免疫細(xì)胞及腫瘤標(biāo)志物與高危型HPV感染宮頸癌患者HPV水平的相關(guān)性及與預(yù)后的關(guān)系

武麗蕊，王蘭朋，李紅霞，孫巖

河北中石油中心醫(yī)院1婦科，3實驗室，河北廊坊065000

2廊坊市人民醫(yī)院胸外科，河北廊坊0650000

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率不斷升高且呈年輕化趨勢[1]。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）是一種DNA病毒，其傳播方式主要是性接觸。通常低危型HPV可能引起生殖器尖銳濕疣，而高危型HPV可能引起宮頸癌[2]。宮頸癌的發(fā)生不僅與患者伴有HPV感染有關(guān)，而且與患者的機體狀態(tài)有關(guān)，如患者的免疫力、體內(nèi)微環(huán)境等。CD4+、CD8+細(xì)胞與機體T細(xì)胞的表達(dá)有關(guān)，CD56+細(xì)胞與機體自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞的表達(dá)有關(guān)，這兩類細(xì)胞都是免疫細(xì)胞，當(dāng)其水平降低時，機體免疫功能下降，不能清除體內(nèi)的HPV，長期的HPV感染會引起宮頸癌。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg），對機體的免疫功能具有一定的抑制作用，研究報道，這種抑制作用會使基因突變的細(xì)胞逃逸免疫監(jiān)控，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[3-5]。K-ras、Ki-67的陽性表達(dá)與細(xì)胞的增殖、遷移及血管形成有關(guān)[6-7]。HPV感染時間延長，會引起宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN），這一階段的病變是可以逆轉(zhuǎn)的，若感染持續(xù)存在，則最后可能發(fā)展為宮頸癌，這個過程需要約10年的時間。因此，在宮頸病變早期對容易引起患者免疫力下降的指標(biāo)及與細(xì)胞增殖有關(guān)的標(biāo)志物K-ras、Ki-67進行檢測可能有助于宮頸癌的早期預(yù)防和診斷。本研究對不同宮頸疾病患者進行免疫細(xì)胞和腫瘤標(biāo)志物檢測，發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞和腫瘤標(biāo)志物對宮頸癌患者的早期預(yù)防及診斷具有一定的臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年2月至2017年10月于河北中石油中心醫(yī)院診治的有HPV感染的72例宮頸癌患者、83例CIN患者和50例慢性宮頸炎患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)臨床表現(xiàn)和/或活組織檢查等病理檢查結(jié)果，確定組織性質(zhì)及臨床分期、分級[8-9]；②根據(jù)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測結(jié)果確定均伴有高危型HPV感染。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有免疫系統(tǒng)疾病；②妊娠、哺乳期婦女；③溝通障礙；④近3個月內(nèi)有免疫治療、放化療或其他藥物治療史。納入的72例宮頸癌患者（宮頸癌組），年齡為26～64歲，平均年齡為（42.6±5.7）歲；臨床分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期28例，Ⅲ期20例，Ⅳ期12例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例。納入的83例CIN患者（CIN組），年齡為25～66歲，平均年齡為（41.5±4.9）歲；CINⅠ級23例，CINⅡ級27例，CINⅢ級33例。納入的50例慢性宮頸炎患者（慢性宮頸炎組），年齡為23～64歲，平均年齡為（40.8±5.2）歲。3組患者的平均年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且所有患者對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器

藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記的小鼠抗人CD4、CD8、CD56抗體，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的Treg、K-ras、Ki-67抗體均購自美國BD Bioscience公司；臺盼藍(lán)染色液、紅細(xì)胞裂解液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）均購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司。其中，CD4+、CD8+用于標(biāo)記免疫細(xì)胞中的T細(xì)胞，CD56+用于標(biāo)記免疫細(xì)胞中的NK細(xì)胞。K-ras、Ki-67可代表細(xì)胞的增殖、擴散等能力。采用美國BD Biosciences Accuri C6流式細(xì)胞檢測儀進行流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測，HPVDNA分型檢測儀器購自深圳市科潤達(dá)生物工程有限公司。

1.3 觀察指標(biāo)和檢測方法

所有患者均于入院后第1天抽取空腹靜脈血3 ml。使用FCM檢測患者外周血中CD4+、CD8+、CD56+、Treg的水平，使用免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry，IHC）檢測患者病變組織中腫瘤標(biāo)志物（K-ras、Ki-67）的表達(dá)情況；對比分析3組患者 CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD56+、Treg的水平及K-ras、Ki-67的陽性表達(dá)情況。FCM檢測步驟：取各組患者外周血后，加入抗凝劑保存于4℃冰箱內(nèi)，于1 h內(nèi)進行檢測；將淋巴細(xì)胞濃度調(diào)整為約5×106/L，使用臺盼藍(lán)染色，確定活細(xì)胞率>85%，保證測試的準(zhǔn)確性；將100 μl全血加入測定管中，加入 PBS 稀釋至 200 μl，加入 20 μl FCM 專用抗體并混勻；在4℃冰箱內(nèi)避光孵育30 min；加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，直至液體澄清；使用PBS清洗3次后，加入0.1%的甲醛溶液將細(xì)胞固定，在2 h內(nèi)上機檢測。IHC檢測步驟：分別取3組患者的病變組織，4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋，組織切片；脫蠟水化后，抗原修復(fù)；封閉內(nèi)源性過氧化酶后，充分清洗；4℃孵育一抗過夜；室溫放置1 h后，清洗掉一抗，孵育二抗；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色后，復(fù)染；鏡下觀察。K-ras和Ki-67的陽性表達(dá)率計算方法：選取視野中1000個細(xì)胞，觀察陽性細(xì)胞比例，0～5%為（-），6%～25%代表（+），26%～75%代表（++），76%～100%代表（+++）。

