蒙古黃芪質(zhì)量評價及商品規(guī)格等級研究進(jìn)展

曹慶偉,張 瑞,李 科,李愛平,劉月濤,秦雪梅*

(1 山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 030006;2 山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院;3 山西大學(xué)地產(chǎn)中藥功效物質(zhì)研究與利用山西省重點實驗室;4 山西大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室;*通訊作者,E-mail:qinxm@sxu.edu.cn;#共同通訊作者,E-mail:like@sxu.edu.cn)

中藥作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與文化的瑰寶,是否能走向國際化,首先要解決的必然是安全性與有效性的問題,即中藥材質(zhì)量優(yōu)劣問題。自古以來,中藥材形成了“看貨評級,分檔議價”的市場規(guī)律。依據(jù)傳統(tǒng)經(jīng)驗即“辨狀論質(zhì)”來判斷中藥材的好壞,逐漸形成了商品規(guī)格等級。但隨著中藥材栽培品大范圍人工種植,且栽培藥材在性狀及品質(zhì)上發(fā)生明顯改變,導(dǎo)致現(xiàn)行的商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)無法準(zhǔn)確評價中藥材質(zhì)量優(yōu)劣。本文以蒙古黃芪為例,總結(jié)黃芪藥材優(yōu)劣性評價方法及黃芪商品規(guī)格等級研究,修訂黃芪商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn),以期為黃芪質(zhì)量等級標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ)。

1 蒙古黃芪藥材質(zhì)量優(yōu)劣性評價研究進(jìn)展

1.1 基于性狀特征的評價

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根,前者主產(chǎn)東北,后者主產(chǎn)區(qū)在山西和內(nèi)蒙、陜北等地。由于黃芪用量很大,加之野生資源的枯竭及再生能力的下降,我國北方多省均有人工引種。然而,傳統(tǒng)使用的野生或仿野生(種子直播,根垂直生長)黃芪至少生長6年以上,且根深達(dá)1 m左右。20世紀(jì)80年代發(fā)展了平栽(育苗一年,第二年移栽,主根橫臥于溝,生長一年即可上市)種植方式,其低成本生產(chǎn)特點,使黃芪產(chǎn)量迅速擴大,緩解了市場需求緊張。在性狀特征評價方面,早在金元時期王好古[1]認(rèn)為味甘如蜜,兼體骨柔軟如綿的黃芪為最佳。以目前市場中存在的仿野生芪與移栽芪比較可以明顯看出,仿野生芪具有“主根粗長、少分支、綿性大、粉性強、甜味足、豆腥味濃”等特點,而移栽芪外觀與仿野生芪有較大差別,呈現(xiàn)“主根短、分支多、質(zhì)堅硬、雞爪型、微甜而淡”等特征。目前移栽芪雖然產(chǎn)量大,但品質(zhì)不如仿野生芪。

1.2 基于化學(xué)成分的評價

1.2.1 黃芪藥材多指標(biāo)含量測定研究 中藥療效是多種化學(xué)成分協(xié)同作用的結(jié)果,多指標(biāo)含量測定[2,3]符合中藥多成分、多靶點等特征,因此已廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制與評價,較準(zhǔn)確反映了藥材的差異性與均一性。

在黃芪多指標(biāo)含量測定研究方面,胡方弟等[4]比較了黃芪與紅芪中毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪甲苷含量,發(fā)現(xiàn)黃芪與紅芪3種物質(zhì)含量差異較大。Qi等[5]運用HPLC-DAD-ELSD法同時測定黃芪藥材中6種黃酮與4種皂苷含量,更全面的對黃芪進(jìn)行含量測定與質(zhì)量控制。萬燕晴[6]考察了不同商品規(guī)格等級黃芪藥材黃酮與皂苷類10種成分含量差異,發(fā)現(xiàn)野生芪無論是黃酮類成分還是皂苷類成分都高于移栽芪。熊一峰[7]采用12種成分同時測定法評價黃芪藥材質(zhì)量,由于多數(shù)樣品中未能檢測到芒柄花素,故將芒柄花素含量排除在外后,以剩余11種指標(biāo)含量為變量,最后得到84×11的數(shù)據(jù)矩陣。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到SPSS 19.0中進(jìn)行變量之間的相關(guān)性分析,得到Pearson相關(guān)系數(shù),以及各變量之間的相關(guān)顯著性(見圖1)[7]。其中,毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、紫檀烷苷和異黃烷苷為一類;毛蕊異黃酮、紫檀烷和異黃烷為一類;4種皂苷為一類。分別取名為黃酮苷類,黃烷類和皂苷類。對于黃酮苷類成分,4種成分存在明顯的正相關(guān),且毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量最高;對于黃烷類成分,3種成分含量較低,從檢測靈敏度來講不適用于含量測定;對于皂苷類成分,黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ可以通過堿化轉(zhuǎn)化成黃芪皂苷Ⅳ,且4類皂苷正相關(guān)。黃芪多成分含量測定研究結(jié)果也證明了2015版《中國藥典》黃芪項下選取毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷為含量測定指標(biāo)的合理性。

