黃曲霉毒素B1的分子致毒機(jī)理及其微生物脫毒研究進(jìn)展

趙 萌，高 婧，褚華碩,2，梁志宏,*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；2.北京大偉嘉生物技術(shù)股份有限公司，微生態(tài)制劑關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)北京工程實(shí)驗(yàn)室，北京市飼用微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心，北京 100085）

真菌毒素作為一類具有毒性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要由曲霉菌屬（Aspergillus spp.）、青霉菌屬（Penicillium spp.）、鐮孢菌屬（Fusarium spp.）和鏈格孢屬（Alternaria spp.）等真菌產(chǎn)生[1]。2012年歐盟食品和飼料類快速預(yù)警系統(tǒng)通報(bào)中指出，真菌毒素是歐盟邊界通報(bào)的主要風(fēng)險(xiǎn)因子。而黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）是通報(bào)中的最主要的真菌毒素，占所有通報(bào)真菌毒素的92%左右[2]。AFT是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌铮饕牲S曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）產(chǎn)生[3]。在4 種主要的AFT（AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）中，AFB1具有最強(qiáng)的毒性和致癌性，可在農(nóng)作物生長(zhǎng)、農(nóng)產(chǎn)品收獲、運(yùn)輸、貯藏等多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生污染[4]，主要分布在堅(jiān)果、花生、玉米、小麥和大豆等食品和糧食中，2002年被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為I級(jí)強(qiáng)致癌物[5]。

由于AFB1對(duì)人和動(dòng)物具有危害，有必要采取有效的脫毒方式控制它們?cè)谑澄镏械奈廴?。已?jīng)報(bào)道在食物和飼料中脫除AFB1的幾種策略包括加熱、輻射和等離子降解等物理方法[6-8]以及臭氧、過氧化氫和檸檬酸處理等化學(xué)方法[9-11]。物理法因其方便、快速、高效的優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，但存在儀器成本高、可能改變物質(zhì)性質(zhì)和產(chǎn)生輻射污染等缺點(diǎn)[12]。化學(xué)法主要是運(yùn)用化學(xué)試劑與AFB1分子發(fā)生反應(yīng)，破壞其毒性結(jié)構(gòu)，進(jìn)而達(dá)到脫毒效果。該方法處理簡(jiǎn)單、成本低，但可能出現(xiàn)二次污染、破壞產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)成分等危害[13]。微生物脫毒因其特異性強(qiáng)、污染小、能夠保證食品營(yíng)養(yǎng)安全等優(yōu)點(diǎn)成為最具發(fā)展前景的方法[14]。目前，微生物法主要利用微生物菌體本身、代謝產(chǎn)物以及脫毒酶進(jìn)行脫毒，但仍然存在菌體功能不穩(wěn)定、脫毒物質(zhì)分離純化難度大等一系列問題。因此，了解AFB1的毒性機(jī)理并探索有效的脫除方法有重要意義。本文綜述AFB1毒性機(jī)理及近年來微生物脫毒的研究進(jìn)展，總結(jié)細(xì)菌、真菌和脫毒酶的發(fā)現(xiàn)和作用機(jī)理，并對(duì)探索高效、無污染的AFB1脫毒技術(shù)的前景進(jìn)行展望。

1 AFB1的結(jié)構(gòu)和理化特性

表1 AFT分類及結(jié)構(gòu)[15]Table 1 Classification and structures of AFTs[15]

圖1 AFT結(jié)構(gòu)通式Fig. 1 Structures of AFTs

AFT均為多環(huán)芳烴化合物，有20多種結(jié)構(gòu)，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)將其分為兩大類（表1）[15]：二氫呋喃香豆素環(huán)戊烯酮組包括B組AFT（AFB1、AFB2、AFB2a）、M組AFT（AFM1、AFM2）、黃曲霉毒醇（aflatoxicol，AFL）和AFQ1；二氫呋喃香豆素內(nèi)酯組包含G組AFT（AFG1、AFG2、AFG2a）（圖1）。其中，AFM1和AFM2分別是AFB1和AFB2的代謝產(chǎn)物。AFT為熒光化合物，在紫外光下，B組AFT發(fā)出藍(lán)色熒光，而G組AFT顯示綠色熒光。各種AFT毒性順序是AFB1＞AFM1＞AFG1＞AFB2＞AFM2＞AFG2，其中AFB1毒性最強(qiáng)。根據(jù)大鼠口服實(shí)驗(yàn)結(jié)果，AFB1的動(dòng)物半數(shù)致死量為4.8 mg/kg，其毒性是氰化鉀的10 倍、砒霜的68 倍，能引起人和動(dòng)物急性中毒死亡[16]。

AFB1分子式為C17H12O6，相對(duì)分子質(zhì)量為312.06，在紫外光照射下非常穩(wěn)定，在269 ℃左右高溫下才會(huì)分解。其在中性條件下穩(wěn)定，在pH 1.0～3.0的強(qiáng)酸性溶液中才有極少量的分解，但在pH 9.0～10.0的堿性溶液中易分解。AFB1易溶于氯仿、丙酮、甲醇、乙醇等多種有機(jī)溶劑，但不溶于乙醚、石油醚、己烷和水，因此普通的物理和化學(xué)方法難以將其徹底脫除[17]。

