熱處理過(guò)程中大豆11S球蛋白解離締合行為研究進(jìn)展

曾劍華，楊 楊，劉琳琳，石彥國(guó)*，張 娜，朱秀清*

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省普通高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省谷物食品與綜合加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076）

隨著現(xiàn)代食品加工技術(shù)的發(fā)展，大豆蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，如大豆蛋白因具有良好的凝膠性、持水性和與肉的結(jié)合能力，可將其添加到魚(yú)制品或者肉制品中以改善其物理特性，或添加到面包等烘焙食品改善其質(zhì)構(gòu)、提高持水性；然而因其加工過(guò)度造成分散性差或存在豆腥味等性能缺陷，大豆蛋白在飲料等行業(yè)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用存在一定的局限性[1-5]。

無(wú)論是現(xiàn)代還是傳統(tǒng)食品加工，熱處理都是大豆食品加工過(guò)程中必不可少的操作單元，能達(dá)到殺菌、鈍化抗?fàn)I養(yǎng)因子、誘導(dǎo)大豆蛋白變性提高消化率、軟化大豆組織及獲得理想的功能品質(zhì)等目的[6]。熱處理使大豆蛋白發(fā)生變性從而展現(xiàn)不同的性質(zhì)，如凝膠性、起泡性、乳化性等，其加工程度直接影響大豆蛋白的功能特性[7-8]，進(jìn)而影響大豆食品的相關(guān)品質(zhì)。在大豆蛋白變性過(guò)程中發(fā)生的主要反應(yīng)就是蛋白亞基之間的解離締合反應(yīng)[9]；而大豆11S球蛋白（簡(jiǎn)稱11S）是大豆蛋白的重要組成成分，占其總質(zhì)量的40%～60%[10]，其在熱處理過(guò)程中的解離締合行為對(duì)大豆蛋白反應(yīng)體系有著極其重要的影響。而大豆蛋白成分復(fù)雜，除了11S球蛋白外，還含有大豆7S球蛋白（簡(jiǎn)稱7S）及乳清蛋白等。近年研究顯示大豆蛋白在生產(chǎn)加工過(guò)程中還會(huì)形成脂蛋白（lipophilic protein，LP）[11]；大豆蛋白復(fù)雜的成分對(duì)蛋白熱處理過(guò)程中的解離締合反應(yīng)造成很大影響；因此研究不同組分及外界因素對(duì)11S球蛋白在熱處理過(guò)程中的解離締合反應(yīng)對(duì)探索大豆蛋白熱處理過(guò)程中的解離締合作用有著極其重要的意義，對(duì)指導(dǎo)大豆食品研究開(kāi)發(fā)具有重要的理論價(jià)值。

本文基于11S球蛋白熱改性過(guò)程中蛋白質(zhì)量濃度差異引起的體系性狀變化，從離子強(qiáng)度、pH值、大豆7S球蛋白以及LP等方面對(duì)11S球蛋白的解離締合行為的影響進(jìn)行歸納綜述，并分析了相應(yīng)條件下11S球蛋白溶膠和凝膠解離締合反應(yīng)模型，以期從11S球蛋白的熱解離締合行為中探究大豆蛋白體系的熱解離締合反應(yīng)規(guī)律，為大豆食品的研究開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 大豆11S球蛋白的組成和化學(xué)結(jié)構(gòu)

大豆干基中蛋白質(zhì)量約占40%，經(jīng)過(guò)低溫脫脂、堿提酸沉得到大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）[12]，其主要成分為大豆球蛋白（11S球蛋白）和伴大豆球蛋白（7S球蛋白），約占SPI質(zhì)量的60～70%；據(jù)報(bào)道11S/7S值為0.5～2.4，該比值因品種差異存在較大差異[13]，經(jīng)差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）分析SPI后，得到7S和11S熱吸峰分別為72 ℃和90 ℃[6]。

11S球蛋白是六聚體，分子質(zhì)量在300～380 kDa之間，由6 個(gè)分子質(zhì)量約35 kDa的酸性肽鏈（acidic polypeptides，A）和6 個(gè)分子質(zhì)量約20 kDa的堿性肽鏈（basic polypeptides，B）通過(guò)二硫鍵鏈接組成。Utsumi等[14]根據(jù)11S酸性肽鏈和堿性肽鏈的N-端氨基酸序列將11S球蛋白分為5 個(gè)基因序列：A1aB1b（也有表示A1aB2，G1）、A2B1a（G2）、A1bB2（也有表示A1bB1b，G3）、A5A4B3（G4）和A3B4（G5），根據(jù)它們的同源性分為兩組：I組（G1、G2和G3）和II組（G4和G5），各組的序列同源性約為80%，組間約為50%，I組富含蛋氨酸且分子質(zhì)量小于II組。

