AMPK抑制TGF-β信號(hào)通路減輕EMT誘導(dǎo)膀胱癌轉(zhuǎn)移機(jī)制研究

孔曉武　丁青　張琦

[摘要] 目的 探討AMPK抑制TGF-β信號(hào)通路減輕EMT誘導(dǎo)膀胱癌轉(zhuǎn)移機(jī)制。 方法 采用Lipofectamine2000介導(dǎo)AMPKα1轉(zhuǎn)染至人膀胱移行上皮癌BIU-87，噻唑藍(lán)（MTT）比色法和AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)shRNA對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的作用。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體外細(xì)胞遷移和侵襲能力。Western blot檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果 轉(zhuǎn)染后的C4-2 DN細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯慢于未轉(zhuǎn)染的BIU-87細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體的C4-2 E細(xì)胞，且在24 h內(nèi)的細(xì)胞凋亡率均明顯高于轉(zhuǎn)染空載體的C4-2 E，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。AMPK抑制TGF-β信號(hào)通路能夠抑制人膀胱移行上皮癌BIU-87細(xì)胞的增殖和侵襲遷移（P<0.05）。同時(shí)，AMPK抑制TGF-β信號(hào)通路下調(diào)N-cadherin 和 Vimentin 蛋白水平，上調(diào)E-cadherin 蛋白表達(dá)。 結(jié)論 AMPK抑制TGF-β信號(hào)通路下調(diào)N-cadherin 和 Vimentin 蛋白水平，上調(diào)E-cadherin 蛋白表達(dá)，減輕EMT誘導(dǎo)膀胱癌轉(zhuǎn)移。

[關(guān)鍵詞] AMPK;TGF-β信號(hào)通路;EMT;膀胱癌;轉(zhuǎn)移

[中圖分類(lèi)號(hào)] R737.14? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）12-0028-04

Mechanism research of AMPK in inhibiting TGF-β signaling pathway and alleviating the metastasis of EMT-induced bladder cancer

KONG Xiaowu1? ?DING Qing2? ?ZHANG Qi2

1.Department of Urology， Zhejiang Provincial People's Hospital Haining Hospital， Haining Central Hospital， Haining 314408， China; 2.Department of Urology， Zhejiang Provincial People's Hospital， Hangzhou 310014， China

[Abstract] Objective To investigate the role of AMPK in inhibiting TGF-β signaling pathway and attenuating EMT-induced bladder cancer metastasis. Methods Lipofectamine2000 was used to mediate AMPKα1 transfection into human bladder transitional cell carcinoma BIU-87. The effect of shRNA on cell proliferation and apoptosis was detected by MTT colorimetric assay and AnnexinV-FITC/PI double staining. Cell scratch assay and Transwell chamber invasion assay were used to detect cell migration and invasion in vitro. The expression of E-cadherin， N-cadherin and Vimentin protein was detected by Western blot. Results The growth rate of C4-2 DN cells after transfection was significantly slower than that of untransfected BIU-87 cells and C4-2 E cells transfected with empty vector， and the apoptosis rate of C4-2 DN cells after transfection was significantly higher than that of C4-2 E cells transfected with empty vector transfection within 24 h， and the difference between groups was statistically significant （P<0.05）. AMPK inhibits proliferation and invasion and migration of human bladder transitional epithelial carcinoma BIU-87 cells by inhibiting TGF-β signaling pathway （P<0.05）. At the same time， AMPK inhibits TGF-β signaling pathway and down-regulates N-cadherin and Vimentin protein levels， and up-regulates E-cadherin protein expression. Conclusion AMPK inhibits TGF-β signaling pathway， down-regulates N-cadherin and Vimentin protein levels， up-regulates E-cadherin protein expression， and reduces EMT-induced bladder cancer metastasis.

[Key words] AMPK; TGF-β signaling; EMT; Bladder cancer; Metastasis

膀胱癌為泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，根據(jù)浸潤(rùn)程度不同分為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌兩種。相關(guān)研究[1]結(jié)果顯示，肌層浸潤(rùn)性膀胱癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移程度高，病情進(jìn)展快，5年存活率低于10%。因該類(lèi)癌癥的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程極為復(fù)雜，涉及多種抑癌基因及通路的抑制與激活情況[2]。故研究這些基因以及其中通路因子對(duì)癌癥發(fā)生、轉(zhuǎn)移的影響，對(duì)癌癥的治療以及預(yù)防具有一定意義。上游蛋白激酶（AMPK）是公認(rèn)的具有抑癌功能的功能性物質(zhì)，因腫瘤組織微環(huán)境或基因突變所致的AMPK活性下降是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[3]。以往研究[4]表明，AMPK通過(guò)限制細(xì)胞周期檢查點(diǎn)或能量瓶頸，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制增殖。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β（TGF-β）信號(hào)的過(guò)度活躍則是腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的誘因，TGF-β通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移[5-6]。但目前有關(guān)過(guò)度活躍的TGF-β 信號(hào)與AMPK活性下降是否有關(guān)，以及激活A(yù)MPK對(duì)TGF-β 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、EMT、腫瘤轉(zhuǎn)移的作用均鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)考察AMPK對(duì)TGF-β信號(hào)及EMT 標(biāo)志物的影響，探討AMPK抑制TGF-β信號(hào)通路減輕EMT誘導(dǎo)膀胱癌轉(zhuǎn)移機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1 一般材料

