殼聚糖復(fù)合保鮮對草魚肌肉蛋白質(zhì)變化的影響

陳 賽，劉永樂，俞 健，李向紅，黃軼群，王建輝，王發(fā)祥*

（長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院，湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410114）

草魚（Ctenopharyngodon idellus）是我國“四大家魚”之一，在我國各地均有分布，其肉質(zhì)鮮美、價(jià)格實(shí)惠，是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類，2017年全國養(yǎng)殖產(chǎn)量為534.56萬 t，居淡水魚之首[1]。然而，草魚肉水分含量高、組織蛋白酶活性高，保鮮難度較大，宰后貯藏過程中極易腐敗，資源浪費(fèi)嚴(yán)重[2]。目前，國內(nèi)外研究淡水魚保鮮技術(shù)的報(bào)道[3-8]較多，新的保鮮方法也層出不窮，但仍無法突破冷藏過程中魚肉鮮度迅速下降和貨架期短的瓶頸。深入研究保鮮處理對宰后貯藏過程中魚肉品質(zhì)和生理變化的影響，有助于揭示魚肉腐敗機(jī)制和針對性制定魚肉保鮮策略。

關(guān)于魚肉的腐敗變質(zhì)，目前普遍認(rèn)為是由內(nèi)源酶催化引起的肌肉組織內(nèi)部生理生化變化和微生物的生長繁殖共同作用引起的[9]，在此過程中，魚肉發(fā)生蛋白質(zhì)降解、脂肪酸敗和糖類發(fā)酵。在前期研究中，本課題組通過冷殺菌、復(fù)合涂膜等技術(shù)將草魚肉冷藏貨架期（以二級(jí)鮮度為限）延長至10～12 d[10]，但冷藏期間魚肉軟化、汁液流失問題仍然十分嚴(yán)重，表明冷藏過程中肌肉蛋白質(zhì)的變性、降解等變化是草魚品質(zhì)下降的一個(gè)重要原因。草魚肌肉中蛋白質(zhì)是其肌肉組織的最重要組成部分，其含量和完整性（分子質(zhì)量分布）都與魚肉的質(zhì)構(gòu)、彈性、持水力等品質(zhì)指標(biāo)密切相關(guān)[11-12]。目前，國內(nèi)外對淡水魚的冷藏保鮮研究基本都是對魚肉鮮度等綜合品質(zhì)進(jìn)行評價(jià)[4-8]，對于魚肉蛋白質(zhì)在貯藏過程中的變化研究也多集中在其變性、降解和氧化規(guī)律，而鮮有單純從蛋白質(zhì)視角對比分析保鮮和未保鮮處理魚肉在冷藏過程中蛋白質(zhì)變化規(guī)律的研究報(bào)道。

本研究以新鮮草魚為對象，利用前期實(shí)驗(yàn)篩選到的最優(yōu)復(fù)合保鮮劑（10 mg/mL殼聚糖＋5 mg/mL茶多酚＋2 000 U/mL溶菌酶）對草魚片進(jìn)行保鮮處理，分析冷藏過程中保鮮組肌肉蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分布、活性巰基含量、表面疏水性等基本性質(zhì)與未保鮮對照組的差異，為揭示肌肉蛋白質(zhì)變化與魚肉品質(zhì)下降的關(guān)系補(bǔ)充新的生物學(xué)證據(jù)，也為更有效的保鮮方法及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮草魚購于長沙本地菜市場，每尾質(zhì)量為（1.5±0.2）kg。

殼聚糖（生化試劑）、茶多酚（生化試劑） 上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司；溶菌酶（活力≥20 000 U/mg）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；巰基含量測定試劑盒南京建成生物工程研究所；蛋白Marker 美國Thermo Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；UV 2000紫外分光光度計(jì) 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；5430R型高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；T10 basic手持式均質(zhì)機(jī) 德國IKA公司；DYY-12型電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 魚肉樣品制備

新鮮草魚于4 ℃水中暫養(yǎng)1～2 h，致死后去頭、尾、鱗和內(nèi)臟，以預(yù)冷的無菌水清洗干凈后剔除魚骨并切成魚片（5.0 cm×3.0 cm×0.2 cm）。分別用無菌水（對照組）和復(fù)合保鮮劑（10 mg/mL殼聚糖＋5 mg/mL茶多酚＋2 000 U/mL溶菌酶）浸泡10 min，瀝水3 min后用自封袋包裝，置于4 ℃ 冰箱中保藏。樣品分別于第0、3、6、9、12天取出，測定其蛋白質(zhì)相關(guān)指標(biāo)。