11S的基因表達(dá)顯示其組成亞基為單一多肽前體，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中共轉(zhuǎn)錄形成蛋白質(zhì)前體并除去信號(hào)序列，得到的前原蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中組裝成三聚體，前原蛋白三聚體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋白質(zhì)儲(chǔ)存液泡，然后在天冬酰胺和甘氨酸殘基之間發(fā)生特定的翻譯，并被切割形成酸性和堿性多肽，形成的多肽通過(guò)二硫鍵連接，成熟后組裝成11S六聚體[15]。

Adachi等[16]使用X射線晶體學(xué)測(cè)定11S亞基前體A1aB1b的分子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)前蛋白A1aB1b是由3 個(gè)前體粒子（9.5 nm×9.5 nm×4.0 nm）圍繞三重對(duì)稱軸形成的三聚體，且前體蛋白核心由兩個(gè)果凍卷β鏈和兩個(gè)延伸螺旋結(jié)構(gòu)域組成（圖1）。隨后Adachi[16]、Tandang-Silvas[17]等研究了11S球蛋白A3B4和A1aB1b的三維結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步揭示了11S三聚體如何組裝成六聚體[16-17]。

Adachi等[16]從A1aB1b晶體結(jié)構(gòu)中觀察到11S球蛋白鏈間和鏈內(nèi)存在二硫鍵，根據(jù)鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵的位置，三聚體中垂直于三重軸的兩個(gè)面稱為鏈間二硫化物（interchain disulfide-containing，IE）面和鏈內(nèi)二硫化物（intrachain disulfide-containing，IA）面；而IE面比IA面具有更多的疏水性氨基酸殘基，這表明六聚體是由IE面之間的相互作用形成的。在2.1 ?分辨率下測(cè)定11S球蛋白的A3B4同源六聚體晶體結(jié)構(gòu)（圖1），發(fā)現(xiàn)11S是由3 個(gè)前體（由A1～A3和B1～B3兩兩組成）組成的兩個(gè)三聚體通過(guò)三重軸在IE面上堆積成六聚體，且具有32 點(diǎn)群（圖1a）；A3B4三聚體在IE面上具有74 個(gè)氨基酸殘基（氨基酸殘基252～325），這些氨基酸構(gòu)成移動(dòng)障礙區(qū)，同時(shí)IE面上存在可變的移動(dòng)區(qū)并能抑制六聚體的形成，通過(guò)酶在Asn320和Gly321殘基之間進(jìn)行特定切割發(fā)生裂解后，無(wú)序區(qū)從IE面移動(dòng)到表面，該過(guò)程將使IE面充分暴露于溶劑，同時(shí)去除空間位阻，使得兩個(gè)三聚體組裝形成六聚體，并最終儲(chǔ)存在蛋白液泡中（圖1b）[15,18]。也有研究認(rèn)為AB亞基通過(guò)靜電作用和氫鍵形成兩個(gè)六圓環(huán)構(gòu)成中空?qǐng)A柱體[9]。

圖1 大豆球蛋白AB同源六聚體球蛋白分子結(jié)構(gòu)[16-17]34Fig. 1 Stereoviews of the ribbon diagram of glycinin A3B4 homohexamer[16-17]

2 熱處理過(guò)程中11S球蛋白解離締合行為

大豆蛋白的熱變性是其加工應(yīng)用的重要性質(zhì)，熱處理過(guò)程中含有游離巰基與二硫鍵的11S亞基發(fā)生共價(jià)鍵轉(zhuǎn)換，同時(shí)伴隨非共價(jià)鍵相互作用，如靜電作用、疏水相互作用等導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)重排、聚集變性等[19]，從而生產(chǎn)不同品質(zhì)特性的大豆產(chǎn)品。蛋白濃度對(duì)大豆蛋白的許多性質(zhì)及其在食品的應(yīng)用有著重要的影響，在處理過(guò)程中，不同濃度下的11S球蛋白具有不同的體系性狀，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于5%時(shí)形成大豆蛋白溶膠體系，高于5%時(shí)形成大豆蛋白凝膠體系，其解離締合行為也有所不同[20]。