圖1 黃芪各指標(biāo)成分相關(guān)分析[7]

1.2.2 黃芪甲苷含測方法研究 張宇等[8]運用正交設(shè)計的方法選擇黃芪甲苷的最佳提取工藝,結(jié)果顯示,加水量5倍,溫度控制在40-60 ℃,超聲提取30 min的工藝條件最好。王鵬等[9]采用正交試驗篩選黃芪的最佳提取工藝條件,結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇 ∶氨水為9 ∶1,溶劑總量為150 ml,超聲40 min提取工藝最好。丁如賢等[10]比較了4種不同黃芪甲苷的前處理方法,對是否過D101大孔吸附樹脂及對回流提取與索氏提取效率進(jìn)行了比較。實驗結(jié)果表明,過D101大孔吸附樹脂會對黃芪皂苷有一定的吸附量。省去大孔樹脂吸附除雜這一步,對黃芪甲苷峰的分離及檢測沒有影響,可大幅提高黃芪甲苷濃度,提高了測定的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。杜國軍[11]建立了一種簡便、省時的黃芪甲苷備樣方法,即用甲醇超聲提取時加入氨水處理前步驟,然后用不同濃度的乙醇過D101大孔樹脂進(jìn)行洗脫。

1.3 基于藥效的評價

作為傳統(tǒng)的補益名藥,黃芪具有補氣固表之功效。具有抗衰老、抗疲勞、抗病毒、抗癌、調(diào)節(jié)機體免疫、調(diào)節(jié)血糖、改善血液流變學(xué)、保護(hù)泌尿系統(tǒng)等藥理作用[12],臨床上常用于治療冠心病心絞痛、心力衰竭[13]等。目前,以疲勞與心衰動物模型研究較多。

謝道生[14]比較了山西渾源野生黃芪與甘肅栽培芪補氣與抗疲勞作用,結(jié)果顯示,豆腥味濃的渾源黃芪在補氣、抗疲勞(延長游泳力竭時間、減少血清尿素及血乳酸含量)、提高免疫器官指數(shù)以及總T淋巴細(xì)胞等方面作用明顯高于栽培芪。何盼[15]采用大鼠負(fù)重力竭游泳模型研究黃芪抗疲勞作用,根據(jù)傳統(tǒng)藥效指標(biāo)篩選出黃芪的最佳給藥劑量、力竭時間,然后用篩選得到的最佳劑量,比較野生芪和移栽芪對大鼠的抗疲勞作用及代謝組學(xué)指標(biāo)的干預(yù)作用,記錄實驗最后一天大鼠的力竭游泳時間,對血清生化指標(biāo)進(jìn)行分析。結(jié)果表明,野生芪和移栽芪均能延長疲勞大鼠的力竭游泳時間;改善組織病理學(xué)水平;與模型組相比,都可以對血清生化指標(biāo)(CK、BUN、LDH、GLU),骨骼肌生化指標(biāo)(SOD、MDA、GSH-Px)有回調(diào)作用,但是野生芪組大鼠的力竭游泳時間明顯高于移栽芪,野生芪CK水平的回調(diào)效果也明顯優(yōu)于移栽芪。該研究結(jié)果表明野生芪對疲勞大鼠的干預(yù)作用顯著優(yōu)于移栽芪。高四云[16]采用“腹腔注射阿霉素致大鼠心衰”進(jìn)行心衰實驗造模,比較野生芪與移栽芪對心衰大鼠傳統(tǒng)藥效指標(biāo)及代謝組學(xué)指標(biāo)的干預(yù)作用。結(jié)果表明野生芪與移栽芪均能改善大鼠一般情況、組織病理學(xué)、心功能參數(shù)、血清生化指標(biāo)及B型腦鈉肽(BNP)水平;但與模型組相比,野生芪對心功能參數(shù)[射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室短軸縮短率(FS)和左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)]、生化指標(biāo)肌酸激酶(CK)和血清BNP含量的干預(yù)作用優(yōu)于移栽芪,且表現(xiàn)出顯著差異。主成分分析結(jié)果顯示,對照組和模型組的代謝輪廓明顯區(qū)分,并鑒定了14個與心衰相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物,野生芪與移栽芪均能不同程度地回調(diào)其中14個標(biāo)志物,2-羥基異丁酸、谷氨酸、丙酮酸鹽、甲酸鹽代謝物在野生芪組中變化率較大。該研究結(jié)果表明野生芪對心力衰竭大鼠的干預(yù)作用顯著優(yōu)于移栽芪,可為黃芪精細(xì)化商品等級規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)的建立、臨床合理用藥和制藥企業(yè)分類選擇黃芪原料提供科學(xué)依據(jù)。