1.4 隨訪

所有患者均隨訪1年，隨訪方式為電話隨訪結(jié)合上門隨訪。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者外周血免疫細(xì)胞水平的比較

宮頸癌組患者的CD4+、CD56+、CD4+/CD8+水平均低于CIN組患者和慢性宮頸炎組患者，但CD8+、Treg水平均高于CIN組患者和慢性宮頸炎組患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；CIN組患者的CD4+/CD8+水平低于慢性宮頸炎組患者，Treg水平高于慢性宮頸炎組患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 3組患者外周血免疫細(xì)胞水平的比較（±s）

表1 3組患者外周血免疫細(xì)胞水平的比較（±s）

注：a與慢性宮頸炎組比較，P<0.05；b與CIN組比較，P<0.05

指標(biāo)CD4+（%）CD8+（%）CD4+/CD8+CD56+（%）Treg（%）慢性宮頸炎組（n=50）36.54±7.23 23.64±5.13 1.55±0.47 16.32±5.17 4.37±1.21 CIN組（n=83）34.68±6.54 24.92±5.46 1.39±0.43a 15.51±4.79 5.32±1.43a宮頸癌組（n=72）26.62±5.46a b 30.46±6.37a b 0.87±0.36a b 11.36±3.87a b 6.14±1.62a b

2.2 3組患者腫瘤標(biāo)志物陽性表達(dá)情況的比較

慢性宮頸炎組、CIN組、宮頸癌組患者的K-ras的陽性率分別為 80.0%（40/50）、77.1%（64/83）、100%（72/72），Ki-67的陽性率分別為12.0%（6/50）、83.1%（69/83）、100%（72/72）；3組患者的K-ras、Ki-67的陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=18.501、121.608，P＜0.05），其中宮頸癌組患者的K-ras、Ki-67陽性率最高。（表2）

2.3 宮頸癌組患者HPV水平與免疫細(xì)胞水平及腫瘤標(biāo)志物陽性表達(dá)情況的相關(guān)性分析

宮頸癌組患者外周血中Treg、CD8+水平和K-ras、Ki-67陽性表達(dá)情況與HPV-DNA水平呈正相關(guān)（r=0.546、0.402、0.645、0.713，P＜0.05），而CD4+、CD56+水平與HPV-DNA水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.478、-0.463，P＜0.05）。

表2 3組患者的腫瘤標(biāo)志物陽性表達(dá)情況[ n（%）]*

2.4 宮頸癌組有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的免疫細(xì)胞水平及腫瘤標(biāo)志物陽性表達(dá)情況的比較

宮頸癌組有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的CD4+、CD56+、CD4+/CD8+水平均明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.767、3.389、5.538，P＜0.01）；但CD8+、Treg水平均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.864、9.607，P＜0.01）（表3）。宮頸癌組有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者K-ras（+++）、Ki-67（+++）的比例分別為46.4%（13/28）、50.0%（14/28），均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的18.2%（8/44）、25.0%（11/44），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.608、4.718，P＜0.05）。

表3 宮頸癌組有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的免疫細(xì)胞水平（±s）

表3 宮頸癌組有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的免疫細(xì)胞水平（±s）

指標(biāo)CD4+（%）CD8+（%）CD4+/CD8+CD56+（%）Treg（%）有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（n=28）21.06±5.47 39.02±5.97 0.62±0.28 10.03±3.08 8.04±1.48無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（n=44）30.12±5.58 24.93±5.87 1.02±0.31 12.21±2.36 4.92±1.25

2.5 宮頸癌組死亡患者與生存患者免疫細(xì)胞水平及腫瘤標(biāo)志物陽性表達(dá)情況的比較

隨訪1年，72例宮頸癌患者中，23例患者死亡，49例患者生存。宮頸癌組死亡患者的CD4+、CD56+、CD4+/CD8+水平均明顯低于生存患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.824、8.342、5.704，P＜0.01）；但CD8+、Treg水平均明顯高于生存患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.023、8.229，P＜0.01）（表4）。宮頸癌組死亡患者的 K-ras（+++）、Ki-67（+++）的比例分別為52.2%（12/23）、65.2%（15/23），明顯高于生存患者的18.4%（9/49）、20.4%（10/49），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.659、13.866，P＜0.01）。