2.1 11S球蛋白溶膠體系解離締合行為

2.1.1 離子強(qiáng)度的影響

離子強(qiáng)度對(duì)11S溶液熱解離締合行為有很大的影響，在離子強(qiáng)度為0.5的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中且溫度低于70 ℃時(shí)，11S顯示出良好的穩(wěn)定性；當(dāng)溫度超過(guò)70 ℃時(shí)，體系開(kāi)始變渾濁，且在90 ℃時(shí)出現(xiàn)沉淀；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）結(jié)果顯示，在70～90 ℃時(shí)，11S亞基解離占主導(dǎo)，溫度進(jìn)一步升高引起11S球蛋白形成寡聚體（2S）、二聚體和多聚體（15S）[21]。在低離子強(qiáng)度條件下，11S解離溫度為70 ℃，80 ℃時(shí)基本解離完全；高離子強(qiáng)度條件下，11S解離溫度為90 ℃，到100 ℃解離完成。如在pH 7.6、離子強(qiáng)度為0.1和0.5的條件下，11S的DSC結(jié)果顯示熱變性溫度分別為78.1 ℃和89.6 ℃[21]；Lakemond等[22]利用DSC研究在pH 7.6、離子強(qiáng)度分別為0.03和0.5的條件下，11S熱變性溫度分別為78 ℃和94 ℃。離子強(qiáng)度從0增加至4時(shí)，11S球蛋白變性溫提高了20 ℃，熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，表明11S的熱變性對(duì)離子強(qiáng)度很敏感；而在pH 7.0、離子強(qiáng)度分別為0.05與0.5條件下的變性溫分別為55 ℃和70 ℃[23]，與Lakemond等[22]的結(jié)果存在較大差異，可能是因?yàn)閜H值條件不同。在70 ℃時(shí)，11S球蛋白解離為2S，隨后解離為A亞基和B亞基，經(jīng)微堿化處理（0.03 mol/L Tris-HCl、pH 8.6）或者在低離子強(qiáng)度下，11S球蛋白能很快解離成7S和2S組分[23-24]。

在pH 7.6和離子強(qiáng)度為0.5時(shí)，大豆球蛋白主要以六聚體形式存在，沉降系數(shù)為11S；當(dāng)離子強(qiáng)度下降至0.01時(shí)，大豆球蛋白主要以三聚體形式存在；熱處理能使11S轉(zhuǎn)變成可溶性15S組分與4S組分，繼續(xù)加熱，15S組分粒徑變大并且開(kāi)始沉淀，添加0.01～0.50 mol/L的巰基乙醇能加速11S球蛋白產(chǎn)生沉淀。而添加0.01 mol/L N-乙基馬來(lái)酰亞胺不僅能抑制11S產(chǎn)生沉淀，同時(shí)還形成了7S和3S聚集體；繼續(xù)加熱后，7S組分暴露出的游離巰基通過(guò)疏水相互作用或轉(zhuǎn)化為巰基二硫鍵與B亞基作用生成沉淀，這個(gè)過(guò)程非?？欤蚨跓崽幚磉^(guò)程中沒(méi)有檢測(cè)到B亞基[25]。Yamagishi等[26]在離子強(qiáng)度為0.5的0.002 6 mol/L PBS（pH 7.6、含0.4 mol/L NaCl）中熱處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的11S溶液1～60 min，上清液堿性亞基與酸性亞基比值（B/A值）逐漸下降，沉淀中B/A值逐漸增大；通過(guò)SDSPAGE可知，沉淀中含有的11S球蛋白亞基之間通過(guò)二硫鍵締合形成高分子質(zhì)量的組分，而上清液中含有的11S球蛋白亞基之間解離形成亞基單體、二聚體；超速沉降分析結(jié)果顯示亞基單體組分為4S（A亞基），即上清液所有組分幾乎只含A亞基，沉淀中主要為B亞基、A與B亞基的寡聚體和多聚體；由SDS-PAGE結(jié)果可知，寡聚體和多聚體里面含有的B亞基遠(yuǎn)多于A亞基，可能是在熱處理過(guò)程中11S解離成A和B亞基時(shí)，由于溶液體系pH值（7.6）接近B亞基等電點(diǎn)，同時(shí)B亞基之間的距離比較近，更有利于巰基與二硫鍵發(fā)生轉(zhuǎn)化，進(jìn)而導(dǎo)致B亞基彼此締合形成沉淀。因此大豆球蛋白溶液熱解離締合反應(yīng)歸納見(jiàn)圖2。

圖2 不同離子強(qiáng)度下大豆11S球蛋白的熱解離締合行為Fig. 2 Dissociation and association of glycinin in different ionic strengths

離子強(qiáng)度對(duì)大豆11S球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)有重要的影響，Koshiyama等[21]通過(guò)傅里葉變換紅外光譜與圓二色光譜（circular dichroism，CD）研究發(fā)現(xiàn)，在同一pH值條件下，11S無(wú)規(guī)卷曲含量隨離子強(qiáng)度下降而增大，α-螺旋含量則隨著離子強(qiáng)度的增大而增大，而β-折疊含量與離子強(qiáng)度無(wú)顯著關(guān)系。在熱處理過(guò)程中，11S疏水性隨著離子強(qiáng)度的增大而增大，表明11S通過(guò)疏水鍵合作用形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[27-28]。

