

2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）大鼠腹腔注射麻醉，打開腹腔，下腔靜脈采血，4 ℃、4000 r/min離心10 min，收集血清。摘取左腎，將左腎橫切為二，一半取5塊1 mm×1 mm×1 mm組織置于電鏡固定液，剩余組織置于10%中性緩沖福爾馬林液，固定24 h，石蠟包埋，切片（厚約3 μm），行免疫組化檢測;一半沿皮髓交界線切開分離皮髓部，分裝后放入液氮，置于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot檢測。

1.6.2 ?Western blot檢測

每組隨機選取6個樣本，每20 mg組織加0.2 mL lysis buffer （RIPA∶PMSF=100∶1），每個2.0 mL EP管中加入1個直徑5 mm鋼珠，置于勻漿機充分裂解， 4 ℃、13 000 r/min離心10 min，將上清液轉至1.5 mL EP管，4 ℃、13 000 r/min離心5 min，BCA法測定蛋白濃度，制備蛋白樣品，100 ℃、5 min煮沸變性，置于-20 ℃冰箱保存。按30 μg/孔蛋白上樣量，8%SDS-聚西烯酰胺凝膠電泳，120 V電泳，濕轉法以100 V、120 min轉膜，與5%脫脂奶粉室溫封閉20 min，p53抗體（1∶1000）、Bax抗體（1∶1000）、Cleaved-parp抗體（1∶1000）、GAPDH抗體（1∶2000）與4 ℃搖床100 r/min過夜，HRP標記山羊抗兔或HRP標記山羊抗小鼠1∶1000室溫100 r/min離心，孵育2 h，0.01%PBS-T清洗10 min/次，3次，ECL發(fā)光，暗室曝光。條帶吸光度值以GAPDH作為內參照。

1.7 ?統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，多樣本均數兩兩比較采用方差分析，多重比較若方差齊則用LSD法，方差不齊者經對數轉換，使方差齊后再用LSD多重比較。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 ?結果

2.1 ?一般狀況

干預60 d后，各組均有15只大鼠存活。假手術組大鼠反應靈敏，皮毛光澤，精力旺盛，一般狀態(tài)良好;模型組大鼠精神萎靡不振，皮毛無光，活動、進食減少，體質量增加緩慢;腎衰Ⅱ號方組、陽性藥組大鼠精神較前明顯改善，食欲旺盛，活動量增多，體質量增加明顯，腎衰Ⅱ號方組整體改善最為明顯。

2.2 ?腎衰Ⅱ號方對模型大鼠殘余腎組織凋亡相關蛋白p53、Bax、Cleaved-parp表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腎皮質和腎髓質p53、Bax、Cleaved-parp蛋白表達明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組大鼠腎皮質和腎髓質p53、Bax、Cleaved-parp蛋白表達明顯降低（P<0.05）。結果見圖1、圖2。

2.3 ?免疫組化染色結果

與假手術組比較，模型組大鼠腎組織p53、Bax高表達，主要位于腎小管，腎間質炎性細胞浸潤明顯;各給藥組較模型組大鼠腎組織炎性細胞浸潤明顯減輕，p53和Bax表達明顯減少。結果見圖3、圖4。

2.4 ?透射電鏡觀察結果

假手術組大鼠腎皮質和腎髓質交界處近端小管上皮細胞線粒體形態(tài)結構和線粒體嵴正常，腎小管、腎小球無明顯病理改變;模型組核固縮，細胞凋亡出現，線粒體數量減少，細胞基質顆粒密度減少;陽性藥組線粒體數量正常，少見細胞凋亡發(fā)生，未見線粒體嵴斷裂紊亂;腎衰Ⅱ號方組線粒體數量正常，少見細胞凋亡發(fā)生，未見線粒體嵴斷裂紊亂。結果見圖5。

3 ?討論

RIF是各種病因導致的慢性、進展性腎臟疾病的最終歸宿，在各種慢性腎臟疾病的轉歸中起著主導作用。對RIF進展機制的研究是當今腎臟病領域研究的熱點之一。研究表明，中藥在抑制細胞凋亡、改善腎臟病理損害及延緩RIF方面有著獨特優(yōu)勢。朱敏杰等[8]報道，葛根素能抑制腎臟缺血再灌注大鼠的細胞凋亡，改善腎功能;吳堅等[9]報道，健脾養(yǎng)正消癥方能通過PI3K/AKT信號通路減少細胞凋亡，抑制順鉑導致的腎毒性。本研究在前期研究的基礎上，以凋亡為切入點，研究5/6（A/I）腎切除CRF大鼠殘余腎組織凋亡相關蛋白p53、Bax和Cleaved-parp的表達及腎衰Ⅱ號方的干預作用。