表4 宮頸癌組死亡患者和生存患者免疫細(xì)胞水平（±s）

表4 宮頸癌組死亡患者和生存患者免疫細(xì)胞水平（±s）

指標(biāo)CD4+（%）CD8+（%）CD4+/CD8+CD56+（%）Treg（%）死亡患者（n=23）18.15±5.27 34.15±5.26 0.57±0.27 7.66±2.73 7.95±1.36生存患者（n=49）30.61±6.72 28.76±5.32 1.01±0.32 13.06±2.48 5.29±1.24

3 討論

免疫系統(tǒng)在腫瘤的發(fā)生過程中具有重要的作用，其中，輔助性T淋巴細(xì)胞如CD4+細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子可以提高患者的免疫力，從而殺傷腫瘤細(xì)胞，而抑制性T細(xì)胞如CD8+細(xì)胞等在免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞的過程中起負(fù)調(diào)控的作用，這兩類T細(xì)胞相互協(xié)調(diào)、相互制約，共同調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答[10-11]。CD56+細(xì)胞主要存在于血液、脾臟及骨髓等部位，是NK細(xì)胞的標(biāo)志物，在沒有抗體和致敏淋巴細(xì)胞的作用下，其可以迅速由腫瘤細(xì)胞激活，并對腫瘤細(xì)胞進行抑制和殺傷。Treg細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生過程中對免疫系統(tǒng)起抑制作用，有助于血液系統(tǒng)中的腫瘤細(xì)胞逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)控而不被殺死，導(dǎo)致人體腫瘤細(xì)胞的積聚[3,11]。K-ras屬于RAS家族成員之一，能夠編碼K-ras蛋白，在正常人體環(huán)境中，其能夠調(diào)控細(xì)胞的生長，而在異常人體環(huán)境中，其能夠促進細(xì)胞持續(xù)生長，甚至發(fā)生基因突變，導(dǎo)致該基因永久活化，進一步引起細(xì)胞內(nèi)信號不能正常轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞持續(xù)增殖，發(fā)生癌變。Ki-67是細(xì)胞增殖的一種標(biāo)志物，除細(xì)胞靜止期外，其在細(xì)胞分裂的各個時期均有表達(dá)，其陽性表達(dá)率越高，提示腫瘤細(xì)胞增殖越活躍，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移等有關(guān)[12]。文獻(xiàn)報道，宮頸癌的發(fā)生不僅與患者自身感染高危型HPV有關(guān)，而且與患者的免疫功能有關(guān)[13-14]，同時檢測腫瘤標(biāo)志物的變化有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組患者的CD4+、CD56+、CD4+/CD8+水平均低于CIN組患者和慢性宮頸炎組患者（P＜0.05），說明宮頸癌患者的免疫功能下降，很可能是由于其免疫功能長期處于較低水平，HPV長期感染，導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生；宮頸癌組患者的CD8+、Treg水平均高于CIN組患者和慢性宮頸炎組患者（P＜0.05），說明宮頸癌患者的免疫功能被抑制，很可能是因為腫瘤細(xì)胞逃逸，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞累積，疾病逐漸惡化。3組患者的K-ras、Ki-67的陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中宮頸癌組患者的K-ras、Ki-67陽性率最高，說明宮頸癌細(xì)胞增殖活躍能力及細(xì)胞遷移能力強于其他兩組。隨著疾病進展，患者體內(nèi)相應(yīng)的抑制性T細(xì)胞水平與K-ras、Ki-67陽性表達(dá)情況均有升高趨勢；而輔助性T細(xì)胞水平卻降低。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組患者外周血中Treg、CD8+水平和K-ras、Ki-67陽性表達(dá)情況與HPV-DNA水平呈正相關(guān)；CD4+、CD56+水平與HPV-DNA水平呈負(fù)相關(guān)。同時，宮頸癌組有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的CD4+、CD56+、CD4+/CD8+水平均明顯低于無轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.01），CD8+、Treg水平和 K-ras（+++）、Ki-67（+++）的比例均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05）；宮頸癌組死亡患者的上述輔助性T淋巴細(xì)胞水平均明顯低于生存患者（P＜0.01），上述抑制性T細(xì)胞水平和腫瘤標(biāo)志物陽性比例均高于生存患者（P＜0.01），進一步證明了隨著疾病的進展，患者的免疫力下降，促進了腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，除免疫功能指標(biāo)外，K-ras和Ki-67亦可作為腫瘤檢測的輔助指標(biāo)。聯(lián)合檢測患者免疫細(xì)胞與腫瘤標(biāo)志物，不僅對宮頸癌的早期診斷具有重要的意義，而且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制中亦具有一定的意義，為宮頸癌的早期預(yù)防、診斷及治療提供了一定的參考。由于時間和技術(shù)的限制，本研究在腫瘤的發(fā)病機制方面等未進行深入研究，有待于進一步完善。

綜上所述，免疫力降低和免疫逃逸在高危型HPV感染患者演變?yōu)閷m頸癌的過程中發(fā)揮了重要的作用，檢測免疫細(xì)胞和腫瘤標(biāo)志物，有助于高危型HPV感染宮頸癌患者的早期預(yù)防、診斷及預(yù)后評估。