2.1.2 pH值的影響

熱處理過(guò)程中pH值變化對(duì)11S球蛋白溶液的解離締合行為也有顯著影響。Kim等[27]研究發(fā)現(xiàn)11S溶液體系pH值從4.5降至3，或升至11.5，其變性溫度（Tm）和焓值（ΔH）均減小直至消失；當(dāng)pH值從4.5升到9時(shí)，Tm和ΔH分別由99.5 ℃、15.9 J/g降至83.0 ℃、13.0 J/g，表明11S的熱穩(wěn)定性減弱。11S溶液經(jīng)酸熱處理（pH 2.5）或堿熱處理（pH 8.5）后，其熒光光譜顯示11S吸收峰向高波長(zhǎng)移動(dòng)且熒光強(qiáng)度降低，表明含色氨酸和酪氨酸的側(cè)鏈基團(tuán)均發(fā)生不同程度的暴露，熱處理的最大紅移波長(zhǎng)為352～356 nm，且酸處理后疏水氨基酸暴露程度更高，致使11S球蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的變化；而堿熱處理后11S的吸收峰強(qiáng)度增加，可能是熱處理過(guò)程中11S締合成多聚體導(dǎo)致散射程度增大引起的[29]。CD結(jié)果顯示，酸處理后生成的β-折疊比堿處理生成的更多[30]。Jiang Jiang等[31]發(fā)現(xiàn)11S球蛋白經(jīng)偏酸處理后，其溶解度顯著低于堿處理后的溶解度，可能是酸處理導(dǎo)致11S球蛋白的結(jié)合程度高于堿處理；SDS-PAGE結(jié)果顯示堿處理（pH 12）后的11S上清液中可溶性蛋白比酸處理（pH 1.5）后的含量高，同時(shí)隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，11S巰基含量升高，說(shuō)明11S-AB不斷解離成A和B亞基，然而凝膠電泳條帶中A亞基含量減少，可能是A亞基單體之間S—S/—SH換轉(zhuǎn)致使彼此締合形成高聚物引起的。

2.1.3 7S球蛋白組分的影響

7S球蛋白與11S球蛋白之間的相互作用對(duì)11S溶液熱解離締合反應(yīng)有重要的影響。在pH 7、100 ℃條件下加熱30 min，SPI或11S＋7S溶液均不會(huì)發(fā)生聚集，當(dāng)溫度超過(guò)90 ℃時(shí)，11S會(huì)因B亞基通過(guò)疏水相互作用交聯(lián)在一起形成不溶性聚合物，而在SPI中沒(méi)有出現(xiàn)不溶性聚合物，可能是11S和7S之間存在相互作用，形成了11S的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)或者促進(jìn)11S-B亞基溶解[32]；Yamagishi等[33]發(fā)現(xiàn)一定濃度的7S球蛋白溶液?jiǎn)为?dú)加熱不會(huì)產(chǎn)生沉淀，通過(guò)凝膠過(guò)濾、離子交換色譜和SDS-PAGE分析上清液和沉淀，結(jié)果顯示7S和11S通過(guò)二硫鍵發(fā)生相互作用，并且在加熱過(guò)程中B亞基和β亞基通過(guò)二硫鍵作用生成沉淀；而A亞基和α’、α亞基則通過(guò)二硫鍵作用主要分布在上清液。在蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的等比例混合的11S和7S溶液中，Utsumi等[34]發(fā)現(xiàn)熱處理后形成的大分子復(fù)合物中含有B亞基和β亞基，而熱處理產(chǎn)生沉淀的條件取決于7S和11S的濃度，在低11S濃度條件下，7S能抑制11S產(chǎn)生沉淀。

11S球蛋白和7S球蛋白相互作用機(jī)理[35-36]歸納如下（圖3）：1）熱處理初始階段7S和11S解離成β、α’、α、A和B亞基；2）進(jìn)一步加熱使得解離后的亞基彼此發(fā)生相互作用形成可溶性聚合肽鏈；3）在高濃度蛋白條件下，通過(guò)二硫鍵作用形成的堿性聚合肽鏈與β聚合肽鏈在二硫鍵作用下形成沉淀，而酸性亞基A與α’、α亞基通過(guò)二硫鍵發(fā)生相互作用形成寡聚體和單體分布在上清液。

圖3 熱處理過(guò)程中大豆7S球蛋白與11S球蛋白相互作用[35-36]Fig. 3 Interaction between 7S and 11S during heating[35-36]

袁德保[37]、何秀婷[38-39]等研究發(fā)現(xiàn)，7S及其亞基對(duì)11S的熱聚集有抑制作用，其亞基抑制作用能力如下：α’＞α＞7S＞β；熱誘導(dǎo)7S和11S混合溶液SDS-PAGE結(jié)果顯示：A亞基大部分分布在上清液，而B(niǎo)亞基則分布在沉淀中，這與前人的研究[33-34]相符。7S球蛋白抑制能力與其添加量在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，但當(dāng)質(zhì)量比達(dá)到一定值時(shí)，其抑制能力增大不明顯，并且離子強(qiáng)度對(duì)7S及其亞基抑制11S聚集能力有影響，即離子強(qiáng)度越大抑制效果越差。