1.4 黃芪藥材質(zhì)量與生長年限相關(guān)性研究

孫思邈在《備急千金要方》中強調(diào):“早則藥勢未成,晚則盛勢已歇”,說明生長年限對中藥材藥理活性有較大影響。對于根類中藥材,生長年限越長,次生代謝產(chǎn)物積累越多,藥效才能越好。例如人參需要在長白山適宜的產(chǎn)地生長6年以上才可藥用,其生長年限可通過地上部分和蘆頭形態(tài)得以判斷,不同的生長年限可以區(qū)分不同的商品等級規(guī)格,市場交易時定價不同,以此保優(yōu)淘劣。

對于仿野生芪而言,一般生長6年或6年以上采挖,部分供應(yīng)市場的野生黃芪,其生長年限甚至長達(dá)幾十年,不同的生長年限對化學(xué)成分的積累產(chǎn)生較大影響[17-21]。然而,目前在藥材含量測定時很難明確樣品的實際生長年限,主要原因是[7]:①主根不斷向下生長,造成同一主根的上下段生長年限不同;產(chǎn)地加工時,按直徑不同剪成不同的等級,上段較粗的根段生長年限較長,但目前的等級分類標(biāo)準(zhǔn)并未與確切的生長年限完全對應(yīng);②同一黃芪植株,側(cè)根與主根的年限是否一致并不明確,產(chǎn)地初加工時,將側(cè)根剪下與主根一起比較,依據(jù)直徑的粗細(xì)被劃分到不同等級中,也形成了藥材同一等級生長年限混雜的現(xiàn)象。③同一地塊,黃芪生長的第二年就能開花結(jié)實,種子從年老的植株落入土中又生長成新的植株,這樣在同一地塊中生長出來的黃芪根其實際年限并不一致,存在多個年限根的混雜。不同課題組測定不同商品規(guī)格等級黃芪藥材毛蕊異黃酮葡萄糖苷與黃芪甲苷含量結(jié)果不一致是由于黃芪實際生長年限不確定。

2013年王軍等[22]通過生長輪對黃芪進(jìn)行年限鑒別,研究發(fā)現(xiàn):山西渾源的黃芪根中具有清晰的生長輪(主要由次生木質(zhì)部的大導(dǎo)管群形成),而且在生長年限較長的黃芪中發(fā)現(xiàn),從上端到下端生長輪環(huán)數(shù)也不相同,其中上部的生長輪數(shù)多、下部的生長輪數(shù)少(見圖2)。這說明對于黃芪藥材來講,多年生的根上部和下部的生物學(xué)年齡是不一致的,意味著上部和下部的次生代謝產(chǎn)物積累的程度也不同。因此黃芪商品規(guī)格等級以直徑劃分不全面,應(yīng)結(jié)合黃芪實際生長年限劃分黃芪藥材等級。因此,高四云[23]通過徒手切片鑒定和石蠟切片驗證方法,建立以生長輪數(shù)目為依據(jù)的黃芪根部年限鑒定方法,將黃芪藥材絕對生長年限與直徑關(guān)聯(lián),進(jìn)而測定不同生長年限黃芪化學(xué)成分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)山西仿野生芪特等主要為五年生以上;一等主要分布在4-5年;二等主要分布在3-4年;三等主要分布在2-3年;四等主要分布在1-2年。

熊一峰[7]對不同絕對生長年限黃芪化學(xué)成分含量進(jìn)行比較,結(jié)果表明四年生總黃酮含量最高,兩年生皂苷含量最高。研究為建立黃芪年限性狀與規(guī)格等級關(guān)聯(lián)奠定了基礎(chǔ)。

