甲醇芽孢桿菌凝乳酶對(duì)馬蘇里拉干酪加工特性的影響

李 柳，鄭 喆，趙 笑，吳鳳玉，楊貞耐*

（北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048）

干酪是以乳為原料，加入適量發(fā)酵劑和凝乳酶，經(jīng)凝乳并分離乳清而制得的乳制品，除了含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪等有機(jī)成分外，還具有降低血清膽固醇、預(yù)防心血管疾病、維持腸道菌群的平衡和穩(wěn)定、防止腹瀉和便泌等生理功能[1]。馬蘇里拉干酪源于意大利[2]，隨著披薩的流行而聞名于世，制作中的熱燙拉伸工序賦予了馬蘇里拉干酪特有的纖維狀結(jié)構(gòu)，使其具有良好的融化性和拉伸性[3]。

微生物凝乳酶在干酪中應(yīng)用前景廣闊，普遍具有高凝乳活性和高蛋白水解活性[4-8]。干酪在成熟過程中會(huì)發(fā)生一系列生化反應(yīng)，主要包括蛋白質(zhì)水解、脂肪水解和糖酵解等[9]，其中，蛋白質(zhì)水解可以通過釋放氨基酸和肽產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)[10]，并通過NH3的生成影響pH值和微生物數(shù)量[11]。這有利于形成豐富的風(fēng)味物質(zhì)，但會(huì)因蛋白過度水解而形成苦味肽，影響干酪的品質(zhì)和口感。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過甲醇芽孢桿菌（Bacillus methanolicus）獲得了凝乳酶，經(jīng)測(cè)定其凝乳活力為5.97×105SU/g、蛋白水解活力為9.47×103U/g[12]，與商品酶（凝乳活力3.60×105SU/g、蛋白水解活力1.21×103U/g）有較大差異。為了探究該凝乳酶是否具有代替商品酶或部分代替商品酶應(yīng)用于馬蘇里拉干酪中的潛力，本研究前期預(yù)實(shí)驗(yàn)以商品酶作為對(duì)照，比較了不同組別（甲醇芽孢桿菌凝乳酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%）混合凝乳酶的凝乳活力和蛋白水解活力，最終選擇蛋白水解活力相對(duì)較低的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%甲醇芽孢桿菌凝乳酶、商品凝乳酶混合酶（凝乳活力4.34×105SU/g、蛋白水解活力3.42×103U/g）制作馬蘇里拉干酪，并對(duì)不同組別干酪成熟過程中的理化特性、蛋白水解、質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味特性和感官指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮生牛乳 北京半截河奶牛場(chǎng)；發(fā)酵劑（乳酸乳球菌） 法國(guó)丹尼斯克公司；商品凝乳酶 科漢森有限公司；牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸鎂、酵母提取物、葡萄糖、氯化鈉、檸檬酸鈉、瓊脂 北京半夏生物科技有限公司；甲醇芽孢桿菌凝乳酶由北京工商大學(xué)乳制品實(shí)驗(yàn)室分離提取。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(jī) 北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；超低溫冰柜 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；TexturePro CTV1.8 Build31質(zhì)構(gòu)儀 美國(guó)Brookfield公司；T25 Ultra-Turrax勻漿器 德國(guó)IKA公司；U-3900紫外分光光度計(jì)、CR21Ⅲ高速冷凍離心機(jī)、S-480掃描電子顯微鏡 日本日立公司；Kjeltec8100凱氏定氮儀丹麥FOSS公司；7890A-7000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用美國(guó)Agilent公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本島津公司；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；API3200 HPLC-四極桿-離子阱-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)AB公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 馬蘇里拉干酪的制作工藝流程

在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別使用甲醇芽孢桿菌凝乳酶、混合酶制劑（質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%甲醇芽孢桿菌凝乳酶和90%商品凝乳酶）制作的馬蘇里拉干酪作為實(shí)驗(yàn)組，以商品凝乳酶制作的干酪作為對(duì)照組。

1.3.2 理化指標(biāo)的測(cè)定

在制作馬蘇里拉干酪的過程中，準(zhǔn)確稱取并記錄原料乳、發(fā)酵劑、NaCl和干酪成品的質(zhì)量，干酪得率按下式計(jì)算。

根據(jù)GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》測(cè)定干酪水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)；根據(jù)AOAC 920.123（2001）凱氏定氮（Kjeldahl）法測(cè)定干酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)；脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用R?se-Gottlieb法；根據(jù)AOAC 975.20（2001）銀量（Volhard）法測(cè)定干酪中NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 成熟過程中pH值的測(cè)定