目前，我國(guó)的飼料、堅(jiān)果、牛奶等食品中仍可檢測(cè)出AFB1，甚至存在含量超標(biāo)的情況。徐進(jìn)棟等[18]采集了山東省各地規(guī)模化動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)、各大飼料廠及養(yǎng)殖戶的1 037 份樣品測(cè)定AFB1含量。結(jié)果表明，山東省飼料原料AFB1超標(biāo)率分別為：玉米27.71%、花生餅粕23.27%、玉米胚芽粕4.92%。AFB1污染仍是食品、飼料等行業(yè)中亟待解決的問題。因此，了解AFB1毒性機(jī)理以及脫毒研究概況對(duì)探索有效的脫毒方式具有一定的意義。

2 AFB1的毒性機(jī)理

AFT具有高毒性和致癌性，它對(duì)人類和動(dòng)物健康的危害已引起各國(guó)科研工作者的廣泛關(guān)注。目前，研究者對(duì)AFB1毒性的研究包括其對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的致癌毒性、基因毒性、生殖毒性、免疫毒性以及神經(jīng)毒性等[19]。AFT一方面直接影響動(dòng)物機(jī)體健康；另一方面會(huì)轉(zhuǎn)移到畜禽產(chǎn)品（肉、奶、蛋）中，通過食物鏈威脅人類健康。人類的AFT急性中毒通常與誤食了被AFT污染的食品有關(guān)，往往發(fā)展為急性肝炎、膽管增生、肝細(xì)胞壞死、肝充血出血，還會(huì)出現(xiàn)典型變化如黃疸、發(fā)熱、食欲減退、厭食和腹瀉，嚴(yán)重者會(huì)發(fā)生肝脾腫大、肝區(qū)疼痛、黏膜黃染、肝功能異常等中毒性癥狀，也可能出現(xiàn)痙攣、昏迷等危險(xiǎn)狀況[20]。AFB1具有嚴(yán)重的慢性毒性作用,具有明確的致癌性,能夠造成嚴(yán)重肝損傷甚至引發(fā)肝癌，且會(huì)對(duì)人體造成一系列其他生理方面的損害，如在大劑量下引發(fā)急性毒作用甚至死亡，或慢性亞致死劑量造成人體營(yíng)養(yǎng)缺乏癥以及免疫系統(tǒng)損害[21]。了解AFB1致毒機(jī)理和毒性位點(diǎn)可以為探索有效的脫毒劑研究提供一定的理論依據(jù)。

2.1 致毒機(jī)理

AFB1經(jīng)細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）氧化酶形成的活性代謝物AFB1-8,9-環(huán)氧化合物（AFB1-8,9-epoxide，AFBO）及隨后與DNA、RNA和蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合是其發(fā)揮毒性作用的主要機(jī)制[4]。AFB1的致癌和致突變效應(yīng)與其代謝過程有關(guān)，其中環(huán)氧化過程是致毒代謝過程，而羥基化、水合和去甲基化被認(rèn)為是解毒代謝過程。AFB1的主要靶器官是肝臟，動(dòng)物攝入AFB1后，經(jīng)肝微粒體CYP450將其代謝為親電子的AFBO，然后結(jié)合DNA和蛋白質(zhì)等大分子形成加合物，可引起較強(qiáng)的肝損傷和肝致癌性。AFBO與DNA鏈鳥苷酸殘基上的N7結(jié)合，形成AFB1-N7-鳥嘌呤加合物，導(dǎo)致DNA損傷和基因突變，表現(xiàn)為基因毒性；AFBO與蛋白質(zhì)結(jié)合形成AFB1-賴氨酸加合物，抑制細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。然而，AFBO可通過環(huán)氧化物水解酶和谷胱甘肽硫基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化為毒性較低的AFB1-二氫二醇和尿酸的方式解毒。AFB1也可經(jīng)過羥基化作用轉(zhuǎn)化為AFM1、AFP1、AFQ1和AFL，前三者經(jīng)尿液直接排出或與葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合經(jīng)糞便排出，是重要的解毒環(huán)節(jié)；而AFL又會(huì)被氧化成AFB1，繼續(xù)發(fā)揮毒性作用（圖2）。另外，AFB1的致癌毒性還與某些基因有關(guān)，其致癌的分子機(jī)制主要是致癌基因的激活和抑癌基因的失活。研究表明，AFB1可引起致癌基因（如ras、c-fos）及抑癌基因（如p53、survivin）表達(dá)水平的改變[22-23]。

圖2 AFB1的毒性機(jī)理示意圖[4]Fig. 2 Schematic diagram of the toxic mechanism of AFB[4]1

2.2 AFB1毒性位點(diǎn)

如圖3所示，AFB1結(jié)構(gòu)中主要有3 個(gè)毒性位點(diǎn)[24]，其中：第1個(gè)毒性位點(diǎn)是位于呋喃環(huán)上的8、9位雙鍵，其是AFB1與蛋白和核酸形成加合物的作用位點(diǎn)，是基因突變和致癌、致畸的主要功能基團(tuán)；第2個(gè)毒性位點(diǎn)是位于AFB1中香豆素的內(nèi)酯環(huán)部分的10、11、15號(hào)位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)在氨化時(shí)被水解，形成仍然保留8,9-雙呋喃環(huán)雙鍵的AFD1；第3個(gè)毒性位點(diǎn)是AFB1環(huán)戊烯酮環(huán)，通過加成、酮羰基還原的一些取代基團(tuán)對(duì)AFB1的毒性有一定的影響。因此，破壞AFB1的毒性位點(diǎn)是可能的脫毒機(jī)理。

