復(fù)方羅漢果清肺糖漿HPLC特征圖譜及主要成分含量測定

李鶴 閔建國 鄒準(zhǔn) 周艷林 朱開梅

摘要：目的? 建立復(fù)方羅漢果清肺糖漿的特征圖譜，并測定其中主要成分木犀草苷、羅漢果皂苷Ⅴ的含量。方法? 采用Waters Sunfire C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫，流速0.8 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果? 15批復(fù)方羅漢果清肺糖漿HPLC特征圖譜確立了10個共有峰，且相對保留時間的RSD均小于2.0%。木犀草苷、羅漢果皂苷Ⅴ分別在0.163 2～0.816 0 μg、0.730 8～3.654 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為96.30%、95.11%，RSD分別為2.28%、2.87%。結(jié)論? HPLC特征圖譜結(jié)合主要成分含量測定能更全面反映制劑內(nèi)在質(zhì)量，可用于復(fù)方羅漢果清肺糖漿綜合質(zhì)量評價。

關(guān)鍵詞：復(fù)方羅漢果清肺糖漿;高效液相色譜法;木犀草苷;羅漢果皂苷Ⅴ;特征圖譜

中圖分類號：R284.1??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）06-0082-04

Abstract： Objective To establish characteristic spectrum of Fufang Luohanguo Qingfei Syrup by HPLC; To determine the contents of luteoloside and mogroside Ⅴ. Methods HPLC was performed on Waters Sunfire C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） by using acetonitrile and 0.2% phosphoric acid solution as the mobile phase in gradient elution. The flow rate was 0.8 mL/min; the detection wavelength was set at 210 nm; the column temperature was 25 ℃; the injection volume was 10 μL. Results Ten common peaks were determined from the HPLC characteristic spectrum of fifteen batches of samples. The RSDs of retention time were less than 2.0%. The good linear range of luteoloside and mogroside Ⅴ was among 0.163 2–0.816 0 μg and 0.730 8–3.654 0 μg， respectively. The average recovery of sample addition was 96.30% and 95.11%， with RSD of 2.28% and 2.87%， respectively. Conclusion The HPLC characteristic spectrum combined with the content determination of main components can reflect the inherent quality of preparation more comprehensively， which can be used in the comprehensive quality evaluation of Fufang Luohanguo Qingfei Syrup.

Keywords： Fufang Luohanguo Qingfei Syrup; HPLC; luteoloside; mogroside Ⅴ; characteristic spectrum

復(fù)方羅漢果清肺糖漿由羅漢果、枇杷葉、菊花、苦杏仁等6味中藥組成，具有清熱化痰、潤肺止咳功效，對于咳嗽痰黃、咯痰不暢、咽干舌燥等證屬痰熱

基金項目：廣西壯族自治區(qū)工業(yè)和信息化發(fā)展專項資金（2017年）;廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃（桂科能1598025-46）;廣西壯族自治區(qū)級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（201710601054、201710601055）;桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃（20150102-6、20150102-7、20150102-8）

通訊作者：顧生玖，E-mail：gushengjiu@163.com

咳嗽者具有較好療效。復(fù)方羅漢果清肺糖漿現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)（WS-5922（B-0922）-2014Z）僅建立了羅漢果、枇杷葉及菊花藥材的薄層鑒別。該處方以羅漢果為君藥，主要成分羅漢果皂苷Ⅴ具有止咳祛痰的藥效作用[1]。方中菊花主要成分為木犀草苷及綠原酸類成分，具有止咳、祛痰、平喘的藥效作用[2-3]。為更全面評價該產(chǎn)品的質(zhì)量，本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-10]，建立以處方藥材特征性成分為基礎(chǔ)的對照特征圖譜，采用HPLC同時測定制劑中羅漢果皂苷Ⅴ和木犀草苷的含量，為該產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升奠定基礎(chǔ)。