分別取馬蘇里拉干酪樣品10 g，加入12 mL 50 ℃溫浴的蒸餾水中，用Ultra-Turrax勻漿器處理1 min將樣品充分勻漿，放置在50 ℃水浴中保溫30 min后于5 000×g、20 ℃離心15 min，倒掉脂肪層，取下層溶液使用pH計(jì)測(cè)定pH值。

1.3.4 成熟過程中乳酸乳球菌數(shù)量的測(cè)定

分別在干酪成熟0、1、2、3、4 周時(shí)采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定樣品中的活菌數(shù)。取11 g樣品加入40 ℃的100 mL 0.02g/mL檸檬酸鈉溶液中，用Ultra-Turrax勻漿器處理2 min將樣品充分勻漿，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水逐級(jí)稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的體積。準(zhǔn)確吸取50 μL稀釋后樣品涂布于M17瓊脂平板上，培養(yǎng)2～3 d后對(duì)乳酸乳球菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.5 蛋白水解特性分析

1.3.5.1 pH 4.6時(shí)可溶性蛋白的HPLC分析

樣品處理：分別取干酪樣品20 g，加入40 mL 50 ℃溫浴的蒸餾水中充分勻漿，于40 ℃水浴中保溫1 h后3 000×g、20 ℃離心15 min，過濾除去脂肪，用乙酸調(diào)節(jié)至pH 4.6，離心后取上清液冷凍干燥成粉末，備用。

溶液配制：A液：以蒸餾水為溶劑配制體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸溶液；B液：以乙腈為溶劑配制體積分?jǐn)?shù)0.1%的三氟乙酸溶液。以A液為溶劑，將上述樣品配制成10 mg/mL溶液，經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾后于HPLC進(jìn)樣。進(jìn)樣量為50 μL，流速為0.75 mL/min，柱溫為45 ℃。

洗脫程序：55 min內(nèi)B液由0%（體積分?jǐn)?shù)，下同）升至45%；45% B液維持6 min；3 min內(nèi)B液由45%上升至54%；1 min內(nèi)B液由54%上升至85%；85% B液沖洗10 min；1 min內(nèi)B液由85%下降至0%；A液沖洗15 min。全程共91 min，洗脫峰在214 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)。以峰面積表示可溶性蛋白的水解程度。

1.3.5.2 酪蛋白水解分析

尿素緩沖液：將7.5 g Tris和480 g尿素加入20 mL巰基乙醇定容至1 L，調(diào)節(jié)至pH 7.6。

上樣緩沖液：將7.5 g Tris、480 g尿素和痕量溴酚藍(lán)加入10 mL巰基乙醇定容至1 L，調(diào)節(jié)至pH 7.6。

電極緩沖液：將15 g Tris和73 g甘氨酸加入5 L去離子水充分溶解。

樣品制備：分別取干酪樣品1 g磨碎溶于5 mL尿素緩沖液中，在40 ℃水浴中保溫處理30 min，3 000×g、4 ℃離心10 min，量取100 μL上清液與300 μL上樣緩沖液混合，取5 μL上樣，采用尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.5.3 游離氨基酸分析

樣品前處理：稱適量干酪樣品，加6 mL HCl溶液，充氮?dú)獗Ｗo(hù)，密封110 ℃消化21 h，取消化液過水系濾膜，取濾液100 μL，真空干燥后于1 000 μL蒸餾水中復(fù)溶。

衍生化：取混合標(biāo)準(zhǔn)品（氨基酸混合物）和加入50 μL蛋白沉淀劑（含正纈氨酸）的待測(cè)樣品，混勻后13 200 r/min 4 ℃離心4 min，取上清液10 μL，加入50 μL標(biāo)記緩沖液混勻，4 ℃、1 000 r/min離心10 s。再加20 μL衍生液混勻，4 ℃、1 000 r/min離心10 s后置于55 ℃恒溫衍生15 min。衍生后樣品置于冰箱冷卻后混勻，4 ℃、1 000 r/min離心10 s，取50 μL采用HPLC-四極桿-離子阱-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品定性，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

HPLC條件：色譜柱：MSLab50AA-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫：50 ℃，流速：1 mL/min，流動(dòng)相A：水（含體積分?jǐn)?shù)1‰甲酸），流動(dòng)相B：乙腈（含體積分?jǐn)?shù)1‰甲酸），進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，噴霧電壓5 500 V，霧化氣壓力3.45×105Pa，輔助氣壓力4.14×105Pa，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，碰撞氣CAD參數(shù)設(shè)置為中等，霧化溫度500 ℃，氣簾氣壓力1.38×105Pa，碰撞室射出電壓2.0 V，射入電壓10 V。