7S亞基抑制11S熱聚集機(jī)理模型見(jiàn)圖4。混合后7S亞基與B亞基因帶異種電荷互相吸引，熱處理過(guò)程中，7S亞基暴露的疏水性基團(tuán)與B基團(tuán)發(fā)生疏水相互作用形成復(fù)合物，復(fù)合物之間的靜電排斥作用阻止聚集體進(jìn)一步增大。α’、α、β與B亞基作用差別如下：熱處理過(guò)程，與α’、α＋B體系相比，β＋B體系形成的疏水鍵更多，并且位于聚集體內(nèi)部，使得熱處理后β＋B體系的表面疏水性比α’、α＋B體系的疏水性要低，位于α’、α＋B表面上的親水性和帶電基團(tuán)能更大程度地抑制堿性多肽的聚集。

圖4 7S亞基抑制11S熱聚集機(jī)理模型[37-39]Fig. 4 Mechanism of the inhibitory effect of 7S subunits on the aggregation of 11S basic subunits[37-39]

郭健等[40-41]研究7S與11S聚集體的結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，7S和11S聚合物的粒子大小隨著加熱溫度的升高而增加，11S/7S聚合物的粒子大小隨著7S含量的增加而降低；7S形成的聚合物的大小有限，11S形成表面疏松而內(nèi)部結(jié)構(gòu)致密的不溶性聚合物；SPI不溶性聚集體大小的增長(zhǎng)被7S終止，具體過(guò)程見(jiàn)圖5。

圖5 7S-11S在pH 7.0熱聚集行為示意圖[40-42]Fig. 5 Diagrammatic depiction of 7S and 11S thermal aggregation behavior at pH 7.0[40-42]

7S與11S混合物熱聚集行為機(jī)理簡(jiǎn)括如下，根據(jù)Andrews等[42]提出的lumry-eyring nucleated polymerization（LENP）模型，11S在熱處理過(guò)程中經(jīng)歷了構(gòu)象轉(zhuǎn)變、預(yù)成核、成核、聚集和凝聚5 個(gè)階段。聚集體之間疏水作用成為凝聚生長(zhǎng)的主要?jiǎng)恿?，并且使?1S聚集體粒徑不斷增大，造成內(nèi)部肽鏈快速塌陷內(nèi)卷，增大了聚集體的密度，從而形成沉淀。在7S、11S混合物聚合過(guò)程中，7S與11S發(fā)生疏水作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物，降低了11S的聚集程度，使得11S變得可溶，即終止了SPI不溶性聚集體的增大。

2.1.4 大豆LP的影響

通過(guò)正己烷脫脂生產(chǎn)大豆蛋白并不能完全除去油脂，約有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%～1.0%脂質(zhì)殘留在脫脂大豆粉中。目前市售SPI油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.2%～0.8%之間[12,43]。Samoto等[11]首先通過(guò)堿提酸沉分離出大豆LP；Matsumura[44]、Sirison[45]等研究不同蛋白組分溶解度時(shí)發(fā)現(xiàn)，在25 ℃時(shí)，LP溶解度不到20%，7S和11S的溶解度均高于80%，而天然SPI（nature-SPI，N-SPI）的溶解度只有40%左右，在90 ℃時(shí)，LP溶解度增大，N-SPI的溶解度也增大。為了探究LP在N-SPI溶解過(guò)程的作用，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，常溫下7S溶液或11S溶液的上清液中幾乎沒(méi)有膜蛋白，而在90 ℃時(shí)，則檢測(cè)到少量膜蛋白，從而推測(cè)N-SPI溶解度低與LP的溶解度低有關(guān)。盡管N-SPI為非變性蛋白，但是LP不溶性組分較高，所以其N-SPI溶解度比市售SPI低?；贚P的溶解行為，Matsumura等[44]提出了LP的形成過(guò)程（圖6）：LP主要的膜蛋白是油體中的油質(zhì)蛋白，由于脫脂用的正己烷不能有效地溶解極性脂質(zhì)如磷脂，因此油質(zhì)蛋白和磷脂留存在脫脂粉中。有研究認(rèn)為油質(zhì)蛋白-磷脂復(fù)合物（oleosin-phospholipids，OL-PL）可能通過(guò)疏水相互作用聚集在水中形成粗大的膠體顆粒，并且在分餾過(guò)程中部分OL-PL可能會(huì)與11S和7S形成不溶性大顆粒，從而降低大豆蛋白整體溶解度[45-46]。由此推測(cè)，LP在SPI的溶解過(guò)程中可能起關(guān)鍵性作用，因而有必要對(duì)LP組分的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，以揭示其在SPI熱解離締合行為過(guò)程的作用。

圖6 大豆LP形成過(guò)程[44]Fig. 6 Formation of soybean lipophilic protein[44]