1? 儀器與試藥

1260系列高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），Milli-Q Direct 8超純水一體化系統(tǒng)（美國默克密理博公司），XP404S型電子天平（瑞士Mettler公司）。

羅漢果皂苷Ⅴ對照品（批號111754-201502）、苦杏仁苷對照品（批號110820-201607）、木犀草苷對照品（批號111720-201609），中國食品藥品檢定研究院;乙腈為色譜純（德國Merck公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。15批復(fù)方羅漢果清肺糖漿為桂林三金藥業(yè)股份有限公司2016年3月-2017年9月留樣樣品。

2? 特征圖譜

2.1? 色譜條件

采用Waters Sunfire C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;以乙腈（A）-0.2%磷酸水（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，10%→13%A;10～20 min，13%→17%A;20～47 min，17%→20%A;47～60 min，20%→23%A;60～90 min，23%→26%A;90～95 min，26%A）;流速：0.8 mL/min;柱溫：25 ℃;檢測波長：210 nm;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2? 溶液的制備

2.2.1? 混合對照品溶液的制備

取苦杏仁苷對照品、木犀草苷對照品、羅漢果皂苷Ⅴ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含苦杏仁苷30 μg、木犀草苷10 μg、羅漢果皂苷Ⅴ 40 μg的混合溶液，即得。

2.2.2? 供試品溶液的制備

取復(fù)方羅漢果清肺糖漿樣品150 mL，加氨水適量，調(diào)pH值至中性。精密量取5 mL，通過大孔吸附樹脂柱D101（內(nèi)徑1 cm，柱高20 cm），以水20 mL洗脫，棄去水液，再用稀乙醇20 mL洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用70%乙醇20 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加80%甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3? 方法學(xué)考察

取同一批復(fù)方羅漢果清肺糖漿樣品（批號170206），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以木犀草苷峰（4號峰）為參照峰，結(jié)果精密度試驗各共有峰相對保留時間的RSD介于0.04%～0.49%，穩(wěn)定性試驗各共有峰相對保留時間的RSD介于0.05%～0.49%，重復(fù)性試驗各共有峰相對保留時間的RSD介于0.06%～0.49%，均小于2.0%，表明該方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。

2.4? 特征圖譜的建立及共有峰指認(rèn)

取15批復(fù)方羅漢果清肺糖漿樣品適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進(jìn)行分析、比較，經(jīng)多點校正和自動匹配后，生成對照特征圖譜。共標(biāo)定10個共有峰，選定這10個峰進(jìn)行峰匹配，建立復(fù)方羅漢果清肺糖漿HPLC特佂圖譜。

4號峰為木犀草苷峰，出峰時間適中，峰形較好，含量相對較高，故選擇以木犀草苷峰為對照峰，其他9個色譜峰的相對保留時間分別為0.434 5、0.463 1、0.931 2、1.298 5、1.339 1、1.458 5、1.663 0、1.987 1、2.253 4，各共有峰相對保留時間的RSD介于0.09%～0.79%，均小于2.0%。15批復(fù)方羅漢果清肺糖漿樣品HPLC疊加圖見圖1。

2.5? 色譜峰歸屬分析

取本品（批號170206）及苦杏仁、羅漢果、菊花飲片適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，通過各峰的保留時間和紫外吸收光譜對比分析，確定峰的歸屬。10個共有峰中，1號峰來自苦杏仁，2、8號峰來自羅漢果，3、4、5、6、7、9、10號峰來自菊花。色譜圖見圖4。

3? 指標(biāo)成分含量測定

3.1? 溶液的制備

3.1.1? 混合對照品溶液的制備

取木犀草苷對照品、羅漢果皂苷Ⅴ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含木犀草苷0.04 mg、羅漢果皂苷Ⅴ 0.18 mg的混合對照品溶液，即得。