1.3.6 質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定

將干酪樣品切成1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm的小塊，在室溫（25 ℃）下平衡30 min后用質(zhì)構(gòu)分析儀對(duì)樣品進(jìn)行全質(zhì)地剖面分析。測(cè)試參數(shù)設(shè)定如下：預(yù)測(cè)試速率2.0 mm/s、測(cè)試速率0.4 mm/s、返回速率0.4 mm/s、循環(huán)2 次、數(shù)據(jù)頻率20 點(diǎn)/秒、觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載5 g、壓縮比50%、探頭型號(hào)TA11/1000。每個(gè)樣品至少3 次平行，取平均值。

1.3.7 微觀結(jié)構(gòu)觀察

分別取干酪內(nèi)部樣品，用鋒利的滅菌刀片準(zhǔn)確切割成4～5 mm3的小塊，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%、pH 6.8的戊二醛溶液進(jìn)行固定。將上述樣品置于液氮中冷凍，取出后用刀片切斷橫截面，并用pH 6.8磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，每次約10 min。用乙醇進(jìn)行梯度脫水，每次10～15 min，其中無水乙醇沖洗3 次，其他體積分?jǐn)?shù)各沖洗1 次。用氯仿脫脂2 h，脫脂的同時(shí)間隔振蕩，用叔丁醇置換其中的乙醇，經(jīng)過冷凍干燥后選擇要觀察的面進(jìn)行固定。采用離子濺射的方法鍍金，使用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3.8 風(fēng)味分析

采用固相微萃取的方法對(duì)干酪樣品進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定，稱取10 g樣品，磨碎后加入30 mL萃取瓶中，并加入1 g NaCl和1 μL 0.816 mg/mL庚酮作為內(nèi)標(biāo)，加蓋密封，置于40 ℃水浴鍋中平衡30 min，用固相微萃取頭于40 ℃吸附30 min后插入氣相色譜進(jìn)樣口，250 ℃解吸5 min。

氣相色譜條件：程序升溫：初始溫度為40 ℃，保持3 min；以5 ℃/min升溫到200 ℃，保持0 min；再以10 ℃/min升溫到250 ℃，保持3 min；后運(yùn)行3 min。載氣（He）恒定流速為1.2 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比5∶1。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，掃描范圍m/z 40～250。

經(jīng)過氣相色譜-質(zhì)譜分析后，利用儀器自帶的NIST14質(zhì)譜庫對(duì)干酪中成分進(jìn)行自動(dòng)檢索，通過軟件求出各成分保留指數(shù)，將軟件計(jì)算得到的保留指數(shù)與數(shù)據(jù)庫比對(duì)進(jìn)行定性分析，采用峰面積歸一化法計(jì)算各化學(xué)成分的相對(duì)含量。

1.3.9 干酪的感官評(píng)價(jià)

分別對(duì)成熟4 周的干酪樣品進(jìn)行感官評(píng)定。評(píng)定方法參照RHB 507—2015《披薩用拉絲性干酪感官評(píng)鑒細(xì)則》[13]稍有改動(dòng)，分別對(duì)樣品拉絲性、出油性、風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)、保形性進(jìn)行評(píng)分。其中感官評(píng)鑒人數(shù)為10 人，均經(jīng)過專門培訓(xùn)與考核，具備乳制品方面的專業(yè)知識(shí)，熟悉評(píng)鑒樣品的色、香、味、質(zhì)地、類型、特征、風(fēng)格及檢測(cè)所需要的方法，評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 馬蘇里拉干酪感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of Mozzarella cheese

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)樣品至少測(cè)定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 干酪理化特性的比較

表2 干酪理化特性分析Table 2 Physicochemical properties of cheeses

由表2可以看出，實(shí)驗(yàn)組干酪的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和得率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。甲醇芽孢桿菌凝乳酶水解作用強(qiáng)，可能會(huì)在干酪成熟初期產(chǎn)生大量游離水結(jié)合在干酪中，形成較軟的質(zhì)地，使干酪保形性差[14]，但表現(xiàn)為得率提高；水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)還會(huì)影響干酪微觀結(jié)構(gòu)[15]，可通過判斷其微觀結(jié)構(gòu)的差異確定微生物凝乳酶水解作用對(duì)干酪品質(zhì)的影響。3 組干酪的其余理化指標(biāo)整體差異不大，且均在生產(chǎn)要求范圍內(nèi)[16]。

