3，6'-二芥子酰基蔗糖對(duì)卒中后抑郁星型膠質(zhì)細(xì)胞的影響

鄒文靜 賈濛濛 葉夢(mèng)瑤 茅瑛琦 裘濤 陶水良*

卒中后抑郁是腦卒中后較常見(jiàn)的一種并發(fā)癥，流行病學(xué)資料顯示其發(fā)病率占腦卒中患者的33%～50%，臨床主要表現(xiàn)為情緒低落、精神萎靡、焦慮、絕望等情感變化，甚至有自殺傾向［1］。目前卒中后抑郁治療以SSRI類(lèi)等抗抑郁藥物為主，但其存在有效率低，起效慢，復(fù)發(fā)率高，不同程度的毒副作用，導(dǎo)致自殺傾向等一系列缺點(diǎn)。中醫(yī)在卒中后抑郁的治療上存在一定的優(yōu)勢(shì)［2］。研究表明慢性不可預(yù)知性應(yīng)激下減少大鼠海馬星型膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和體積，同時(shí)降低GFAP的水平［3］。2016年7月至2018年1月作者通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究3，6'-二芥子酰基蔗糖對(duì)卒中后抑郁大鼠行為學(xué)改變和星型膠質(zhì)細(xì)胞（AS）功能的影響，初步了解3，6'-二芥子?；崽菍?duì)卒中后抑郁的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 成年健康雄性SD大鼠40只，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，批號(hào)：SCXK（滬）.2012-0002。實(shí)驗(yàn)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心進(jìn)行，以5只一籠群養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)安放大鼠，1次/d更換墊料，保持籠內(nèi)環(huán)境清潔，保持晝夜更替，給予正常飲食，飼養(yǎng)2周，抓取1次/2d，使其適應(yīng)動(dòng)物房環(huán)境以及實(shí)驗(yàn)操作人員。

1.2 藥物及試劑 遠(yuǎn)志提取物（3，6'-二芥子?；崽牵杭兌?9.06%（HPLC）（成都曼斯特生物科技有限公司研制，批號(hào)：MUST-16070608）。鹽酸氟西汀分散片，規(guī)格為20mg，28片/盒，批號(hào)：160622，廠家：PATHEON FRANCE。KN93（CaMKⅡ抑制劑）5mg（美國(guó)MCE公司生產(chǎn)），ab7260Anti-GFAP（杭州寶科生物科技有限公司提供 兔抗大鼠，批號(hào)GR3187698），超敏酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物（PV-8000）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)107257D9），Anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor（R）488 Probes（杭州柏奧谷科技有限公司提供 批號(hào) 17）。

1.3 方法 （1）卒中后抑郁模型的建立：在改良Zea-Longa線栓法基礎(chǔ)上通過(guò)大腦中動(dòng)脈栓塞法建立大鼠腦卒中模型［4］，根據(jù)Longa［5］神經(jīng)功能損傷評(píng)分可確定大鼠腦卒中后模型制備成功，1周后，在此基礎(chǔ)利用孤養(yǎng)聯(lián)合束縛應(yīng)激處理造成患病后大鼠的壓抑環(huán)境2～3周制備PSD模型。（2）分組與給藥：在予大鼠中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型前隨機(jī)抽取10只正常大鼠成組，5只/籠飼養(yǎng)，不予給藥，予正常飲食生活。30只PSD模型大鼠隨機(jī)被分為： PSD+NS組、PSD+Flx組、PSD+YZ組，每組各10只。各組每籠1只飼養(yǎng)。給藥周期為21d，從束縛第1天開(kāi)始，每日于束縛前30min，PSD+YZ組予遠(yuǎn)志提取物，給藥量為4.7g/（kg·d）（按人體用藥量換算成大鼠等效劑量），PSD+Flx組予氟西汀藥液灌服1次，用量為1.8mg/（kg·d），正常組和PSD+NS組則灌服等量的生理鹽水［每只6.7ml/（kg·d）］。（3）糖水偏好程度檢測(cè)：各組大鼠于孤養(yǎng)束縛后第7、14、21天進(jìn)行糖水偏好試驗(yàn)。大鼠禁食禁水21h后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，一瓶1%糖水和一瓶純凈水分別放置在每個(gè)測(cè)試鼠籠前，1h后互換兩個(gè)水瓶位置，再過(guò)1h后取瓶，測(cè)量并計(jì)算動(dòng)物的糖水偏好程度。糖水偏好程度=糖水消耗量/總液體消耗量×100%。（4）取材：治療第21天后，端頭處死全部大鼠，每組有3只取全腦，用錫紙包裹，投至液氮中，隨后移至-80℃超低溫冰箱中保存待用。（5）免疫組織化學(xué)染色：選取冰凍腦組織頂葉切割，對(duì)各組冰凍切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)二部法染色，一抗為ab7260Anti-GFAP antibody，每個(gè)腦片中加入一抗37℃溫箱孵育60min，漂洗后加入種屬匹配的二抗試劑，37℃溫箱孵育60min，漂洗后DAB顯色1～2min，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。每組3只大鼠，每只大鼠隨機(jī)選取3張切片，每張切片用Nikon eclipse 80i顯微鏡拍攝照片。每張切片隨機(jī)選擇400×下的3個(gè)視野，應(yīng)用Carl Zeiss Imaging Systems圖像分析軟件系統(tǒng)對(duì)GFAP平均光密度值（MOD）進(jìn)行圖像分析處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布計(jì)量資料以（±s）表示，用方差分析；非正態(tài)分布用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠糖水偏好程度 束縛第7天，PSD+NS組、PSD+FLX組大鼠糖水偏好程度較正常組明顯降低（P＜0.05），PSD+YZ組大鼠糖水偏好程度較正常組顯著升高（P＜0.05）。束縛3周后，PSD+FLX組大鼠糖水偏好程度改善；PSD+NS組大鼠糖水偏好程度呈持續(xù)下降趨勢(shì)，PSD+YZ組大鼠糖水偏好持續(xù)在較高的狀態(tài)。各組大鼠建模后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測(cè)量方差分析顯示：球形度P=0.169，時(shí)間效應(yīng)F=2.957，P=0.06；組間效應(yīng)F=109.795，P＜0.001；時(shí)間組別交互效應(yīng)F=3.363，P=0.01。組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，時(shí)間和組間存在交互效應(yīng)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠糖水偏好程度結(jié)果比較（±s）

