超聲及超聲靶向微泡破壞對(duì)表皮葡萄球菌生物膜的破壞作用

胡 健,張 寧,李 盼,何年安,王曉琴*

(1 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,西安 710061;2 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心;3 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科;*通訊作者,E-mail:1493722680@qq.com)

近年來(lái),隨著臨床上各類醫(yī)療植入性假體(如人工瓣膜、人工導(dǎo)管、血管支架或骨關(guān)節(jié)假體等)的廣泛應(yīng)用,伴隨假體植入而并發(fā)的生物膜感染已成為一個(gè)棘手的臨床問(wèn)題。由于生物膜中的細(xì)菌相比浮游生長(zhǎng)的細(xì)菌在生理狀態(tài)、代謝水平及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等諸多方面均存在著明顯的差異,其針對(duì)抗生素及宿主免疫系統(tǒng)的耐受性均顯著提高[1-3]。因此與醫(yī)療植入性假體相關(guān)的生物膜感染常在臨床上形成難治性、持續(xù)性的感染,并最終導(dǎo)致醫(yī)療假體植入的失敗,給患者造成巨大的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

目前有研究表明,低功率的理療級(jí)超聲在對(duì)人體組織不產(chǎn)生任何損傷的同時(shí),可增強(qiáng)多種藥物或生物大分子在組織或細(xì)胞內(nèi)的傳遞效率[4,5]。此外,低功率超聲對(duì)與細(xì)胞結(jié)構(gòu)完全不同的細(xì)菌同樣具有一定的生物學(xué)作用,并可明顯提高多種細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性[6,7]?？咕幬锫?lián)用超聲已成為國(guó)際上治療細(xì)菌生物膜感染的研究重點(diǎn),尤其在口腔醫(yī)學(xué)及關(guān)節(jié)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已有關(guān)于超聲(輔助抗菌藥物)清除細(xì)菌生物膜的研究報(bào)道[8-10]。另外有研究表明，利用一種臨床常用的超聲造影劑“微泡”(microbubble)作為空化核可明顯降低超聲空化作用的閾值，并顯著增強(qiáng)超聲的生物學(xué)效應(yīng)，微泡輔助下的超聲輻照即“超聲靶向微泡破壞”(ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD)比單純超聲能夠顯著提高真核細(xì)胞對(duì)大分子物質(zhì)的攝取效率[11,12]。因此UTMD可能會(huì)對(duì)細(xì)菌及其生物膜產(chǎn)生更強(qiáng)的生物學(xué)效應(yīng)，明顯提高細(xì)菌及其生物膜對(duì)抗生素的敏感性。

本研究利用表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)生物膜作為模型,探討超聲及UTMD對(duì)生物膜可能產(chǎn)生的生物學(xué)作用,以期為利用超聲及UTMD聯(lián)合抗生素治療醫(yī)療植入性假體相關(guān)的生物膜感染提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、主要試劑及儀器

生物膜陽(yáng)性的表皮葡萄球菌菌株,從西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心ICU住院治療的患者體內(nèi)植入的中心靜脈導(dǎo)管中取樣培養(yǎng)分離獲得。細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)板卡購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司;TSB培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)OXOID公司;96孔/6孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)CORNING公司;激光共聚焦專用培養(yǎng)皿購(gòu)自美國(guó)WPI公司;2%結(jié)晶紫染料購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌Live/Dead生存指示試劑盒購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司;萬(wàn)古霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;SonoVue超聲微泡造影劑購(gòu)自瑞士Bracco suisse SA公司。全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司;激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司;Cosmogamma US13超聲波理療儀購(gòu)自意大利愛(ài)美優(yōu)公司。

1.2 表皮葡萄球菌生物膜的培養(yǎng)制備

用一次性使用采樣棒挑取表皮葡萄球菌單克隆菌株,接種于TSB(標(biāo)準(zhǔn)濃度為30 g/L)培養(yǎng)基中,37 ℃,210 r/min,振蕩培養(yǎng)過(guò)夜增菌。將過(guò)夜菌液用TSB培養(yǎng)基1 ∶200稀釋后注入細(xì)胞培養(yǎng)板/皿中,37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)16 h。棄去培養(yǎng)板/皿中的菌液,并用無(wú)菌生理鹽水輕輕沖洗板底3次,以去除沉積但未附著于板底的細(xì)菌。培養(yǎng)板/皿底部附著的膜樣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)即為細(xì)菌生物膜。