2.2 干酪pH值變化的比較

圖1 干酪成熟過程中pH值變化Fig. 1 Changes in pH during the ripening process of cheeses

在整個(gè)成熟過程中，干酪樣品的pH值均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)（圖1），其原因可能是成熟前期干酪中微生物和殘存凝乳酶會(huì)分解乳糖生成乳酸，分解脂肪生成脂肪酸，從而導(dǎo)致干酪pH值的下降；隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，干酪處于較低pH值的體系中，不利于微生物的分解代謝，且乳糖會(huì)隨著干酪成熟逐漸消耗殆盡，殘余的乳酸會(huì)和蛋白水解出的NH3發(fā)生中和，使得pH值小幅上升[17]。在成熟的第14天，甲醇芽孢桿菌凝乳酶干酪的pH值下降達(dá)到最小值，說明殘余凝乳酶活力對(duì)干酪成熟期間的pH值產(chǎn)生影響，但三者pH值變化均在4.6～5.3范圍內(nèi)。

2.3 干酪中乳酸乳球菌數(shù)量變化的比較

圖2 干酪成熟過程中乳酸乳球菌存活情況Fig. 2 Survival of Lactococcus lactis during the ripening process of cheeses

乳酸乳球菌對(duì)干酪成熟過程中的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味產(chǎn)生影響[18]。干酪樣品中的乳酸乳球菌數(shù)量在干酪成熟期間均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，如圖2所示。在干酪成熟初期，牛乳中大量乳糖被乳酸乳球菌分解用于生長(zhǎng)繁殖，乳酸乳球菌數(shù)量增加。隨著乳糖含量的減少，乳酸乳球菌逐漸死亡或自溶[19]，其死亡后釋放出的各種酶類能夠降解蛋白質(zhì)、脂肪等大分子有機(jī)物，賦予干酪良好的品質(zhì)和風(fēng)味[20]。盡管干酪中乳酸乳球菌數(shù)量均達(dá)到了8.80～9.68（lg（CFU/g）），但在成熟后期，甲醇芽孢桿菌凝乳酶干酪中的乳酸乳球菌數(shù)量要稍低于混合酶干酪和對(duì)照組干酪。整體來看，乳酸乳球菌在干酪成熟過程中能較好地存活，受凝乳酶的影響不大。

2.4 干酪水解特性的比較

2.4.1 pH 4.6時(shí)可溶性蛋白的HPLC分析結(jié)果

圖3 干酪成熟過程中pH 4.6時(shí)可溶性蛋白的HPLC分析Fig. 3 High performance liquid chromatograms of pH 4.6 soluble protein during the ripening process of cheeses

pH 4.6是酪蛋白的等電點(diǎn)，在此條件下干酪中酪蛋白沉淀，其中可溶性蛋白主要是對(duì)干酪成熟過程中蛋白質(zhì)水解出的肽段進(jìn)行分離而獲得的產(chǎn)物，用以表征蛋白水解程度的大小，也是干酪成熟的標(biāo)志[21]。在干酪成熟過程中，添加的大部分凝乳酶會(huì)隨乳清一起排出，殘存在干酪中的凝乳酶會(huì)繼續(xù)水解酪蛋白生成多肽。如圖3所示，甲醇芽孢桿菌凝乳酶干酪在成熟0 周就有明顯的蛋白水解肽生成，這是由于甲醇芽孢桿菌凝乳酶的高蛋白水解活性發(fā)揮了作用；而干酪中的凝乳酶一般要求凝乳活力強(qiáng)，蛋白水解活力弱，否則會(huì)導(dǎo)致干酪得率下降和苦味肽的生成，影響其品質(zhì)。對(duì)照組干酪在成熟前期幾乎沒有蛋白水解肽段的出現(xiàn)，隨著干酪的逐漸成熟，少許肽段才被水解出來，說明商品酶蛋白水解活性低，干酪成熟時(shí)間也相應(yīng)延長(zhǎng)。混合酶干酪與其余兩組相比表現(xiàn)出了適度的蛋白水解活性，水解出的肽還可形成風(fēng)味物質(zhì)[22]。

2.4.2 干酪成熟過程中酪蛋白水解分析結(jié)果

圖4 干酪成熟過程中酪蛋白水解的尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果Fig. 4 Electrophoretic analysis of casein hydrolysis during the ripening process of cheeses

隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)均有一定程度的降解[23]，尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果中表現(xiàn)為蛋白條帶變窄或消失（圖4）。與成熟前相比，甲醇芽孢桿菌凝乳酶干酪成熟4 周后αs1-酪蛋白條帶變窄，β-酪蛋白和κ-酪蛋白條帶消失，說明蛋白質(zhì)降解程度較大；混合酶干酪中β-酪蛋白條帶消失，αs1-酪蛋白和κ-酪蛋白條帶變窄，說明蛋白質(zhì)也發(fā)生了降解；而對(duì)照組各蛋白條帶無明顯變化。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組干酪中添加的甲醇芽孢桿菌凝乳酶導(dǎo)致其蛋白水解程度均高于對(duì)照組。蛋白質(zhì)降解會(huì)生成肽類和氨基酸，過度的降解可能伴隨有苦味肽的生成，影響干酪口感[24]。

2.4.3 游離氨基酸的分析結(jié)果

表3 干酪在成熟期的游離氨基酸組成Table 3 Free amino acid composition of cheeses during ripening

游離氨基酸是由干酪在成熟過程中殘存的凝乳酶水解生成的，是蛋白質(zhì)深度水解的標(biāo)志，可作為產(chǎn)生風(fēng)味的前體物質(zhì)[25]，表3是添加不同凝乳酶的干酪在成熟過程中游離氨基酸含量的變化情況。實(shí)驗(yàn)組甲醇芽孢桿菌凝乳酶干酪中蛋白水解作用強(qiáng)，成熟4 周后甘氨酸、組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸和脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于對(duì)照組和混合酶干酪，且水解形成了特有的磷酸乙醇胺和氨基異丁酸。干酪成熟過程還伴隨著菌體的死亡和自溶，使得肽酶活力增強(qiáng)[26]，說明甲醇芽孢桿菌凝乳酶干酪比混合酶干酪和對(duì)照組干酪具有更強(qiáng)的肽酶活力。有研究表明，游離氨基酸有助于干酪形成獨(dú)特的風(fēng)味，對(duì)干酪的滋味和香味都有促進(jìn)作用[27]。

2.5 干酪質(zhì)構(gòu)特性的比較

圖5 干酪成熟后的質(zhì)構(gòu)特性分析Fig. 5 Texture analysis of ripened cheeses

有研究報(bào)道，αs1-酪蛋白的分解是引起干酪的組織結(jié)構(gòu)和質(zhì)構(gòu)不同的主要原因[28]，圖5A顯示，3 組干酪彈性隨著干酪的成熟均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。干酪成熟后期甲醇芽孢桿菌凝乳酶干酪的彈性最低，其原因可能是由于甲醇芽孢桿菌凝乳酶的蛋白水解作用，使其與對(duì)照組和混合酶干酪相比形成較軟的質(zhì)地，從而導(dǎo)致干酪的硬度下降（圖5B）、黏性增加（圖5C）。內(nèi)聚性（圖5D）是干酪彈性的表現(xiàn)形式，膠著性（圖5E）是干酪黏性的表現(xiàn)形式。新鮮干酪蛋白鏈完整，三維空間網(wǎng)絡(luò)上高度交聯(lián)的蛋白分子表現(xiàn)出較高的抗變形性[2]，因此其內(nèi)聚性和膠著性較高；隨著干酪的不斷成熟，酪蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐漸塌陷，抗變形性下降，使得內(nèi)聚性和膠著性降低。咀嚼性（圖5F）與硬度呈正相關(guān)關(guān)系[29]，因而變化趨勢(shì)也和硬度相似。隨著干酪的成熟，其蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞，使其形成質(zhì)地易碎的結(jié)構(gòu)，咀嚼性下降。甲醇芽孢桿菌凝乳酶干酪中微生物凝乳酶的高蛋白水解活性使其保形性下降，表現(xiàn)為硬度低、黏性大、咀嚼性較差，而混合酶干酪質(zhì)構(gòu)特性與對(duì)照組相似。