表1 各組大鼠糖水偏好程度結(jié)果比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，與PSD+NS組比較，#P＜0.05

組別 束縛第7天 束縛第14天 束縛第21天PSD+FLX組 0.71±0.04* 0.71±0.05 0.72±0.02*#PSD+YZ組 0.97±0.03*# 0.96±0.03*# 0.97±0.01*#PSD+NS組 0.72±0.02* 0.69±0.07 0.58±0.07*正常組 0.85±0.07# 0.78±0.09 0.83±0.03#

2.2 各組大鼠頂葉GFAP的MOD分析比較 PSD+NS組GFAP的MOD較正常組、PSD+FLX組、PSD+YZ組 明 顯 降 低（P＜0.05），PSD+YZ組 與 PSD+FLX組GFAP的MOD相當(dāng)（P＞0.05）。正常組GFAP的MOD較PSD+YZ組及PSD+FLX稍低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表 2。

表2 各組大鼠頂葉GFAP（MOD）分析（±s）

表2 各組大鼠頂葉GFAP（MOD）分析（±s）

注：與PSD+NS組比較，*P＜0.05

組別 GFAP（MOD）PSD+FLX組 0.116±0.003*PSD+YZ組 0.116±0.007*PSD+NS組 0.107±0.005正常組 0.114±0.004*

3 討論

星型膠質(zhì)細(xì)胞（AS）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布最廣，用途最多的膠質(zhì)細(xì)胞。星型膠質(zhì)細(xì)胞能分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)神經(jīng)元起營(yíng)養(yǎng)支持作用，促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)、修復(fù)、再生［6］；參與突觸結(jié)構(gòu)的形成，影響突觸的凋亡［7-8］；參與神經(jīng)細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)，影響神經(jīng)元的興奮性傳遞［9］。膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）是星型膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物，其表達(dá)的強(qiáng)弱反映星型膠質(zhì)細(xì)胞的活躍狀態(tài)，主要參與星型膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元之間的信息傳遞［10］。大量研究表明抑郁癥大鼠模型細(xì)胞內(nèi)星型膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著減少，GFAP表達(dá)也相應(yīng)減少［11-13］。氟西汀的治療可以增加抑郁癥患者星型膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，調(diào)節(jié)星型膠質(zhì)細(xì)胞中特異性蛋白的表達(dá)，增加其突觸分支的可塑性，從而改善星型膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)功能，發(fā)揮抗抑郁作用［14-15］。

《神農(nóng)本草經(jīng)》記載遠(yuǎn)志味苦、性溫，歸心、腎、肺經(jīng)，具有養(yǎng)心安神定志，祛痰鎮(zhèn)咳消腫等功能。研究表明遠(yuǎn)志有抗抑郁，抗癲癇，抗癡呆，鎮(zhèn)咳祛痰，保護(hù)心腦血管等作用［16-18］。其化學(xué)成分主要有三萜皂苷類(lèi)、寡糖酯、哐山酮類(lèi)等化合物，3，6'-二芥子?；崽鞘枪烟酋ヮ?lèi)單體化合物。HU等［19］研究表明3，6'-二芥子酰基蔗糖有抗抑郁作用，其作用機(jī)制與下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)激素軸及生物氧化系統(tǒng)有關(guān)。章主恒等［20］發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志中有效成分可通過(guò)調(diào)節(jié)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)再攝取過(guò)程發(fā)揮抗抑郁作用。

本資料結(jié)果顯示，束縛3周后，與正常組比較，PSD+NS組糖水偏好程度明顯下降（P＜0.05），PSD+FLX組較PSD+NS組糖水偏好程度上升，PSD+YZ組糖水偏好程度程度明顯上升（P＜0.05）。由此發(fā)現(xiàn)PSD模型是可以通過(guò)建立MCAO模型后利用孤養(yǎng)結(jié)合束縛被成功復(fù)制。與正常組比較，PSD+NS組GFAP的MOD顯著減少（P＜0.05）；與PSD+NS組比較，PSD+FLX組及PSD+YZ組GFAP的MOD增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PSD+YZ組與PSD+FLX組比較，PSD+YZ組糖水偏好程度程度明顯上升（P＜0.05），GFAP的MOD相當(dāng)（P＞0.05）。免疫組化結(jié)果顯示正常組星型膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP表達(dá)多，胞體小，突起豐富，纖維排列呈放射狀；PSD+NS組星型膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP表達(dá)明顯減少，胞體腫脹，突起減少，纖維排列稀疏；PSD+FLX組及PSD+YZ組表達(dá)增多，胞體稍大，突起延長(zhǎng)，分支增多，纖維排列不規(guī)則。故遠(yuǎn)志提取物3，6'-二芥子?；崽强梢愿纳拼笫笮袨閷W(xué)（糖水偏好程度），增加星型膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP的平均光密度值，改善星型膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。綜上，3，6'-二芥子?；崽强赡芡ㄟ^(guò)同時(shí)增加GFAP的表達(dá)，改善星型膠質(zhì)細(xì)胞功能，起到抗抑郁的作用。