1.3 肉眼及光鏡觀察表皮葡萄球菌生物膜形態(tài)

將獲得于96孔/6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的表皮葡萄球菌生物膜自然晾干,甲醇固定10 min,倒掉甲醇,晾干,用2%結(jié)晶紫染色10 min。利用肉眼或在普通光學(xué)顯微鏡觀察表皮葡萄球菌生物膜的形態(tài)。

1.4 激光共聚焦顯微鏡觀察表皮葡萄球菌生物膜形態(tài)

于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿(底部為玻璃材質(zhì))中培養(yǎng)獲得表皮葡萄球菌生物膜,利用含有SYTO9(1 μmol/L)及PI(1 μmol/L)的Live/Dead細(xì)菌生存指示試劑盒對(duì)生物膜進(jìn)行熒光染色,室溫避光孵育30 min。用激光共聚焦顯微鏡觀察表皮葡萄球菌生物膜形成情況。生物膜在激光共聚焦顯微鏡下以0.5 μm步進(jìn)拍攝斷層照片,再經(jīng)三維重建獲得生物膜的三維圖像。

1.5 表皮葡萄球菌及其生物膜藥物敏感性的測(cè)定

挑取過(guò)夜生長(zhǎng)的表皮葡萄球菌單克隆,利用梅里埃VITEK 2 compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀測(cè)定該菌株的抗生素耐藥譜及敏感抗生素的最低抑菌濃度(MIC)。

生物膜對(duì)萬(wàn)古霉素的藥物敏感性利用96孔板抗生素梯度生物膜殺傷試驗(yàn)測(cè)定，方法如下：將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液用TSB培養(yǎng)基1 ∶200稀釋，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)至6 h或12 h，以獲得尚未成熟或已成熟的生物膜樣本。棄去菌液，利用無(wú)菌生理鹽水輕輕沖洗生物膜3次。并將含有系列濃度(200，100，50，25，12.5，6.25，3.13 μg/ml)萬(wàn)古霉素的無(wú)菌TSB培養(yǎng)基加入培養(yǎng)板。繼續(xù)靜置于37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。棄去菌液，無(wú)菌生理鹽水輕柔潤(rùn)洗板底3次后將培養(yǎng)板自然晾干。生物膜利用結(jié)晶紫或Live/Dead試劑盒染色后，分別利用肉眼及激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜是否生長(zhǎng)。如高于某濃度的萬(wàn)古霉素可將已形成的生物膜徹底清除，則該濃度即為最低殺生物膜濃度。

1.6 超聲或UTMD處理表皮葡萄球菌生物膜

在制備好的，附著有表皮葡萄球菌生物膜的培養(yǎng)板/皿中注入適量無(wú)菌TSB或含有特定濃度萬(wàn)古霉素的無(wú)菌TSB；UTMD處理需在此基礎(chǔ)上再加入終濃度為30%(V/V)的超聲造影微泡。于培養(yǎng)板/皿底部涂抹醫(yī)用超聲耦合劑使之與5 cm2的超聲探頭緊密貼合。超聲理療儀的功率設(shè)定為1 W/cm2，占空比50%，輻照時(shí)間10 min。處理后的生物膜于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)靜置培養(yǎng)6 h。生物膜利用結(jié)晶紫或Live/Dead試劑盒染色后，分別利用光鏡或激光共聚焦顯微鏡對(duì)生物膜的形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.7 圖像分析及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

激光共聚焦顯微鏡拍攝得到的生物膜斷層照片集利用Bitplane Imaris 7.0軟件進(jìn)行三維重構(gòu),從而獲得生物膜的立體圖像。生物膜各斷層照片的熒光強(qiáng)度利用ImageJ2X 2.1軟件進(jìn)行定量分析。不同生物膜斷層照片集的平均熒光強(qiáng)度比較利用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 19.0。

2 結(jié)果

2.1 表皮葡萄球菌臨床菌株的藥物敏感性

經(jīng)全自動(dòng)藥敏分析,本研究分離獲得的表皮葡萄球菌臨床菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素、利福平、磺胺甲惡唑等多種抗生素耐藥,對(duì)萬(wàn)古霉素敏感,MIC為1.0 μg/ml。