2.2 11S球蛋白凝膠體系解離締合行為

一定濃度的11S球蛋白經(jīng)熱處理時(shí)會(huì)形成凝膠，凝膠性是大豆蛋白在食品工業(yè)應(yīng)用的重要性質(zhì)之一，利用凝膠特性可加工出不同的大豆產(chǎn)品[47]。

2.2.1 鹽和pH值的影響

在100 ℃條件下加熱處理離子強(qiáng)度0.5、pH 7.6、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的11S溶液，通過(guò)蔗糖密度梯度離心和SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)在15、30 s和60 s時(shí)分別形成了分子質(zhì)量為1 800、4 000、8 000 kDa的可溶性聚集體[48]；在11S質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低（0.5%）時(shí)，進(jìn)一步加熱引起可溶性聚集體消失，并導(dǎo)致11S完全解離成A和B亞基；而11S質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，進(jìn)一步加熱形成高度聚合物，經(jīng)透射電子顯微鏡確定為凝膠，推測(cè)可溶性聚集體是11S凝膠形成過(guò)程的主要中間產(chǎn)物[49]。在NaCl濃度為0.2 mol/L、11S質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的條件下，隨溫度升高（40～80 ℃），11S儲(chǔ)能模量急劇增大，表明凝膠化速率加快[50]；通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射表征11S球蛋白熱處理過(guò)程中締合的聚集體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)聚集體的結(jié)構(gòu)與溫度和蛋白質(zhì)量濃度無(wú)關(guān)，但聚集體形成的大小與蛋白質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。凝膠形成不僅與蛋白濃度有關(guān)，還與二硫鍵有關(guān)。Chen Nannan等[51-52]研究發(fā)現(xiàn)鹽誘導(dǎo)凝膠化是不可逆的過(guò)程，且聚集體隨著鹽濃度增大而增大，然而pH值幾乎不影響凝膠化速度。熱誘導(dǎo)和鈣離子誘導(dǎo)11S形成的豆腐凝膠硬度比7S高，原因是11S凝膠中的二硫鍵含量比7S豆腐凝膠高[53]。Umeya等[54]研究發(fā)現(xiàn)二硫鍵對(duì)豆腐凝膠彈性和硬度有著重要的作用，表明游離巰基含量變化對(duì)11S形成凝膠的理化特性有重要的影響。

研究質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、2%、3%、4%、5%和10%的大豆球蛋白溶液的熱變性現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)蛋白發(fā)生凝膠的最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%～3%；0.5%蛋白溶液經(jīng)熱處理后，SDS-PAGE結(jié)果顯示其主要含有11S單體和二聚體，隨著蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，單體和寡聚體含量減少，而聚合肽鏈含量增大；且沉淀中單體、寡聚體和聚合物的含量與蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒(méi)有依賴關(guān)系，而可溶性成分含量取決于蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，由此可推測(cè)，聚合物在11S凝膠化過(guò)程有著重要的作用[55]。

2.2.2 酸性肽鏈聚合物的影響

Yamagishi等[56]以胰蛋白酶選擇性抑制或水解酸性亞基聚合物，研究酸性亞基聚合物對(duì)11S凝膠形成的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)11S溶液中胰蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，熱處理時(shí)間3 min，11S仍能形成凝膠，而持續(xù)6 min時(shí)，11S則不能凝膠化。通過(guò)CD等表征酶解后的11S構(gòu)象，發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶酶解6～10 min時(shí)，11S蛋白構(gòu)象無(wú)顯著改變，這表明酶解的11S球蛋白保持著天然構(gòu)象；SDS-PAGE結(jié)果顯示胰蛋白酶選擇性水解A亞基，從而阻止了酸性亞基聚合物的形成，導(dǎo)致熱誘導(dǎo)11S不能形成凝膠。一方面是由于含有游離巰基或二硫鍵酸性肽鏈的片段被胰蛋白酶水解，而致使其不能通過(guò)巰基-二硫鍵反應(yīng)生成聚合物；另一方面是因?yàn)樗? min離心后的沉淀物與低濃度條件下的天然11S性質(zhì)相似；由此可知，酸性亞基聚合物對(duì)11S熱凝膠化起著重要的作用[57]。

3 熱處理過(guò)程中11S球蛋白解離締合反應(yīng)機(jī)理

熱處理過(guò)程中11S球蛋白發(fā)生解離締合反應(yīng)，熱處理初期蛋白分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露出疏水核心，進(jìn)一步加熱，蛋白分子之間通過(guò)疏水相互作用發(fā)生締合反應(yīng)生成的溶膠為可溶性聚合物，當(dāng)?shù)鞍追肿邮軣岬臏囟冗_(dá)到變性溫度時(shí)，蛋白分子以及可溶性溶膠通過(guò)疏水相互作用彼此聚集沉淀生成變性蛋白，變性蛋白在一定條件下通過(guò)二硫鍵交聯(lián)形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，而后冷卻產(chǎn)生的氫鍵橋接作用使得凝膠硬度變大，由此形成蛋白凝膠。