A.黃芪完整的根;B.黃芪根中的空心;C.空心部分的組織結(jié)構(gòu);D.黃芪根上部的生長輪;E.黃芪根中開始產(chǎn)生空心圖;F.開始產(chǎn)生的空心部分方法圖;G.黃芪根中部的生長輪;H.黃芪根下部的生長輪;I.黃芪根的次生結(jié)構(gòu)圖2 山西渾源黃芪的生長輪解剖圖[22]

2 黃芪藥材商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展

2.1 黃芪藥材規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)研究現(xiàn)狀及存在問題

中藥材商品規(guī)格等級的劃分自古就有,中藥材的質(zhì)量在一定程度以規(guī)格等級體現(xiàn)“優(yōu)質(zhì)優(yōu)價”。解放前,市場黃芪商品規(guī)格等級劃分以《天津口岸黃芪出口標(biāo)準(zhǔn)》為主。新中國成立以來,國家先后3次頒布關(guān)于黃芪商品規(guī)格的標(biāo)準(zhǔn),分別是1959年《38種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》、1964年《54種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》以及1984年國家中醫(yī)藥管理局與衛(wèi)生部聯(lián)合下達(dá)的《76種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》。其中《76種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》流通和應(yīng)用最廣泛。

本課題組[24]調(diào)查了不同企業(yè)與山西省地方標(biāo)準(zhǔn)黃芪商品規(guī)格等級的劃分,對現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)、各企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(見表1)進(jìn)行整理匯總后發(fā)現(xiàn):①各標(biāo)準(zhǔn)中黃芪均沒有規(guī)格之分,仿野生芪與移栽芪性狀差異無描述。②目前黃芪市場存在多個標(biāo)準(zhǔn),各標(biāo)準(zhǔn)中雖然都是依據(jù)長度、直徑進(jìn)行等級劃分,但是對直徑的測量部位卻有差異,各標(biāo)準(zhǔn)每個等級直徑范圍與長度范圍也不相同。③仿野生芪為根部向下生長多年,2年生移栽芪為平地生長。兩類黃芪長度差異較大,而各標(biāo)準(zhǔn)卻無長度區(qū)分。④各個標(biāo)準(zhǔn)中對黃芪的等級劃分?jǐn)?shù)目不一致,由表1可知,不同標(biāo)準(zhǔn)黃芪等級等級劃分?jǐn)?shù)目為3-7個不等。

由此可以看出,眾多標(biāo)準(zhǔn)的不一致導(dǎo)致黃芪商品交易過程的“同質(zhì)不同價”和黃芪藥材交易混論。分析其原因,由于缺乏對不同規(guī)格等級黃芪藥材性狀的深入調(diào)查研究,各類標(biāo)準(zhǔn)都不能完全涵蓋市場中流通的各等級黃芪藥材。為此,研究制訂統(tǒng)一的黃芪藥材商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)是目前亟待解決的實際問題。

表1 黃芪規(guī)格等級劃分

2.2 新修訂的黃芪商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)

2018年12月3日,中華中醫(yī)藥學(xué)會發(fā)布了團體標(biāo)準(zhǔn)《中藥材商品規(guī)格等級-黃芪》(標(biāo)準(zhǔn)編號:T/CACM 1021.4-2018),針對以上標(biāo)準(zhǔn)存在問題,本課題組對黃芪標(biāo)準(zhǔn)作出了如下改進(jìn):①各個標(biāo)準(zhǔn)無黃芪規(guī)格之分,即對仿野生芪與甘肅移栽芪無性狀區(qū)分。該標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)仿野生芪與移栽芪性狀差異,劃分為兩種規(guī)格(修訂的黃芪藥材規(guī)格差異見表2)。②針對黃芪多個標(biāo)準(zhǔn)直徑測量部位不同,該標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一了直徑測量部位,即頭部斬口下3.5 cm處(切掉蘆頭、二刀頭及空心面積少于1/3處斬口下方3.5 cm處的直徑)。選擇此處原因為頭部斬口下3.5 cm空心部分少于1/3,保證了黃芪品質(zhì)。③針對各標(biāo)準(zhǔn)不同等級直徑范圍無統(tǒng)一定論,該標(biāo)準(zhǔn)確定了仿野生芪等級與絕對生長年限的關(guān)系(見圖3),依據(jù)生長輪判定生長年限。不同生長年限黃芪化學(xué)成分差異較大,故仿野生芪等級劃分應(yīng)保持同一等級頭部直徑與末端直徑絕對生長年限一致(修訂的黃芪藥材等級與直徑差異見表2)。