腎衰Ⅱ號方突出了“扶正降濁”治療CRF的思想，方中以黨參、淫羊藿健脾溫腎，溫而不燥，取“少火生氣”之意，共為君藥;臣以蟲草菌絲補命門之火，當歸、丹參養(yǎng)血活血，化瘀而不傷正，佐制大黃、黃連、紫蘇葉清熱泄?jié)峤舛?桃仁、川芎增強活血化瘀之力。全方寒溫并用，攻補兼施，契合CRF病機。臨床研究表明，腎衰Ⅱ號方能改善CKD患者的炎癥狀態(tài)，降低炎癥因子的表達，改善患者的精神狀態(tài)，保護腎功能[10-11]。

細胞凋亡是基因調控下的細胞程序性死亡過程，涉及一系列基因的激活和蛋白的表達[12]。生理狀態(tài)下，細胞凋亡有利于清除異常細胞，維持組織器官功能的穩(wěn)定，但過度凋亡會減退正常的生理功能，加重疾病進展。研究表明，p53的激活與腎纖維化的發(fā)生和進展密切相關。Wang等[13]報道，在糖尿病腎病模型中，p53的敲除或抑制可改善腎功能，減輕RIF。Rehman等[14]報道，在腎毒性模型中，Diosmin通過下調p53和Bax誘導的細胞凋亡，減輕腎損傷。p53可通過促進凋亡蛋白的活化參與線粒體介導的凋亡途徑，p53能夠與促凋亡蛋白Bax相互作用引起后者轉位到線粒體，激活凋亡信號通路[15]。Cheng等[16]報道了氧化低密度脂蛋白能夠上調p53而激活Bax，引起細胞色素C的釋放和Caspase活化，誘導凋亡。Mei等[17]報道了腎近端小管細胞Bax的敲除能抑制凋亡和減輕RIF。因此，Bax對于凋亡因子的釋放和激活起著重要的作用。PARP是DNA損傷的感受器，也是細胞凋亡時Caspase的切割底物，因此，PARP的活化是細胞凋亡的標志性事件[18]。本研究顯示，與假手術組比較，5/6（A/I）腎切除大鼠腎皮質和腎髓質殘余腎組織凋亡相關蛋白p53、Bax和Cleaved-parp表達升高，炎性細胞浸潤明顯，透射電鏡結果表明，模型組細胞凋亡發(fā)生，線粒體數量減少，超微結構紊亂，說明在CRF大鼠模型中，凋亡被激活。腎衰Ⅱ號方能顯著下調CRF大鼠殘余腎組織p53、Bax和Cleaved-parp蛋白的表達，減少炎性細胞浸潤，超微結構改善明顯，說明腎衰Ⅱ號方可能通過抑制凋亡相關蛋白p53、Bax和Cleaved-parp的表達，起到了保護腎功能、延緩RIF進展的作用。

根據Brenner的理論，腎臟疾病主要起源于腎小球血流動力學的改變，但相關實驗研究表明，小管間質的損害與腎功能的進展關系更加密切[19-21]。因此，腎小管間質功能的損傷可能是CRF進展的共同通路。本研究運用免疫組化檢測分析p53和Bax蛋白的表達位置，結果顯示p53和Bax蛋白的表達主要位于腎小管，由此認為腎衰Ⅱ號方可能通過改善腎內缺氧下調了p53、Bax的表達，但其具體機制需要進一步研究。

參考文獻：

[1] ENE-IORDACHE B， PERICO N， BIKBOV B， et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk in six regions of the world （ISN-KDDC）：a cross-sectional study[J]. Lancet Glob Health，2016，4：e307-e319.

[2] XU Y， LIU Y Q， GUO H L， et al. Apoptosis-associated speck-like protein containing a cARD deletion ameliorates unilateral ureteral obstruction induced renal fibrosis and endoplasmic reticulum stress in mice[J]. Mediators Inflamm，2018，2018：6909035.

[3] ZHOU J， ZHONG J Y， HUANG Z X， et al. TAK1 mediates apoptosis via p38 involve in ischemia-induced renal fibrosis[J]. Artif Cells Nanomed Biotechnol，2018，2018：1-10.