2.6 干酪微觀結(jié)構(gòu)的比較

干酪成熟前期，在發(fā)酵劑中的微生物和殘存凝乳酶的共同作用下，蛋白結(jié)構(gòu)形成大小不均一的孔洞，以一個(gè)類似海綿的相對(duì)松散的結(jié)構(gòu)分布在干酪體系中[30]；隨著成熟期的延長(zhǎng)，酪蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐漸塌陷，孔洞被蛋白和脂肪的水解產(chǎn)物所填充，隨著水分的蒸發(fā)，較大的孔洞慢慢消失，凝膠結(jié)構(gòu)變得連續(xù)而緊密[31]。從圖6中可以看出，實(shí)驗(yàn)組甲醇芽孢桿菌凝乳酶干酪在成熟過程中的蛋白水解使得干酪結(jié)構(gòu)完全降解，脂肪球聚集體積較大，孔洞由水分和脂肪球填充，失去了干酪應(yīng)有的結(jié)構(gòu)特性?；旌厦父衫业奈⒂^結(jié)構(gòu)隨著成熟過程逐漸變得緊實(shí)，孔洞變小，說明混合酶的蛋白水解作用沒有破壞干酪應(yīng)有的微觀結(jié)構(gòu)。

圖6 干酪成熟過程中的微觀結(jié)構(gòu)變化（×50）Fig. 6 Microstructure changes of cheeses during ripening (× 50)

2.7 干酪風(fēng)味的比較

表4 干酪成熟后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量Table 4 Relative contents of volatile flavor compounds identified in ripened cheeses

續(xù)表4

由表4可知，添加不同凝乳酶的馬蘇里拉干酪在成熟過程中共產(chǎn)生了32 種風(fēng)味物質(zhì)，包括烷烴類2 種、酸類6 種、酮類6 種、醛類4 種、醇類6 種、脂類3 種、其他化合物5 種，其中相對(duì)含量較高的是酸類、醇類和脂類化合物，這與前人關(guān)于馬蘇里拉干酪中風(fēng)味物質(zhì)的研究結(jié)果[32]吻合。甲醇芽孢桿菌凝乳酶干酪和混合酶干酪在成熟過程中比對(duì)照組干酪多生成了癸酸、十二烷、己酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)，且其他風(fēng)味物質(zhì)含量也普遍高于對(duì)照組，這與甲醇芽孢桿菌凝乳酶具有高蛋白水解活性的研究結(jié)果一致。甲醇芽孢桿菌凝乳酶蛋白水解活力高，使實(shí)驗(yàn)組干酪成熟后pH 4.6時(shí)可溶性蛋白水解程度、游離氨基酸種類和風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量等與水解活性相關(guān)的指標(biāo)均高于對(duì)照組，說明高水解活力促進(jìn)了干酪風(fēng)味的形成，成熟后實(shí)驗(yàn)組干酪的風(fēng)味和口感要好于對(duì)照組，在不生成苦味肽和干酪結(jié)構(gòu)保持完整的前提下，這是甲醇芽孢桿菌凝乳酶代替或部分代替商品酶制作干酪的優(yōu)勢(shì)。

2.8 干酪的感官評(píng)價(jià)結(jié)果

表5 干酪的感官評(píng)定結(jié)果Table 5 Sensory evaluation results of cheese

如表5所示，混合酶干酪各評(píng)定指標(biāo)得分及總分與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05），但甲醇芽孢桿菌凝乳酶干酪除風(fēng)味與其他兩組干酪無顯著差異外，其余指標(biāo)均有顯著差異，且得分及總分均低于對(duì)照組?？傮w來看，甲醇芽孢桿菌凝乳酶能作為商品酶的部分代替品應(yīng)用于馬蘇里拉干酪的生產(chǎn)。

3 結(jié) 論

通過與對(duì)照組干酪相比，對(duì)甲醇芽孢桿菌凝乳酶干酪和混合酶干酪成熟過程中的蛋白水解特性、質(zhì)構(gòu)、微觀結(jié)構(gòu)和風(fēng)味的分析發(fā)現(xiàn)，甲醇芽孢桿菌凝乳酶干酪中因存在的甲醇芽孢桿菌凝乳酶具有高蛋白水解活性，雖然水解生成的肽段和氨基酸賦予了干酪更多的風(fēng)味物質(zhì)，但由此導(dǎo)致干酪結(jié)構(gòu)塌陷、保形性差，與對(duì)照組干酪整體評(píng)分差異顯著（P＜0.05）。而混合酶干酪中存在的部分甲醇芽孢桿菌凝乳酶的蛋白水解不僅形成了豐富的風(fēng)味物質(zhì)，所制成干酪的質(zhì)構(gòu)、微觀結(jié)構(gòu)和整體評(píng)分與對(duì)照組也無顯著差異（P＞0.05）。綜上所述，甲醇芽孢桿菌凝乳酶可以部分代替商品凝乳酶應(yīng)用于干酪的生產(chǎn)中。