3.1.2? 供試品溶液的制備

取復(fù)方羅漢果清肺糖漿樣品150 mL，加氨水適量，調(diào)pH值至中性。精密量取5 mL，通過MCI GEL CHP 20柱（內(nèi)徑1 cm，柱高10 cm），以水20 mL洗脫，棄去水液，再用30%乙醇15 mL洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用70%乙醇20 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加80%甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

3.1.3? 陰性對照溶液的制備

按復(fù)方羅漢果清肺糖漿處方分別制備不含菊花、羅漢果的陰性樣品，按“3.1.2”項下方法制備，即得。

3.2 ?色譜條件

同“2.1”項下色譜條件，在此條件下，各待測組分與相鄰峰之間的分離度均達(dá)到要求，陰性對照在與各待測組分相同保留時間處均未出現(xiàn)色譜峰，見圖5。

3.3? 方法學(xué)考察

3.3.1? 線性關(guān)系考察

精密吸取“3.1.1”項下混合對照品溶液4、8、10、12、16、20 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得木犀草苷回歸方程Y=136.8X+14.443（r=0.999 8），羅漢果皂苷Ⅴ回歸方程Y=24.072X+2.871 4（r=0.999 8），表明木犀草苷和羅漢果皂苷Ⅴ分別在0.163 2～0.816 0 μg、0.730 8～3.654 0 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

3.3.2? 精密度試驗

取“3.1.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，結(jié)果木犀草苷和羅漢果皂苷Ⅴ峰面積RSD均為0.44%，表明儀器精密度良好。

3.3.3 ?穩(wěn)定性試驗

取“3.1.2”項下供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別在0、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，結(jié)果木犀草苷和羅漢果皂苷Ⅴ峰面積RSD分別為1.26%、0.80%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.3.4? 重復(fù)性試驗

取同一批樣品（批號170206）6份，按“3.1.2”項下方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，每次進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，結(jié)果木犀草苷和羅漢果皂苷Ⅴ峰面積RSD分別為1.28%、0.56%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.3.5? 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的同一批樣品（批號170206）2.5 mL，共6份，分別精密加入一定量木犀草苷和羅漢果皂苷Ⅴ對照品，按“3.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計算加樣回收率，結(jié)果見表1、表2，表明該方法回收率良好。

3.4? 樣品含量測定

取15批復(fù)方羅漢果清肺糖漿樣品，分別按“3.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果表明，不同批次復(fù)方羅漢果清肺糖漿中木犀草苷和羅漢果皂苷Ⅴ含量無明顯差異，見表3。

4? 討論

本研究采用二極管陣列檢測器進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示在210 nm波長處各色譜峰均有較好的吸收，且基線平穩(wěn)。先后考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸等流動相系統(tǒng)，結(jié)果以乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動相梯度洗脫時峰形較好，出峰時間合適。考慮到苦杏仁為方中臣藥，且苦杏仁苷為主要止咳藥效成分，嘗試不同流動相體系、同類型的色譜柱均未能實現(xiàn)苦杏仁苷峰（1號峰）基線分離，結(jié)合文獻(xiàn)報道[11]，干擾成分可能是L-苦杏仁苷（苦杏仁苷的差向異構(gòu)體）。如何使L-苦杏仁苷和D-苦杏仁苷達(dá)到基線分離，尚待進(jìn)一步研究。

供試品溶液制備時，按常規(guī)溶劑提取后直接進(jìn)樣分析，發(fā)現(xiàn)色譜圖中間有信號極強(qiáng)的色譜峰，通過分析證實為制劑中的苯甲酸。故選擇在柱層析前樣品處理時，用堿液調(diào)pH值至中性，使苯甲酸形成鹽，以利于洗脫除去?？疾炝瞬煌愋痛罂孜綐渲珼101、AB-8、NKA-9及MCI GEL CHP 20柱，結(jié)果表明大孔吸附樹脂D101、MCI GEL CHP 20對皂苷類成分分離、純化效果較好。

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（收稿日期：2018-11-27）

（修回日期：2018-12-13;編輯：陳靜）