1.3.2 揮發(fā)性鹽基氮含量測定

揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量參考GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中半微量定氮法測定。

1.3.3 草魚肌肉蛋白的提取

將魚肉樣品取出后絞碎，準(zhǔn)確稱取約10 g，加入100 mL 20 g/L的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液，均質(zhì)30 s后于25 ℃水浴浸提30 min，8 000 r/min離心10 min，收集上清液即為肌肉總蛋白質(zhì)提取液，備用。

1.3.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

準(zhǔn)確吸取1.3.3節(jié)中蛋白質(zhì)提取液0.2 mL于1.5 mL EP管中，加入等體積的2×上樣緩沖液（每10 mL含2.5 mL 0.5 mol/L Tris-HCl、2.0 mL甘油、4.0 mL 10 g/100 mL SDS、0.5 mL 0.1 g/100 mL溴酚藍(lán)、1.0 mL?β-巰基乙醇），沸水浴5 min，12 000 r/min離心3 min，所得上清液即為待電泳分析樣品，參考李強(qiáng)等[13]的方法，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的分離膠進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分析。

1.3.5 高效液相體積排阻色譜分析

將1.3.3節(jié)中制備的蛋白質(zhì)提取液進(jìn)行真空冷凍干燥，得草魚肌肉蛋白質(zhì)凍干粉。稱取蛋白質(zhì)凍干粉，配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的蛋白液溶液，8 000 r/min離心20 min，上清液用0.45 μm的微孔過濾膜過濾，參考Liu Yongle等[14]的方法，采用高效液相體積排阻色譜（size-exclusion chromatograghy-high performance liquid chromatograghy，SEC-HPLC）法測定其分子質(zhì)量分布；同時(shí)以甲狀腺球蛋白（669 kDa）、醛縮酶A（158 kDa）、牛血清白蛋白（67 kDa）、卵清白蛋白（43 kDa）、辣根過氧化物酶（40.2 kDa）、腺苷酸激酶（32 kDa） 、肌紅蛋白（17 kDa）、核糖核酸酶（13.7 kDa）、抑肽酶（6.5 kDa）和VB12（1.35 kDa）為標(biāo)準(zhǔn)品，同樣條件下進(jìn)行SEC-HPLC分析，根據(jù)保留時(shí)間和分子質(zhì)量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（回歸方程y=-0.570 6x＋10.596）估算樣品中蛋白質(zhì)峰的分子質(zhì)量，將保留時(shí)間換算成分子質(zhì)量的對數(shù)（lg Mw），重新繪制SEC-HPLC譜圖。

1.3.6 活性巰基含量的測定

準(zhǔn)確稱取350 mg 1.3.5節(jié)制備的草魚肌肉蛋白質(zhì)凍干粉，定容至50 mL，參考巰基含量測定試劑盒說明書測定其活性巰基含量。

1.3.7 表面疏水性的測定

稱取1.3.5節(jié)制備的草魚肌肉蛋白質(zhì)凍干粉，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，12 000 r/min離心10 min，上清液用0.45 μm的微孔過濾膜過濾后備用。參考曾茂茂等[15]的方法，采用反相高效液相色譜法進(jìn)行分析，以15 min之后的峰面積與總峰面積的比值作為疏水性指數(shù)，其值越大代表樣品的表面疏水性越強(qiáng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3～5 個(gè)平行，采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 9.0軟件作圖；SDS-PAGE圖譜采用Gel-Pro Analyzer軟件輔助分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖復(fù)合保鮮對草魚肉冷藏過程中TVB-N含量的影響

圖1 草魚冷藏過程中TVB-N含量的變化Fig. 1 Change in TVB-N content of grass carp muscle proteins during cold storage