2.2 表皮葡萄球菌生物膜形成情況

該表皮葡萄球菌經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng),能夠在聚苯乙烯塑料(96孔/6孔細(xì)胞培養(yǎng)板)及玻璃(共聚焦皿)表面形成生物膜。生物膜經(jīng)結(jié)晶紫染色后通過(guò)肉眼和光鏡觀察顯示,其結(jié)構(gòu)較為均一、致密;進(jìn)而利用含SYTO9和PI的Live/Dead染液標(biāo)記生物膜后,經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,生物膜中充斥著大量活細(xì)菌(標(biāo)記為綠色),而死亡細(xì)菌(標(biāo)記為紅色)少見(jiàn),生物膜的厚度約為10-15 μm(見(jiàn)圖1)。

A.于96孔板中培養(yǎng)的生物膜經(jīng)結(jié)晶紫染色后的肉眼下形態(tài);B.生物膜經(jīng)結(jié)晶紫染色后在20倍物鏡下的形態(tài);C.經(jīng)Live/Dead染色后,由激光共聚焦顯微鏡拍攝的生物膜三維立體圖像;綠色熒光標(biāo)識(shí)存活細(xì)菌,紅色熒光標(biāo)識(shí)死亡細(xì)菌圖1 表皮葡萄球菌臨床菌株生物膜的形態(tài)Figure 1 The morphology of the biofilm from the clinical strain of S.epidermidis

2.3 生物膜的藥物敏感性

在體外培養(yǎng)6 h并獲得該臨床菌株未成熟的生物膜樣本后,向培養(yǎng)基中加入萬(wàn)古霉素,并繼續(xù)培養(yǎng)12 h,只有濃度≥12.5 μg/ml(12.5倍MIC)的萬(wàn)古霉素方可完全清除已形成的未成熟生物膜。在體外培養(yǎng)12 h并獲得該菌株成熟的生物膜樣本后,向培養(yǎng)基中加入萬(wàn)古霉素,并繼續(xù)培養(yǎng)12 h,即使?jié)舛葹?00 μg/ml的萬(wàn)古霉素(200倍MIC)仍不能有效清除已形成的生物膜,且激光共聚焦顯微鏡顯示此時(shí)生物膜的形態(tài)與未處理的生物膜無(wú)顯著區(qū)別,生物膜中仍充斥著大量活細(xì)菌(綠色)(見(jiàn)圖2)。提示該菌株成熟的生物膜對(duì)萬(wàn)古霉素高度耐藥。

2.4 理療超聲對(duì)生物膜的影響

利用理療超聲探頭以1 W/cm2功率(占空比50%)的超聲波對(duì)該臨床菌株培養(yǎng)12 h的生物膜處理10 min,可使生物膜的表面形成大量微小穿孔(光鏡下可見(jiàn)),但共聚焦顯微鏡顯示剩余生物膜中仍充斥大量活細(xì)菌。超聲聯(lián)和100 μg/ml萬(wàn)古霉素對(duì)生物膜共同進(jìn)行處理,處理后的生物膜在光鏡下形態(tài)與單用超聲處理無(wú)顯著區(qū)別,然而共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)剩余生物膜中出現(xiàn)了更多的死細(xì)菌(紅色熒光占總熒光比例顯著提高,P<0.01,見(jiàn)圖3,表1)。提示超聲及超聲聯(lián)合萬(wàn)古霉素可對(duì)生物膜造成物理?yè)p傷。此外,超聲聯(lián)合萬(wàn)古霉素雖可殺死少量生物膜中的細(xì)菌,但生物膜中活細(xì)菌數(shù)量依然占優(yōu)勢(shì)。

A.于96孔板中培養(yǎng)的生物膜經(jīng)結(jié)晶紫染色后的肉眼下形態(tài);加入各孔的抗生素濃度標(biāo)記在圖片左側(cè);其中“6 h”表示預(yù)培養(yǎng)6 h的未成熟生物膜,“12 h”表示預(yù)培養(yǎng)12 h的成熟生物膜 .經(jīng)Live/Dead染色后的生物膜的三維立體圖像;綠色熒光標(biāo)識(shí)存活細(xì)菌,紅色熒光標(biāo)識(shí)死亡細(xì)菌;“12 h/200 μg/ml”為預(yù)培養(yǎng)12 h的成熟生物膜,并加入了200 μg/ml的萬(wàn)古霉素