目前對(duì)于AFB1毒性位點(diǎn)的研究主要是通過破壞毒素分子的毒性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)、生成毒性較低產(chǎn)物的過程。已經(jīng)有大量關(guān)于微生物或酶對(duì)AFB1結(jié)構(gòu)的破壞作用及產(chǎn)物的研究。Wang Jianqiao等[25]從白腐真菌的Phanerochaete sordida YK-624中純化出的錳過氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）主要是通過作用于AFB1的8,9-不飽和碳-碳鍵生成AFB1-二氫二醇，從而達(dá)到脫毒的目的。有研究發(fā)現(xiàn)AFT降解酶（aflatoxin-detoxizyme，ADTZ）同樣作用于AFB1的8,9-不飽和碳-碳鍵，在生成AFB1-二氫二醇的基礎(chǔ)上進(jìn)一步打開呋喃環(huán)[26]。Jin等[27]發(fā)現(xiàn)AFB1被微生物降解后發(fā)生羥化，生成毒性較低的熒光化合物AFB2a。綠色木霉（Trichoderma viride）、不明毛霉（Mucor ambiguous）和黑曲霉（Aspergillus niger）將AFB1的2-環(huán)戊烯酮環(huán)上的酮羰基還原形成AFL，其毒性比AFB1低[28]。Taylor等[29]從恥垢分歧桿菌（Mycobacterium smegmatis）中分離純化得到的過氧化氫酶可以使AFB1的α,β-不飽合酯還原，從而使AFB1水解形成一種新的無毒的降解產(chǎn)物。

圖3 AFB1的毒性位點(diǎn)及產(chǎn)物Fig. 3 Toxicity sites and products of AFB1

3 微生物脫毒方法及其機(jī)制

目前，AFB1的脫毒方法分為物理法、化學(xué)法以及微生物法。微生物法因其具有高效、特異性強(qiáng)、對(duì)環(huán)境友好、污染小等優(yōu)點(diǎn)成為目前的研究熱點(diǎn)。微生物脫毒指利用微生物本身特性及代謝產(chǎn)物來修飾毒素分子或破壞其毒性結(jié)構(gòu)，進(jìn)而達(dá)到脫毒的目的。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織的規(guī)定，AFT的脫毒工藝必須滿足以下條件：1）去除AFT或者使之失去活性；2）不產(chǎn)生任何有毒的副產(chǎn)物；3）破壞產(chǎn)毒的真菌孢子或菌絲體；4）脫毒后食品或飼料應(yīng)保持其原有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和適口性[17]。

目前，微生物脫毒方法主要表現(xiàn)為兩個(gè)方面：一是利用微生物菌體本身吸附AFB1，這主要與細(xì)胞壁的成分有關(guān)，研究最多的是乳酸菌和酵母菌；二是一些微生物在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生代謝產(chǎn)物（主要為胞外酶）降解AFB1，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種脫毒酶，但大多數(shù)研究停留在脫毒活性物質(zhì)的粗提物上，脫毒活性物質(zhì)的純化以及菌體脫毒功能的不穩(wěn)定性仍是目前研究的瓶頸。以下主要介紹對(duì)AFB1具有吸附和降解作用的微生物及其脫毒酶的研究進(jìn)展。

3.1 微生物的吸附作用對(duì)AFB1的脫除

自然界中有些微生物的脫毒方式與菌體本身的性質(zhì)如細(xì)胞壁成分有關(guān)，微生物的吸附作用是指微生物利用細(xì)胞壁的某種成分或結(jié)構(gòu)可以吸附AFB1，如細(xì)菌中研究最多的乳酸菌、真菌中的酵母菌等益生菌，都是通過形成菌體-毒素復(fù)合體發(fā)揮作用的[30]。

3.1.1 乳酸菌對(duì)AFB1的吸附

用于吸附AFB1的所有細(xì)菌中，被研究最多的是乳酸菌（Lactobacillus）[31]。其脫毒機(jī)理主要是通過細(xì)胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺為主要成分的肽聚糖對(duì)AFB1進(jìn)行物理吸附，這類微生物可用作食品發(fā)酵添加劑。Hernandez等[32]篩選出的干酪乳桿菌（Lactobacillus casei L30）對(duì)AFB1的吸附率為49.2%，其主要是通過細(xì)胞壁產(chǎn)生胞壁酸與AFB1形成穩(wěn)定的毒素-菌體復(fù)合物發(fā)揮作用；隨后的反復(fù)水洗實(shí)驗(yàn)證明了其吸附作用有限且可逆。Bovo等[33]研究滅活的鼠李糖乳桿菌通過噴霧干燥或冷凍干燥后對(duì)AFB1和菌體細(xì)胞的結(jié)合效果，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在噴霧干燥過程中因破壞了細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和功能而完全喪失AFB1結(jié)合能力，因而在冷凍干燥過程中保持完整。因此，冷凍干燥的鼠李糖乳桿菌細(xì)胞可以成為AFB1污染食品的有效脫毒產(chǎn)品。Taheur等[34]從開菲爾培養(yǎng)物中分離出對(duì)AFB1吸附和生物轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)的乳酸桿菌（Lactobacillus kefiri），當(dāng)pH值為4.8時(shí)，其在牛奶中能吸附82% AFB1，在解吸實(shí)驗(yàn)后仍保留65% AFB1。