TVB-N是指肉類食品腐敗過程中蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生的氨（NH3）和胺（R-CH2NH4）等堿性含氮物質(zhì)的統(tǒng)稱，其含量越高則表明蛋白質(zhì)分解越嚴(yán)重，間接地反映了魚肉品質(zhì)的變化，是評價(jià)魚肉品質(zhì)的重要鮮度指標(biāo)[16-17]。由圖1可知，冷藏過程中魚肉中TVB-N含量呈逐漸上升趨勢，冷藏前6 d，TVB-N含量上升緩慢，且保鮮組和對照組無明顯差異。冷藏6 d后，對照組TVB-N含量急劇上升，第12天時(shí)已達(dá)到38.09 mg/l00 g，與貯藏初期相比增加了382%；保鮮組TVB-N含量上升稍緩，第12天時(shí)僅為11.82 mg/l00 g，仍在二級(jí)鮮度范圍[16]（不超過20 mg/100 g），這與李凱風(fēng)等[18]研究涂膜劑對鯽魚冷藏過程中TVB-N含量變化的結(jié)果相似。TVB-N主要是在酶和微生物的作用下產(chǎn)生，楊勝平等[19]研究發(fā)現(xiàn)帶魚冷藏過程中TVB-N含量變化與菌落總數(shù)變化有很好的相關(guān)性，而復(fù)合保鮮劑中的殼聚糖、茶多酚、溶菌酶均具有良好的抑菌性[20-23]，從而能有效抑制微生物對蛋白質(zhì)的分解，減緩TVB-N含量的增加。

2.2 殼聚糖復(fù)合保鮮對草魚肉冷藏過程中蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜的影響

圖2 冷藏過程中草魚肌肉總蛋白SDS-PAGE圖譜Fig. 2 SDS-PAGE pattern of total muscle proteins in grass carp during cold storage

如圖2所示，圖譜上第0天的泳道中清晰可辨的蛋白條帶有20～30 條，其中MHC、肌動(dòng)蛋白以及3 種MLC條帶均較為明顯，與李強(qiáng)等[13]的研究結(jié)果一致。冷藏前6 d，各泳道蛋白條帶分布基本相似，保鮮組與對照組也未見明顯差異。冷藏超過6 d后，SDS-PAGE圖譜開始出現(xiàn)明顯變化，保鮮組與對照組可分辨出明顯差異：對照組MHC粗條帶信號(hào)明顯降低，伴隨著分子質(zhì)量約130、55～72、18～22 kDa蛋白條帶信號(hào)的增加，說明大分子蛋白逐漸被降解成小分子蛋白質(zhì)；而保鮮組蛋白條帶變化也有相同趨勢，但程度明顯較輕；對照組樣品的3 條MLC條帶基本消失，但保鮮組中這些條帶仍清晰可辨，說明保鮮延緩了其降解，這與鄭紅等[24]的研究結(jié)果相似。此外，對照組樣品在第9天新增了一條約20 kDa和一條約37 kDa的蛋白條帶（圖2中箭頭所示），但保鮮組中該20 kDa條帶在第12天才可分辨，而37 kDa條帶直到第12天仍未發(fā)現(xiàn)。上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了冷藏過程中草魚肌肉蛋白逐步降解的事實(shí)，而殼聚糖復(fù)合保鮮能有效降低肌肉中特定蛋白質(zhì)的降解速率。Delbarre-Ladrat等[25]認(rèn)為魚體解僵與自溶期的蛋白質(zhì)分解和內(nèi)源酶的作用有關(guān)；Yu Dawei等[26]以20 mg/mL殼聚糖處理草魚片，發(fā)現(xiàn)冷藏組樣品的組織蛋白酶B與B＋L活力分別降至初始值的58%與65%，蛋白水解和魚片軟化程度也相應(yīng)降低。因此，殼聚糖復(fù)合保鮮延緩草魚肌肉蛋白質(zhì)的降解，除了其抑菌作用外，也可能與其抑制酶活力有關(guān)。

2.3 殼聚糖復(fù)合保鮮對草魚肉冷藏過程中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布的影響

SEC-HPLC是測定聚合物結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量分布最有效的手段之一，可以通過譜圖對試樣之間分子質(zhì)量分布進(jìn)行直觀比較。如圖3所示，新鮮草魚肌肉蛋白質(zhì)（0 d）在SEC-HPLC圖譜中有3 個(gè)主要的洗脫峰，其中峰1、峰2對應(yīng)組分的分子質(zhì)量分別約為5、40 kDa，峰3對應(yīng)組分的分子質(zhì)量大于1 000 kDa（色譜柱洗脫極限），說明一部分蛋白質(zhì)分子以超大聚集體的形式存在。冷藏前6 d，保鮮組和對照組的圖譜變化均不明顯，這與SDS-PAGE分析的結(jié)果相符；冷藏第9天，對照組的峰3面積明顯變小，至第12天時(shí)幾乎完全消失，表明原有蛋白質(zhì)聚集體逐漸解體，可能與冷藏過程中肌肉蛋白質(zhì)的不斷氧化、降解有關(guān)；然而，保鮮組峰3的變化明顯滯后很多，冷藏第12天時(shí)峰面積占比仍為37.35%，較第0天（39.60%）僅下降了5.68%，表明殼聚糖復(fù)合保鮮延緩肌肉蛋白質(zhì)變化的作用非常明顯。此外，隨著冷藏時(shí)間的延長，對照組峰1的面積比也在不斷增加，至第12天時(shí)已增加至31.95%，比第0天（18.68%）增加了71.03%，而保鮮組在12 d內(nèi)幾乎無明顯變化，這進(jìn)一步證實(shí)了殼聚糖復(fù)合保鮮抑制魚肉蛋白質(zhì)降解的作用。