圖2 表皮葡萄球菌臨床菌株生物膜對(duì)萬(wàn)古霉素的敏感性
Figure 2 Sensitivity of the biofilm from clinical strain ofS.epidermidisto vancomycin

第一行圖片為生物膜經(jīng)結(jié)晶紫染色后在20倍物鏡下的形態(tài),第二行圖片為生物膜經(jīng)Live/Dead染色后利用激光共聚焦顯微鏡拍攝并重建的三維立體圖像;綠色熒光標(biāo)識(shí)存活細(xì)菌,紅色熒光標(biāo)識(shí)死亡細(xì)菌圖3 超聲及超聲聯(lián)合萬(wàn)古霉素對(duì)表皮葡萄球菌生物膜的影響Figure 3 Effects of ultrasound and ultrasound combined with vancomycin on biofilm from S.epidermidis

表1 超聲及超聲聯(lián)合萬(wàn)古霉素處理后生物膜斷層被SYTO9及PI標(biāo)記的平均熒光強(qiáng)度Table 1 Mean fluorescence intensities of SYTO9 and PI labeled biofilm sections treated by ultrasound and ultrasound combined with

t,P值為PI/總熒光各組與未處理對(duì)照比較結(jié)果;與未處理對(duì)照比較,*P<0.01

2.5 UTMD對(duì)生物膜的影響

在上述相同的超聲條件下,向超聲體系中添加終濃度為30%(V/V)的超聲造影微泡,對(duì)生物膜進(jìn)行UTMD處理,可顯著提高超聲對(duì)生物膜的破壞作用,光鏡下可見(jiàn)生物膜出現(xiàn)大片剝脫。但共聚焦顯微鏡顯示剩余生物膜中仍充斥大量活細(xì)菌。UTMD聯(lián)和100 μg/ml萬(wàn)古霉素對(duì)生物膜共同進(jìn)行處理,其光鏡下形態(tài)與單用UTMD處理無(wú)顯著區(qū)別,然而共聚焦顯微鏡下顯示剩余生物膜中充斥大量死細(xì)菌(紅色熒光占總熒光比例顯著提高,P<0.01,見(jiàn)表2),而活細(xì)菌(綠色熒光)少見(jiàn)(見(jiàn)圖4)。提示UTMD對(duì)生物膜造成的物理?yè)p傷與超聲相似,無(wú)法直接殺傷生物膜中的細(xì)菌,而UTMD與萬(wàn)古霉素聯(lián)合則可對(duì)生物膜中的細(xì)菌造成顯著殺傷。

表2 UTMD及UTMD聯(lián)合萬(wàn)古霉素處理后生物膜斷層被SYTO9及PI標(biāo)記的平均熒光強(qiáng)度Table 2 Mean fluorescence intensities of SYTO9 and PI labeled biofilm sections treated by UTMD and UTMD combined with

t,P值為PI/總熒光值各組與未處理對(duì)照比較結(jié)果;與未處理對(duì)照比較,*P<0.01

第一行圖片為生物膜經(jīng)結(jié)晶紫染色后在20倍物鏡下的形態(tài),第二行圖片為生物膜經(jīng)Live/Dead染色后利用激光共聚焦顯微鏡拍攝并重建的三維立體圖像；綠色熒光標(biāo)識(shí)存活細(xì)菌,紅色熒光標(biāo)識(shí)死亡細(xì)菌圖4 UTMD及UTMD聯(lián)合萬(wàn)古霉素對(duì)表皮葡萄球菌生物膜的影響Figure 4 Effects of UTMD and UTMD combined with vancomycin on biofilm from S.epidermidis

3 討論

臨床植入性假體相關(guān)感染遷延不愈的重要原因是造成這種感染的治病菌形成了生物膜,從而對(duì)多種抗生素高度耐藥。這種耐藥性一方面與生物膜中的基質(zhì)成分對(duì)細(xì)菌的保護(hù)性作用相關(guān),亦可能與生物膜中細(xì)菌自身耐藥性的提高有關(guān)。目前尚無(wú)藥物或其他保守療法可用于治療假體相關(guān)生物膜感染,移除假體是治療這種感染的唯一途徑。