3.1.2 酵母菌對(duì)AFB1的吸附

酵母細(xì)胞因其細(xì)胞壁中含有葡聚糖、甘露聚糖、幾丁質(zhì)等特殊成分，能夠?qū)Χ舅禺a(chǎn)生吸附作用。劉暢等[35]首次篩選出了吸附效果較佳的釀酒酵母Y1（Saccharomyces cerevisiae Y1），其對(duì)AFB1的吸附率達(dá)81.16%，實(shí)驗(yàn)表明Y1與AFB1通過物理方式結(jié)合，結(jié)合物可通過離心和過濾方式除去以保證吸附后食品的安全性，因此可廣泛應(yīng)用作飼料添加劑。錢潘攀等[36]利用麝香草酚裂解酵母細(xì)胞，同時(shí)以酵母膜脂為載體，與細(xì)胞壁共同組成具備抑制黃曲霉孢子萌發(fā)和吸附毒素能力的雙效型細(xì)胞壁提取物。結(jié)果表明，麝香草酚可以誘導(dǎo)酵母細(xì)胞發(fā)生裂解，導(dǎo)致細(xì)胞壁上肽聚糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化、細(xì)胞內(nèi)容物釋放，增強(qiáng)了對(duì)AFB1的吸附能力。該產(chǎn)品對(duì)AFB1的吸附量達(dá)到2.5 μg/mg，為糧食、飼料中控制AFT污染提供了新的研究思路及理論依據(jù)。Martínez等[37]研究了從虹鱒魚腸和魚飼料中分離的酵母對(duì)AFB1的吸附能力，以評(píng)估其在飼料添加劑中的應(yīng)用。結(jié)果表明，漢遜德巴利酵母RC031（Debaryomyces hansenii RC031）與AFB1在25 ℃孵育1 h的吸附率達(dá)21%，可以作為益生菌使用來改善虹鱒魚的產(chǎn)量。

另外，某些芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）[38]、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium spp.）、鐮刀菌屬（Fusarium spp.）等益生菌細(xì)胞對(duì)毒素有一定的吸附作用[25]。與物理吸附不同，微生物對(duì)AFB1的吸附效率不受吸附劑孔徑大小、接觸面積等影響，其通過形成菌體-毒素復(fù)合物如胞壁糖、胞壁酸，使毒素難以被機(jī)體吸收。但許多微生物對(duì)毒素的吸附?jīng)]有特異性，只是以非共價(jià)方式結(jié)合，受環(huán)境影響較大，不能從根本上脫除毒性。

3.2 微生物的降解作用對(duì)AFB1的脫除

微生物降解AFB1是利用微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物或分泌的蛋白酶破壞毒素分子的毒性結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生無毒無害降解產(chǎn)物的過程。其降解機(jī)制主要是破壞AFB1的毒性結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，即雙呋喃環(huán)末端雙鍵、內(nèi)酯環(huán)和環(huán)戊烯酮環(huán)。微生物的降解作用主要通過微生物酶促反應(yīng)進(jìn)行，包括經(jīng)純化獲得的脫毒酶以及微生物發(fā)酵粗提液的作用。

3.2.1 脫毒酶對(duì)AFB1的降解

降解AFB1的脫毒酶已被從不同的微生物系統(tǒng)中提取和純化。脫毒酶解毒避免了微生物吸附脫毒的缺點(diǎn)，且安全高效、環(huán)境友好、特異性強(qiáng)，已經(jīng)應(yīng)用于食品和飼料工業(yè)中[39]。負(fù)責(zé)降解AFB1的酶已經(jīng)被分離、純化和鑒定，包括漆酶、AF氧化酶（aflatoxin-oxidase，AFO）、辣根過氧化物酶、MnP、F420H2依賴性還原酶（F420H2dependent reductases，F(xiàn)DR）等。

3.2.1.1 氧化酶對(duì)AFB1的降解

對(duì)于氧化酶的研究，暨南大學(xué)微生物技術(shù)研究所Liu Daling等[40]的研究較深入，該團(tuán)隊(duì)首先從假蜜環(huán)菌（Armillariella tabescens）細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了具有降解AFB1活性的酶，能夠完全降解AFB1，其經(jīng)分離、純化并被命名為ADTZ[41]，毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其降解產(chǎn)物致突變作用降低。Cao Hong等[42]對(duì)先前純化的ADTZ進(jìn)行電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜（electrospray ionization-mass/mass spectrometry，ESI-MS/MS）分析和堿基局部對(duì)準(zhǔn)檢索工具檢索，推斷該酶是AFO；經(jīng)高性能薄層色譜（high performance thin layer chromatography，HPTLC）分析表明其能夠水解AFB1的雙呋喃環(huán)體系。Wu Yuanzhen等[26]研究了AFO的作用位點(diǎn)，結(jié)果表明AFB1的8,9-不飽和碳-碳鍵是AFO的潛在反應(yīng)位點(diǎn)。目前已經(jīng)得出ADTZ的基因序列，溫思霞[43]、胡熔[44]等已經(jīng)分別將其成功導(dǎo)入到畢赤酵母和大腸桿菌中，使其成功表達(dá)并得到高純度、有活性的rADTZ蛋白，為rADTZ蛋白結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。為提高ADTZ在飼料中應(yīng)用的穩(wěn)定性，Qiu Yuxin等[45]對(duì)AFO的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)，提高了其對(duì)胰蛋白酶的抗性。為更清楚地了解AFO結(jié)構(gòu)特性，Xu Tingting等[46]發(fā)現(xiàn)AFO與二肽基肽酶III（dipeptidyl peptidase III，DPPIII）家族成員具有高度的序列同一性，與經(jīng)典DPPIII結(jié)構(gòu)不同，AFO結(jié)構(gòu)全都為閉合構(gòu)象，而與底物結(jié)合無關(guān)（圖4）。因此，AFO是一種具有AFO和DPPIII活性的雙活性酶，其獨(dú)特的構(gòu)象特征擴(kuò)展了對(duì)該酶家族反應(yīng)模式的理解。