圖3 冷藏過程中草魚肌肉蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布變化Fig. 3 Molecular mass distribution of muscle proteins in grass carp at different cold storage times

2.4 殼聚糖復(fù)合保鮮對草魚肉冷藏過程中活性巰基含量的影響

圖4 冷藏過程中草魚肌肉蛋白活性巰基含量變化Fig. 4 Changes in active sulfhydryl group content in muscle proteins of grass carp during cold storage

巰基是蛋白質(zhì)分子中最具反應(yīng)活性的功能基團(tuán)之一，其含量的變化一定程度上反映了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化[27-28]。如圖4所示，冷藏過程中草魚肌球蛋白活性巰基含量呈逐漸下降趨勢，表明草魚肌肉蛋白質(zhì)總體上在不斷變化，可能是游離巰基氧化生成二硫鍵，這與Lu Han等[29]的研究結(jié)果一致。相對于對照組，保鮮組活性巰基含量的下降趨勢比較平緩，冷藏9 d兩組差異尤為明顯；冷藏第12天時(shí)，對照組活性巰基含量較第0天下降了21.39%，而保鮮組僅下降了9.89%。Ramirez等[30]報(bào)道抗氧化劑可與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而減緩蛋白質(zhì)的降解和氧化；而茶多酚具有抗氧化作用，將多酚化合物與殼聚糖混合使用能有效提升殼聚糖的抗氧化活性[31]。因此，殼聚糖復(fù)合保鮮能有效減緩肌肉蛋白質(zhì)的氧化等不利變化。

2.5 殼聚糖復(fù)合保鮮對草魚肉冷藏過程中表面疏水性的影響

圖5 冷藏過程中草魚肌肉蛋白表面疏水性變化Fig. 5 Changes in surface hydrophobicity of muscle proteins in grass carp during cold storage

蛋白質(zhì)表面疏水性與蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)密切相關(guān)，可反映蛋白質(zhì)的變性程度，表面疏水性增加表明蛋白的變性程度增加[32-33]。如圖5所示，隨冷藏時(shí)間的延長，保鮮組和對照組草魚肌肉蛋白質(zhì)的疏水性指數(shù)均呈現(xiàn)先增后降低的趨勢，表明冷藏前期表面疏水性逐漸增加，冷藏過程中蛋白質(zhì)變性伸展，埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露[13]；冷藏后期表面疏水性逐漸下降，可能與蛋白質(zhì)的過度變性、降解、氧化重折疊和聚合等變化有關(guān)[34]。上述變化規(guī)律與Benjakul等[35]的研究結(jié)果基本一致。盡管保鮮組和對照組草魚肌肉蛋白質(zhì)表面疏水性的變化趨勢一致，但保鮮組的變化幅度明顯較小，表明其蛋白質(zhì)氧化、變性程度相對較小，說明殼聚糖復(fù)合保鮮能使冷藏過程中草魚肌肉蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)維持相對穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

冷藏過程中草魚肌肉蛋白質(zhì)逐漸發(fā)生變性、氧化和降解等變化，但殼聚糖復(fù)合保鮮處理能明顯減緩其變化程度，在冷藏6 d后對抑制TVB-N含量升高、魚肉蛋白降解、活性巰基含量下降、表面疏水性變化等蛋白質(zhì)相關(guān)指標(biāo)變化的作用尤為明顯。保鮮能在一定程度上延長魚肉的貨架期，但其對草魚肌肉蛋白質(zhì)變化的影響尚缺乏深入探討，本研究為殼聚糖復(fù)合保鮮劑能通過延緩冷藏過程中草魚肌肉蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)變化發(fā)揮魚肉保鮮作用提供了證據(jù)，也為今后根據(jù)蛋白質(zhì)理化特征開發(fā)更有效的保鮮技術(shù)提供了理論依據(jù)。