[4] 楊婧，王琛，邵命海，等.腎衰Ⅱ號方對5/6腎切除大鼠腎血流量和腎內氧耗影響及其作用機制[J].中國中西醫(yī)結合腎病雜志，2011，12（7）：578-581.

[5] 秦軍燕，王琛，邵命海，等.腎衰Ⅱ號方對慢性腎功能衰竭大鼠腎組織AngⅡ及nNOS蛋白表達的影響[J].中國中西醫(yī)結合雜志，2012，32（9）：1280-1284.

[6] 程勤麗，徐亞赟，楊靖，等.益氣養(yǎng)血祛瘀泄?jié)岱▽?/6（A/I）慢性腎衰竭模型大鼠蛋白尿及殘余腎功能的保護作用[J].中國中西醫(yī)結合腎病雜志，2017，18（7）：570-573.

[7] DENG A H， TANG T， SINGH P， et al. Regulation of oxygen ?utilization by angiotensin Ⅱ in chronic kidney disease[J]. Kidney Int，2009，75：197-204.

[8] 朱敏杰，郝海英，陳潔，等.葛根素對腎缺血再灌注大鼠腎臟組織細胞凋亡的影響及其機制探討[J].中國實驗方劑學雜志，2016，22（23）：127- 132.

[9] 吳堅，鄒璽，劉沈林，等.健脾養(yǎng)正消癥方通過激活PI3K/AKT 信號通路減輕順鉑所致的腎毒性作用[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21（17）：106-110.

[10] 楊婧，嚴?？。蹊?腎衰Ⅱ號方對慢性腎臟病患者腎功能及炎癥因子的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（12）：15-18.

[11] 周圓，王琛，何立群，等.腎衰Ⅱ號方治療CKD3-4 期患者的臨床療效觀察[J].上海中醫(yī)藥大學學報，2011，25（4）：37-40.

[12] YOGOSAWA S， YOSHIDA K. Tumor suppressive role for kinases phosphorylating p53 in DNA damage-induced apoptosis[J]. Cancer Sci，2018，109：3376-3382.

[13] WANG J， PANG J， LI H L， et al. lncRNA ZEB1-AS1 as suppressed by p53 for renal fibrosis in diabetic nephropathy[J]. Mol Ther Nucleic Acids，2018，12：741-750.

[14] REHMAN M U， TAHIR M， QUAIYOOM K A， et al. Diosmin protects against trichloroethylene-induced renal injury in Wistar rats：plausible role of p53， Bax and caspases[J]. Br J Nutr，2013，110：699-710.

[15] CHIPUK J E， KUWANA T， BOUCHIEⅡR-HAYES L， et al. Direct activation of Bax by p53 mediates mitochondrial membrane permeabilization and apoptosis[J]. Science，2004，303：1010-1014.

[16] CHENG J Z， CUI R， CHEN C H， et al. Oxidized low-density lipoprotein stimulates p53-dependent activation of proapoptotic Bax leading to apoptosis of differentiated endothelial progenitor cells[J]. Endocrinology，2007，148：2085-2094.

[17] MEI S Q， LIN L， WEI Q， et al. Double knockout of Bax and Bak from kidney proximal tubules reduces unilateral urethral obstruction associated apoptosis and renal interstitial fibrosis[J]. Sci Rep，2017，7：44892-44898.

[18] LIU X X， DENG Y F， XU Y F， et al. MicroRNA-223 protects neonatal rat cardiomyocytes and H9c2 cells from hypoxia-induced apoptosis and excessive autophagy via the Akt/mTOR pathway by targeting PARP-1[J]. J Mol Cell Cardiol，2018，118：133-146.

[19] BRENNER B M， MEYER T W， HOSTETTER T H. Dietary protein intake and the progressive nature of kidney disease：The role of hemodynamically mediated glomerular injury in the pathogenesis of progressive glomerular sclerosis in aging， renal ablation， and intrinsic renal disease[J]. N Engl J Med，1982，307：652–659.

[20] EDDY A A. Experimental insights into the tubulointerstitial disease accompanying primary glomerular lesions[J]. J Am Soc Nephrol，1994，5：1273-1287.

[21] NATH K A. Tubulointerstitial changes as a major determinant in the progression of renal damage[J]. Am J Kidney Dis，1992，20：1-17.

（收稿日期：2019-01-01）

（修回日期：2019-01-12;編輯：華強）