圖4 AFO的三維結(jié)構(gòu)[46]Fig. 4 Three-dimensional structure of AFO[46]

另一種研究較多的氧化酶是漆酶，它是多銅氧化酶，可用作多功能生物催化劑，用于環(huán)境污染綠色生物修復(fù)。Scarpari等[47]研究了變色栓菌（Trametes versicolor）產(chǎn)生的漆酶在體外和玉米中對(duì)AFB1產(chǎn)生的影響，結(jié)果顯示1.8 U/mL漆酶48 h后在體外條件下能降解70% AFB1；體內(nèi)條件下對(duì)處理7 d的玉米種子顯示出AFB1降解活性（種子中降解率為30%、磨碎的種子中為43%），且毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)降解產(chǎn)物不影響細(xì)胞活力，目前該菌產(chǎn)生的漆酶已經(jīng)作為商業(yè)酶投入使用。Loi等[48]從側(cè)耳（Pleurotus pulmonarius）中分離出漆酶，進(jìn)一步分離純化出Lac2，并研究其對(duì)AFB1和AFM1的降解活性。將酶活力為5 U/mL的Lac2用乙酸鈉緩沖液處理后再加入氧化還原介體乙酰丁香酮，能夠降解90% 1 mg/L AFB1，而AFM1完全被降解，因此Lac2是良好的脫毒酶制劑。目前研究人員已經(jīng)獲得了該酶的基因序列，可以通過基因工程的手段大量生產(chǎn)AFB1脫毒酶。

3.2.1.2 過氧化物酶對(duì)AFB1的降解

目前報(bào)道的3 種不同的過氧化物酶均具有降解AFB1能力，分別從辣根、Phanerochaete sordida YK-624和Pleurotus ostreatus中提取和純化。Das等[49]將0.2 U/mL辣根過氧化物酶作用于AFB11 h后，毒素在體外降解率達(dá)到42%，在花生中降解率達(dá)到41%，毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明降解產(chǎn)物的毒性降低。Wang Jianqiao等[25]用來自白腐真菌Phanerochaete sordida YK-624的5 nkat MnP處理AFB148 h后，AFB1的降解率達(dá)86%；加入吐溫-80增強(qiáng)了其脫除AFB1的能力，誘變實(shí)驗(yàn)表明20 nkat MnP處理AFB1使其誘變活力降低69.2%。氫核磁共振和高分辨-ESI-MS分析表明，AFB1首先被MnP氧化成AFB1-8,9-環(huán)氧化物，然后水解成AFB1-8,9-二氫二醇（圖5），這是首次關(guān)于MnP將AFB1轉(zhuǎn)化為AFB1-8,9-二氫二醇的報(bào)道。Yehia等[50]從白腐菌平菇（Pleurotus ostreatus）培養(yǎng)濾液中獲得MnP，發(fā)現(xiàn)1.5 U/mL MnP和AFB1孵育48 h其降解率達(dá)到90%，隨后分離純化得到純MnP，并對(duì)MnP-cDNA編碼基因進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)MnP-cDNA由497 bp的開放閱讀框組成，編碼165 個(gè)氨基酸，未來可以通過基因工程的手段大量生產(chǎn)此脫毒酶產(chǎn)品。

圖5 MnP和AFO對(duì)AFB1的降解機(jī)理[25]Fig. 5 Degradation mechanism of AFB1 by MnP and AFO[25]

3.2.1.3 還原酶對(duì)AFB1的降解

Taylor等[29]表征了來自恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis）的催化AFB1降解的FDR-A和FDR-B，其是利用去氮烷黃素輔因子F420H2催化AFT α,β-不飽和酯部分還原的活性分子（圖6）。與先前報(bào)道降解AFT的酶不同，F(xiàn)DR-A和FDR-B與毒素作用后使內(nèi)酯環(huán)不穩(wěn)定，激活分子發(fā)生加成反應(yīng)進(jìn)行脫毒。其屬于兩個(gè)先前未表征的FDR家族。該團(tuán)隊(duì)還研究了FDR-A和FDR-B的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)來自每個(gè)FDR家族的酶的晶體結(jié)構(gòu)都是采用分裂的桶蛋白質(zhì)折疊，具有延伸的和高度帶電的F420H2結(jié)合溝。

圖6 FDR對(duì)AFB1的降解機(jī)理[29]Fig. 6 Degradation mechanism of AFB1 by F420H2-dependent reductase[29]