20世紀(jì)90年代,有研究發(fā)現(xiàn),低功率的超聲輻照能夠在不損傷人體組織的前提下,可降低細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性,協(xié)助抗生素殺傷耐藥菌。其中,超聲對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌及沙門氏菌等革蘭氏陰性細(xì)菌的作用尤為顯著[13,14]。本世紀(jì)初,有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),超聲不僅能影響細(xì)菌本身的耐藥性,還對(duì)其形成的生物膜具有一定的殺傷作用。超聲波可清除變形鏈球菌及糞腸球菌形成的生物膜[15,16]。此外,也有學(xué)者發(fā)現(xiàn),超聲波與抗生素聯(lián)合可對(duì)細(xì)菌生物膜產(chǎn)生協(xié)同殺菌作用。超聲聯(lián)合慶大霉素或克林霉素可對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌等生物膜中的細(xì)菌產(chǎn)生一定的殺傷作用[17-19]。近年來(lái),越來(lái)越多的研究證實(shí),超聲可通過(guò)其產(chǎn)生的空化作用對(duì)細(xì)菌生物膜造成損傷,從而降低生物膜對(duì)抗生素的耐藥性。有國(guó)外學(xué)者甚至啟動(dòng)了超聲聯(lián)合抗生素治療生物膜感染的臨床研究,并取得了一定的研究成果[8-10]。

本研究結(jié)果表明,利用低功率的超聲輻照可對(duì)表皮葡萄球菌生物膜形成較為顯著的物理?yè)p傷,使生物膜出現(xiàn)局部剝脫。但是,超聲聯(lián)合萬(wàn)古霉素直接殺傷生物膜中細(xì)菌的作用卻并不顯著。單純的超聲處理無(wú)法有效降低生物膜中細(xì)菌對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥性,處理后的剩余生物膜中死菌的數(shù)量雖較未處理的生物膜有一定增加,但生物膜中仍有大量活菌存在。這一發(fā)現(xiàn)與部分文獻(xiàn)的報(bào)道一致,超聲對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的生物學(xué)作用較弱,其可能機(jī)制在于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌與陰性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同[13]。

近年來(lái),學(xué)者們發(fā)現(xiàn),將超聲與超聲造影微泡聯(lián)合使用,可在局部產(chǎn)生一種UTMD現(xiàn)象,并有效提升超聲波對(duì)組織和細(xì)胞的聲學(xué)作用,從而使超聲發(fā)揮更顯著的生物學(xué)效應(yīng)。目前國(guó)際上已有學(xué)者開(kāi)始關(guān)注其對(duì)細(xì)菌生物膜的影響。有報(bào)道指出,UTMD可提高β防御素-3對(duì)表皮葡萄球菌生物膜的殺傷活性[20]。本研究的前期研究也表明,UTMD聯(lián)合萬(wàn)古霉素可對(duì)表皮葡萄球菌ATCC35984株的生物膜產(chǎn)生較超聲聯(lián)合萬(wàn)古霉素更為顯著的作用,不僅能夠使生物膜產(chǎn)生大面積的剝脫,還能有效殺傷剩余生物膜剝脫裂孔周邊的細(xì)菌,但是UTMD聯(lián)合萬(wàn)古霉素依然無(wú)法殺傷剩余生物膜中心部分的細(xì)菌[21]。

本研究挑選了一株表皮葡萄球菌臨床多重耐藥菌株作為研究對(duì)象,觀察UTMD聯(lián)合萬(wàn)古霉素對(duì)這一臨床耐藥菌株生物膜的作用。研究表明,UTMD聯(lián)合萬(wàn)古霉素處理該臨床菌株的生物膜,獲得了較ATCC35984株更顯著的效果,處理后剩余生物膜中充滿了死亡細(xì)菌。上述結(jié)果提示,UTMD處理生物膜后,生物膜中細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性顯著降低,從而促使抗生素更有效的殺傷細(xì)菌生物膜;但是針對(duì)不同菌株的表皮葡萄球菌,UTMD的處理效果可存在較大差異,UTMD對(duì)不同種類細(xì)菌生物膜的作用可能也不盡相似。

本研究提示超聲理療聯(lián)用超聲造影微泡所產(chǎn)生的UTMD作用,可有效降低細(xì)菌生物膜對(duì)抗生素的耐藥性,增強(qiáng)抗生素殺傷生物膜的能力,UTMD聯(lián)用抗生素相比超聲聯(lián)用抗生素可能更有希望在今后成為臨床對(duì)抗醫(yī)療假體相關(guān)生物膜感染的一種治療方法。