3.1 11S球蛋白溶膠體系解離締合反應(yīng)機(jī)理

圖7 大豆11S球蛋白溶膠體系解離締合反應(yīng)機(jī)理[58-61]Fig. 7 Dissociation-association mechanism of 11S sol system[58-61]

11S球蛋白分子質(zhì)量為300～380 kDa，由圖7可知，11S球蛋白是由12 條肽鏈組成的兩個(gè)六元環(huán)[19]（I）；天然的11S球蛋白保持著剛性的球形構(gòu)象，熱處理后，11S構(gòu)象展開(kāi)使得A和B亞基暴露于PBS（pH 7.6）中，由于B亞基的等電點(diǎn)與溶液pH值最接近；因此堿性亞基之間的距離最近（II），使得堿性肽鏈之間可能發(fā)生巰基和二硫鍵交換（III）。由11S基本結(jié)構(gòu)可知，每條肽鏈至少含一個(gè)游離巰基，B和A亞基通過(guò)二硫鍵鍵合在一起；在肽鏈聚合過(guò)程中游離巰基與二硫鍵之間的轉(zhuǎn)換起著重要的作用，許多熱改性的產(chǎn)品都基于亞基或者肽鏈之間游離巰基和二硫鍵的轉(zhuǎn)換[58-61]，主要包括亞基內(nèi)的巰基與二硫鍵轉(zhuǎn)換和亞基間的巰基與二硫鍵轉(zhuǎn)換。亞基內(nèi)的巰基與二硫鍵轉(zhuǎn)換：A與B亞基之間的二硫鍵斷裂，并且在酸性肽鏈或堿性肽鏈之間形成分子內(nèi)二硫鍵；在這種條件下易形成酸性或堿性肽鏈單體（II→III）；亞基間的巰基與二硫鍵轉(zhuǎn)換：帶有游離巰基的堿性肽鏈與亞基內(nèi)的巰基與二硫鍵轉(zhuǎn)換中生成的具有分子內(nèi)二硫鍵的堿性亞基反應(yīng)，在這種條件下熱改性生成主要含有堿性亞基的聚合物（III→IV→VI→VII）。

在熱處理初始階段，11S球蛋白釋放A亞基，形成可溶性中間產(chǎn)物（II→IV），這一假設(shè)是基于在上清液中B/A值與天然11S相似，釋放出的A亞基增加了11S的疏水區(qū)域，11S球蛋白通過(guò)疏水作用進(jìn)一步形成大分子中間產(chǎn)物（IV）。當(dāng)構(gòu)象展開(kāi)后的II與11S分子反應(yīng)則生成酸性肽鏈單體和包含堿性肽鏈的寡聚體。而當(dāng)構(gòu)象展開(kāi)后的II與溶液中的可溶性大分子中間產(chǎn)物（IV）先反應(yīng)，則生成主要包含堿性肽鏈的聚合物（VI），這一過(guò)程主要的反應(yīng)是巰基-二硫鍵轉(zhuǎn)換，并且熱改性形成的分子質(zhì)量大小與巰基-二硫鍵轉(zhuǎn)換程度有關(guān)。

3.2 11S球蛋白凝膠體系解離締合反應(yīng)機(jī)理

Clark等[62]首先使用透射電子顯微鏡觀察到絲束狀為11S凝膠網(wǎng)絡(luò)主要結(jié)構(gòu)，從而提出了“串珠模型”，認(rèn)為在熱聚集過(guò)程中11S蛋白構(gòu)象的展開(kāi)以“珍珠”形狀保持球形結(jié)構(gòu)并串聯(lián)在一起，Hermansson[63]在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)“珠”的大小與天然11S球蛋白粒子大?。?1 nm×11 nm×7.5 nm）接近。Mori等[48]報(bào)道了11S經(jīng)熱處理后會(huì)產(chǎn)生沉淀，可溶性聚合物是這一反應(yīng)的中間產(chǎn)物，通過(guò)蔗糖密度梯度離心和SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)，在15、30 s和1 min內(nèi)分別形成了分子質(zhì)量為1 800、4 000、8 000 kDa的可溶性聚集體。

熱處理過(guò)程中11S球蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變機(jī)理如下（圖8）：1）0～15 s內(nèi)形成由6 個(gè)11S分子構(gòu)成的“串珠”I類型分子；2）“串珠”類型I分子彼此締合形成“直鏈”類型II分子；3）“直鏈II”分子與相似的分子或與“串珠I”分子締合形成“直鏈或直鏈”類型III分子；類型III分子即是11S凝膠的結(jié)構(gòu)單元[64-66]。