3.2.1.4 其他酶對(duì)AFB1的降解

對(duì)于脫毒酶的研究中還存在一些未知特性的酶。黃色粘球菌ANSM068（Myxococcus fulvus ANSM068）的菌體上清液與毒素作用48 h后，對(duì)AFB1（71.89%）、AFG1（68.13%）和AFM1（63.82%）有較高的降解率；制備、純化和鑒定該菌中的功能酶黏細(xì)菌AFT降解酶（myxobacteria aflatoxin degradation enzyme，MADE），發(fā)現(xiàn)Mg2＋促進(jìn)、Zn2＋強(qiáng)烈抑制其活性；純MADE處理毒素時(shí)，AFG1和AFM1分別降解96.96%和95.80%，然而其降解機(jī)制尚未明確[51]。Xu Liang等[52]發(fā)現(xiàn)從玉米、水稻和土壤樣品中獲得的對(duì)AFB1有較高還原活性的細(xì)菌分離物Bacillus shackletonii L7與毒素37 ℃作用72 h后，AFB1、AFB2和AFM1分別降解92.1%、84.1%和90.4%。他們將從煮沸的上清液中純化的熱穩(wěn)定性酶命名為芽孢桿菌AFT降解酶（Bacillus aflatoxin-degrading enzyme，BADE），目前對(duì)該酶的氨基酸序列及蛋白結(jié)構(gòu)在進(jìn)一步研究中。

3.2.2 微生物發(fā)酵上清液粗提液對(duì)AFB1的降解

微生物發(fā)酵粗提液因其具有AFB1降解潛力而被廣泛研究，這主要是因?yàn)槲⑸锏陌l(fā)酵作用產(chǎn)生的某種物質(zhì)破壞了AFB1分子的毒性結(jié)構(gòu)[53]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多細(xì)菌和真菌的發(fā)酵粗提液對(duì)AFB1的降解作用，包括嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）等細(xì)菌和假蜜環(huán)菌（Armillariella tabescens）、黑曲霉（Aspergillus niger）等真菌，其主要是通過發(fā)酵粗提液的酶促反應(yīng)機(jī)制達(dá)到脫毒效果。

3.2.2.1 細(xì)菌發(fā)酵粗提液對(duì)AFB1的降解

細(xì)菌能夠降解AFB1，這主要是通過發(fā)酵液的酶促反應(yīng)機(jī)制，但相關(guān)研究?jī)H停留在脫毒現(xiàn)象上，對(duì)其發(fā)揮作用的物質(zhì)尚未確定。李俊霞等[54]以香豆素為唯一碳源和能源，得到一株對(duì)AFB1降解率達(dá)85.7%的NMO-3菌株，并鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas sp.），這是首次分離得到降解AFB1的單胞菌屬菌株。Xia Xiaoshuang等[55]從土壤樣品中分離出降解AFB1的枯草芽孢桿菌JSW-1（Bacillus subtilis JSW-1），30 ℃孵育72 h后能夠降解67.2% AFB1，降解活性主要?dú)w因于無細(xì)胞上清液的粗提物，并發(fā)現(xiàn)其具有熱穩(wěn)定性，但對(duì)蛋白酶K處理敏感，表明胞外蛋白質(zhì)或酶是導(dǎo)致AFB1降解的原因。Rao等[56]篩選出地衣芽孢桿菌CFR1（Bacillus licheniformis CFR1），其胞外成分與AFB1作用72 h后降解率達(dá)93.57%。通過HPTLC、高效液相色譜法和ESI-MS分析，降解產(chǎn)物熒光性消失，表明AFB1被生物轉(zhuǎn)化成與其結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)，Ames誘變實(shí)驗(yàn)表明地衣芽孢桿菌CFR1可以顯著降低AFB1的誘變性。Samuel等[57]發(fā)現(xiàn)惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）孵育24 h后將AFB1降解至檢測(cè)不到的水平，氣相色譜-MS和傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）分析表明，AFB1分子是通過呋喃、內(nèi)酯環(huán)的修飾和環(huán)戊烯酮環(huán)丟失，被轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)不同且毒性較低的新化合物（AFD1、AFD2和AFD3）（圖7）。Eshelli等[58]發(fā)現(xiàn)紅平紅球菌菌株（Rhodococcus erythropolis ATCC 4277）對(duì)AFB1的降解率達(dá)96%，通過液相色譜-MS和FT-IR分析，鑒定出AFB1的降解途徑是經(jīng)過脂肪酸代謝和糖酵解中間體的積累形成分子式為C13H16O4、摩爾質(zhì)量為236.104 9 g/mol的芳香族化合物（圖8）。

圖7 惡臭假單胞菌對(duì)AFB1的降解機(jī)理[57]Fig. 7 Degradation mechanism of AFB1 by Pseudomonas putida[57]

圖8 紅平紅球菌ATCC 4277對(duì)AFB1的降解過程[58]Fig. 8 Degradation of AFB1 by Rhodococcus erythropolis ATCC 4277[58]