A. 6年生黃芪生長輪;B. 5年生黃芪生長輪;C. 4年生黃芪生長輪;D. 3年生黃芪生長輪;E. 2年生黃芪生長輪;F. 1年生黃芪生長輪圖3 同一條黃芪根不同直徑處的生長輪數(shù)目[23]

2.3 黃芪質(zhì)量與規(guī)格等級相關(guān)性研究

2.3.1 不同規(guī)格等級黃芪藥材毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量比較 對于不同規(guī)格黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量,石子儀等[25]、姚雪蓮等[26]和杜國軍[11]考察了不同產(chǎn)地毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量,得出結(jié)果一致,山西仿野生芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量明顯高于其他產(chǎn)地。對于不同等級研究,不同課題組所得結(jié)論不一致[6,27,28]。

2.3.2 不同規(guī)格等級黃芪藥材黃芪甲苷含量比較 已有研究表明[7],黃芪甲苷主要存在于黃芪韌皮部,故直徑越細(xì),韌皮部占比越大,黃芪甲苷含量比例越高。不同實驗室所得研究結(jié)果結(jié)論一致,然而當(dāng)對不同產(chǎn)地黃芪含量比較時,不同實驗室就會得出相互矛盾的結(jié)果。萬燕晴[6]與牛倩蕓等[27]比較了不同規(guī)格蒙古黃芪黃芪甲苷含量,結(jié)果顯示仿野生芪含量顯著高于移栽芪。王文全課題組[29]比較了不同商品等級野生芪與栽培芪黃芪甲苷含量,發(fā)現(xiàn)栽培芪含量高于野生芪。杜國軍等[30]對比傳統(tǒng)黃芪與栽培芪黃芪甲苷含量,結(jié)果顯示二者無顯著性差異。

表2 修訂的黃芪藥材規(guī)格等級劃分

3 中藥材商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)到質(zhì)量等級的演變

傳統(tǒng)中藥材商品規(guī)格等級的劃分是對傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別法的總結(jié)。它主要是從外觀性狀來評價。具有方法簡便、重點突出、只通過直觀鑒別就可以判斷品質(zhì)優(yōu)劣。然而,已有研究表明,中藥材傳統(tǒng)商品規(guī)格等級劃分與其質(zhì)量的相關(guān)性不強,劉書斌等[31]對甘肅不同等級的黨參進(jìn)行化學(xué)含量測定,研究發(fā)現(xiàn),白條黨參二等品中有效成分黨參炔苷含量高于一等和三等,這說明甘肅產(chǎn)地黨參規(guī)格等級劃分不合理。顯然商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)已無法滿足評價中藥材質(zhì)量優(yōu)劣的需求。

2018年7月20日,中國中藥協(xié)會發(fā)布了行業(yè)內(nèi)第一個“質(zhì)量等級標(biāo)準(zhǔn)”-《西紅花質(zhì)量等級》標(biāo)準(zhǔn)(T/CATCM 002-2018)。這是第一個以“質(zhì)量等級”區(qū)分藥材“商品規(guī)格”的標(biāo)準(zhǔn)。判定該標(biāo)準(zhǔn)的中國食品藥品檢定研究院經(jīng)過充分的文獻(xiàn)調(diào)研、樣品收集、實驗研究、結(jié)果論證,在《中國藥典》2015版西紅花藥材標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上,增加西紅花藥材特征性成分苦番紅花素作為質(zhì)量指標(biāo),并以西紅花苷Ⅰ及西紅花苷Ⅱ的含量之和作為等級標(biāo)準(zhǔn)的劃分依據(jù),制定了《西紅花質(zhì)量等級》團體標(biāo)準(zhǔn)。它區(qū)別于傳統(tǒng)以藥材大小、粗細(xì)、重量作為“商品規(guī)格”區(qū)分的藥材等級標(biāo)準(zhǔn),較全面評價西紅花質(zhì)量。它不再局限于傳統(tǒng)性狀特征的描述,而是從更全面的化學(xué)有效成分與藥效來評價藥材質(zhì)量,標(biāo)志著中藥材商品規(guī)格等級進(jìn)入質(zhì)量評價新時代。因此本文以蒙古黃芪為例,系統(tǒng)總結(jié)黃芪藥材優(yōu)劣性評價方法及黃芪商品規(guī)格等級研究,修訂黃芪商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn),希望通過黃芪外觀性狀與內(nèi)在化學(xué)成分相關(guān)聯(lián),為后續(xù)黃芪質(zhì)量等級標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ)。