圖8 大豆11S球蛋白凝膠化形成可溶性聚合物過(guò)程[64-66]Fig. 8 Schematic representation of the formation of soluble aggregates in the course of gelation of glycinin[64-66]

3.3 11S球蛋白亞基解離締合反應(yīng)機(jī)理

在熱處理過(guò)程中，分子水平上11S亞基的解離締合反應(yīng)的具體機(jī)理還不是很明確，基于現(xiàn)有的研究成果、研究模型和相關(guān)理論（LENP模型），模擬分子水平提出11S熱解離締合反應(yīng)機(jī)制如圖9所示[67-69]。具體如下：1）天然狀態(tài)11S的六聚體經(jīng)熱處理后釋放出一個(gè)或多個(gè)肽鏈（分子I），釋放肽鏈后形成分子II和III，導(dǎo)致天然11S疏水區(qū)增大導(dǎo)致疏水性增強(qiáng)；2）II和Ⅲ通過(guò)疏水相互作用彼此締合在一起形成分子IV；3）5～6 個(gè)分子IV彼此通過(guò)二硫鍵締合在一起形成分子V，且在II→V過(guò)程形成線性分子的作用力主要是疏水相互作用；4）當(dāng)直鏈中含有15～20 個(gè)分子IV時(shí)，就可能發(fā)生巰基-二硫鍵轉(zhuǎn)換，生成主要含有堿性肽鏈的聚合物，聚合過(guò)程還伴隨著酸性肽鏈單體的釋放；5）繼續(xù)加熱能導(dǎo)致基于分子V為基本單元的直鏈和直鏈聚合物的生成，支鏈聚合物的產(chǎn)生主要是11S球蛋白的酸性亞基和堿性亞基分子V發(fā)生巰基-二硫鍵反應(yīng)造成；6）當(dāng)加熱到一定程度時(shí)，堿性肽鏈之間的聚集會(huì)加速，由于溶液pH值接近堿性亞基等電點(diǎn)，堿性肽鏈在一定濃度下會(huì)聚集產(chǎn)生沉淀，在高濃度下形成凝膠的基本結(jié)構(gòu)；7）在高濃度和低濃度下A亞基的解離締合行為差異，熱處理后11S的酸性亞基釋放主要分布在上清液，通過(guò)巰基-二硫鍵反應(yīng)形成分子間二硫鍵使得聚合肽鏈鍵合在一起形成凝膠，并且在凝膠結(jié)構(gòu)內(nèi)保留更多的酸性亞基，而在沉淀中，則不發(fā)生巰基-二硫鍵反應(yīng)。

圖9 大豆11S球蛋白熱解離締合反應(yīng)機(jī)理示意圖[67-69]Fig. 9 Schematic representation of the mechanism of the dissociationassociation action of 11S[67-69]

雖然反應(yīng)機(jī)理揭示了熱處理過(guò)程中11S亞基解離締合大部分反應(yīng)行為，但還忽略了許多重要的影響因素，如蛋白質(zhì)和水的相互作用也是形成凝膠過(guò)程的重要作用力，并且聚合酸性肽鏈在凝膠形成中的重要作用并未體現(xiàn)等。

4 結(jié) 語(yǔ)

大豆蛋白熱解離-締合反應(yīng)是目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。關(guān)于11S的熱解離締合行為的研究在國(guó)外已經(jīng)進(jìn)行了半個(gè)多世紀(jì)，而國(guó)內(nèi)則晚了一二十年；然而目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于11S解離締合反應(yīng)機(jī)制的研究大多限于理想條件下的模擬研究，基本使用緩沖液體系，很少模擬實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程體系條件，且在混合體系中，不同組分和加熱條件對(duì)大豆球蛋白的解離締合行為影響的規(guī)律及可逆反應(yīng)控制范圍還不明確，大豆蛋白在熱處理解離締合反應(yīng)的表征鑒定指標(biāo)也需要探索。大豆11S球蛋白是大豆蛋白主要成分之一，熱處理可以改變大豆蛋白構(gòu)象從而獲得理想功能性質(zhì)的蛋白，11S的熱解離締合行為一定程度上決定了大豆制品的后期加工特性、品質(zhì)及其應(yīng)用范圍。因此掌握大豆11S球蛋白在不同組分混合體系和不同熱處理?xiàng)l件下解離締合行為的表征和可逆變化機(jī)制，有助于在大豆食品熱加工過(guò)程中對(duì)其體系聚集行為進(jìn)行適度控制，比如在豆乳粉中加工過(guò)程中實(shí)行可控?zé)崽幚?，可減少大豆蛋白不可逆聚集體的形成，從而改變不同批次豆粉二次回溶分散性差異的現(xiàn)狀；同時(shí)大豆蛋白熱處理中的解離締合行為及機(jī)制的研究也為實(shí)現(xiàn)大豆蛋白相關(guān)食品加工的可控?zé)崽幚砑夹g(shù)提供理論依據(jù)。