3.2.2.2 真菌發(fā)酵粗提液對(duì)AFB1的降解

真菌對(duì)AFB1降解作用的研究和應(yīng)用同樣廣泛。劉大嶺等[59]發(fā)現(xiàn)從真菌假蜜環(huán)菌（Armillariella tabescens）中提取的胞內(nèi)粗酶液可使樣品中的AFB1完全降解。Wang Cuiqiong等從發(fā)霉花生中分離出鐮刀菌WCQ3361（Fusarium phaseoli WCQ3361），與AFB1孵育24 h后降解率為95.38%，且有效成分是蛋白質(zhì)，具有較好的熱穩(wěn)定性，并通過人肝癌HepG2細(xì)胞的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明降解產(chǎn)物毒性降低[60]。張曉雪[61]發(fā)現(xiàn)新型黑曲霉FS-UV1（Aspergillus niger FS-UV1）對(duì)AFB1的脫除率為87.3%，進(jìn)一步研究表明其發(fā)酵液對(duì)AFB1有降解作用且脫毒反應(yīng)可能是通過蛋白質(zhì)作用，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了該菌處理毒素后毒性降低。表2總結(jié)了對(duì)AFB1有脫毒功能的微生物，包括吸附和降解兩種機(jī)制。

表2 微生物對(duì)AFB1的脫毒情況Table 2 Microorganisms for the detoxification of AFB1

圖9 毒素產(chǎn)生真菌對(duì)AFB1的降解途徑[62]Fig. 9 Degradation pathway of AFB1 by toxin-producing fungi[62]

真菌不僅能產(chǎn)生毒素，而且能夠降解毒素（圖9）。Nakazato等[62]報(bào)道了4 種真菌菌株對(duì)AFB1的降解途徑，黑曲霉（Aspergillus niger）、草根霉（Eurotium herbariorum）、根霉屬（Rhizopus spp.）和產(chǎn)生非AFT的黃曲霉（Aspergillus flavus）通過還原AFB1的環(huán)戊烯酮羰基，可以將AFB1轉(zhuǎn)化為AFL-A，然后產(chǎn)生有機(jī)酸將其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為AFL-B，并且AFL-A和AFL-B之間可以相互轉(zhuǎn)換。黑曲霉能夠?qū)FL轉(zhuǎn)化為AFB1，進(jìn)一步轉(zhuǎn)換為AFB2a。另外，他們發(fā)現(xiàn)AFB1和AFL的含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，其降解率為98.6%，并提出兩種化合物都被代謝成其他未知物質(zhì)，這有待于進(jìn)一步研究。表3總結(jié)了對(duì)AFB1有降解功能的脫毒酶，包括氧化酶、過氧化酶、還原酶等。

表3 脫毒酶對(duì)AFB1的降解情況Table 3 Degradation of AFB1 by detoxification enzymes

4 結(jié) 語(yǔ)

本文主要總結(jié)了AFB1的毒性機(jī)理和微生物脫毒方法的研究概況。脫毒方法是預(yù)防AFB1污染的后期控制方法。利用微生物菌體本身或其產(chǎn)生的脫毒酶對(duì)AFB1有效脫毒來消除其危害是目前解決AFB1污染的有效途徑和研究熱點(diǎn)，近年來取得了一定的研究成果。目前的研究主要針對(duì)降解AFT菌株的篩選、鑒定和脫毒條件的優(yōu)化，但對(duì)脫毒物質(zhì)的分離、純化、降解產(chǎn)物的獲得以及其毒理學(xué)研究相對(duì)較少。AFT雖能被不同的菌株所降解，但存在菌株脫毒作用周期長(zhǎng)、功能不穩(wěn)定等問題。對(duì)AFT降解酶相關(guān)序列的研究較廣泛，但其產(chǎn)量、活性和穩(wěn)定性均不盡人意。結(jié)合目前脫毒研究存在的問題、當(dāng)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展和對(duì)未來有效防控AFT污染手段的研究，提出幾點(diǎn)展望。

4.1 抑制產(chǎn)毒菌株生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)的分離純化及其功能基因的獲得

利用微生物競(jìng)爭(zhēng)來控制AFB1的污染是預(yù)防毒素危害的前期控制方法，其原理是通過與AFB1產(chǎn)毒菌爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和空間等作用來抑制其生長(zhǎng)，從而降低毒素的產(chǎn)生。目前對(duì)于抑制產(chǎn)毒菌株生長(zhǎng)的拮抗微生物研究廣泛。左瑞雨等[63]發(fā)現(xiàn)乳酸菌和枯草芽孢桿菌與黃曲霉共培養(yǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生某種化學(xué)物質(zhì)，對(duì)黃曲霉菌絲的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。龔慶偉[64]對(duì)芽孢桿菌的抗菌物質(zhì)進(jìn)行分離、純化，發(fā)現(xiàn)了抗菌脂肽bacillomycin D，其屬于Iturin家族，是枯草芽孢桿菌依靠非核糖體合成途徑產(chǎn)生的減少AFB1的較強(qiáng)抗生素，對(duì)黃曲霉菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)都具有明顯的抑制作用。Wang Kai等[65]獲得的JPP1菌株產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶能降解黃曲霉的細(xì)胞壁，其抑制參與AFT基因簇的aflR、aflC（pksL1）和aflO（dmtA）基因的轉(zhuǎn)錄。通過目視瓊脂平板實(shí)驗(yàn)和尖端培養(yǎng)方法，JPP1菌株抗真菌率大于95%，抗真菌毒素發(fā)生率大于98%，抑菌效果明顯，可用于植物病原真菌和AFT的生物防治。

不產(chǎn)毒霉菌對(duì)產(chǎn)毒菌株同樣有抑菌作用。魏丹丹[66]研究了不產(chǎn)毒黃曲霉菌對(duì)產(chǎn)毒菌產(chǎn)毒的抑制效果，發(fā)現(xiàn)黃曲霉菌不產(chǎn)毒與2 個(gè)基因（aflR和nor-1）的表達(dá)顯著下調(diào)相關(guān)；且抑制效果的差異可能與產(chǎn)毒菌對(duì)谷物的侵染能力、菌核類型、競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和空間的能力有關(guān)。其研究主要針對(duì)幾種具有抑菌作用的微生物，而抑菌物質(zhì)的分離純化和抑菌蛋白功能基因序列的獲得仍然是今后研究的主要方向。

4.2 利用基因工程手段獲得雙價(jià)或多價(jià)酶產(chǎn)品或工程菌，實(shí)現(xiàn)對(duì)AFB1前后期有效防控

目前已經(jīng)獲得了一些能有效降解AFB1的脫毒酶的核酸序列，在今后的研究中可以通過有效的基因修飾手段和高效的分離純化工藝，利用基因工程的手段實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，有效實(shí)現(xiàn)AFB1的后期控制。為更好地預(yù)防AFB1的污染，必須做好AFB1產(chǎn)生前后的有效防護(hù)，因此，需要找到能夠有效抑制產(chǎn)毒菌株生長(zhǎng)的抑菌劑，而抑菌蛋白的分離純化及其核酸序列的獲得能有效解決這一問題。功能蛋白/肽的獲得提高了脫毒作用的穩(wěn)定性，避免了運(yùn)用整個(gè)微生物的功能不穩(wěn)定問題。目前已經(jīng)有大量研究從植物、動(dòng)物和微生物中提取具有抗真菌活性的蛋白，利用基因工程的手段大量生產(chǎn)抑菌蛋白，其在預(yù)防植物病原菌侵害方面的作用明顯[67-68]。因此，毒素降解蛋白和抑制產(chǎn)毒菌蛋白序列的獲得為今后進(jìn)行兩個(gè)或多個(gè)功能基因融合表達(dá)載體的構(gòu)建提供了依據(jù)，從而可能實(shí)現(xiàn)雙價(jià)效益，從根本上消除毒素危害。

4.3 利用分子生物學(xué)手段對(duì)產(chǎn)毒基因進(jìn)行修飾和改造，培育出不產(chǎn)毒的轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)品

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)、敲除產(chǎn)毒基因或阻止產(chǎn)毒基因正常表達(dá)等手段培育出不產(chǎn)毒的轉(zhuǎn)基因作物成為田間的優(yōu)勢(shì)品種，也是一種非常具有潛力的生物防治途徑。

AFT生物合成過程中至少存在25 步酶促反應(yīng)，aflR、aflC、aflS等是AFT生物合成途徑的相關(guān)基因[28]。Thakare等利用寄主誘導(dǎo)的基因沉默的方法將AFT合成基因aflC的RNAi載體轉(zhuǎn)染到玉米中，生產(chǎn)出不被AFT污染的轉(zhuǎn)基因玉米[69]。采用基因工程技術(shù)制成可抑制或阻斷毒素合成基因正常表達(dá)的特效制劑，是防治AFB1的一種新型、高效的手段。另外，了解黃曲霉中次級(jí)代謝的信號(hào)分子以及調(diào)控、修飾因子，有助于了解AFT阻斷劑的新靶點(diǎn)，為開發(fā)新脫毒方法提供思路。Yang Kunlong等[70]系統(tǒng)地研究了高親和力的cAMP磷酸二酯酶H（phosphodiesterases H，PdeH）在調(diào)節(jié)黃曲霉生命活動(dòng)中起的重要作用，發(fā)現(xiàn)PdeH顯著影響黃曲霉的生長(zhǎng)、發(fā)育和AFT的生物合成，并證明了AFT信號(hào)分子與毒素合成的關(guān)系。隨后，Yao Guangshan等[71]獲得了黃曲霉中的所有APSES轉(zhuǎn)錄因子，其中，AfRafA和AfStuA是影響分生孢子和菌核的發(fā)育、植物種子定植、AFT基因簇表達(dá)和毒素合成所必需的轉(zhuǎn)錄因子，因此，其可作為植物育種或開發(fā)殺菌劑的潛在新靶點(diǎn)。Ren Silin等[72]揭示了賴氨酸琥珀?；谡{(diào)節(jié)黃曲霉代謝和AFT生物合成中的廣泛作用。因此，對(duì)AFT合成過程中酶的琥珀?；稽c(diǎn)的修飾將會(huì)是脫毒的創(chuàng)新方法。

利用生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程的手段對(duì)微生物或基因進(jìn)行篩選及改造，并獲得高效表達(dá)的AFT脫毒酶產(chǎn)品、不產(chǎn)毒菌株并結(jié)合遺傳育種生產(chǎn)無毒糧食，實(shí)現(xiàn)脫毒技術(shù)產(chǎn)業(yè)化和規(guī)?；?，能夠造福食品安全事業(yè)。另外，解決微生物法脫除霉菌毒素過程中周期普遍較長(zhǎng)、在復(fù)雜環(huán)境下脫除能力不穩(wěn)定等問題，生物脫毒技術(shù)將會(huì)具有更重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。