2017年9月～2018年5月選用人膀胱移行上皮癌BIU-87，由上海市腫瘤研究所癌基因國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。二甲基亞砜及四甲基偶氮唑藍(lán)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。LipofectamineTM轉(zhuǎn)染劑購(gòu)自LTI公司。培養(yǎng)基、胎牛血清、單克隆抗體Vimentin、N-cadherin、E-cadherin購(gòu)自上?；鶢栴D生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)? 采用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基（含0.1%鏈霉素及青霉素）培養(yǎng)BIU-87為人膀胱移行上皮癌細(xì)胞株，在37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。以不轉(zhuǎn)染AMPKα1人膀胱移行上皮癌BIU-87細(xì)胞為對(duì)照組，以Lipofectamine2000介導(dǎo)AMPKα1轉(zhuǎn)染至人膀胱移行上皮癌BIU-87細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2 AMPK DN細(xì)胞株構(gòu)建? 將AMPKα1亞單位顯性失活突變體（DN）、慢病毒包裝質(zhì)粒、Lipofectamine 2000 按比例均勻滴入BIU-87細(xì)胞培養(yǎng)液，6 h后更換不含上述物質(zhì)的新鮮培養(yǎng)液，孵育過(guò)夜，收集培養(yǎng)液上清，觀察細(xì)胞，上清液濃縮后儲(chǔ)存在-80℃冰箱。此外，將以 Scramble DNA代替目的基因轉(zhuǎn)染BIU-87細(xì)胞，為對(duì)照組（C4-2 E）細(xì)胞。

1.2.3 AMPK DN細(xì)胞株的篩選? 轉(zhuǎn)染72 h后，將1 μg/mL的Puromycin選擇培養(yǎng)液同時(shí)加入至3組細(xì)胞中并進(jìn)行篩選，每隔2 d換液1次，對(duì)AMPK DN基因慢病毒感染 C4-2細(xì)胞進(jìn)行篩選，并構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株（C4-2 DN）。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)? 先用記號(hào)筆每隔 0.5～1.0 cm在6孔板底面劃一橫線進(jìn)行標(biāo)記，隨后每孔加入約5×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜。PBS洗去細(xì)胞碎屑后，每個(gè)孔內(nèi)分別加入含血清、無(wú)血清、含藥物、含 TGF-β1因子的不同培養(yǎng)基，低倍鏡拍照，記錄0 h時(shí)細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)24 h后，再次拍照，計(jì)算遷移速率。

1.2.5 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)? 將2×105個(gè)BIU-87細(xì)胞接種于8 μm 孔徑小室，下室加入含5 ng/mL TGF-β1培養(yǎng)液，上室則加入 10 mM AMPK抑制劑（二甲雙胍）。孵育過(guò)夜后，采用多聚甲醛溶液固定，室溫風(fēng)干，0.1%結(jié)晶紫溶液染色，PBS清洗晾干后，100倍顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.2.6 檢測(cè)細(xì)胞增殖并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線[7]? 將C4-2 E細(xì)胞、C4-2 DN細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染BIU-87細(xì)胞分別以每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，并設(shè)不加細(xì)胞僅加培養(yǎng)液的試驗(yàn)孔為空白對(duì)照孔。接種2 d后轉(zhuǎn)染，并在轉(zhuǎn)染24 h、48 h以及72 h棄去培養(yǎng)液，測(cè)定OD值。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)率。接種2 d后每天取每種細(xì)胞6孔，通過(guò)四唑鹽比色試驗(yàn)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞活性。在波長(zhǎng)為492 nm下，讀取酶標(biāo)儀上測(cè)定的各孔吸光度（OD）值，最終結(jié)果為6孔平均值，并以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 檢測(cè)細(xì)胞凋亡? 分別于24 h、48 h、72 h 3個(gè)時(shí)相點(diǎn)收集C4-2 DN細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，制成濃度為 5×106/mL的細(xì)胞懸液，加1×105個(gè)細(xì)胞至流式管內(nèi)，PBS洗滌3次，離心取沉淀，加入5 μL的 AnnexinV-FITC和PI，避光室溫放置5 min。60 min內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。PI通過(guò)FL2通道檢測(cè)紅色熒光，AnnexinV-FITC 通過(guò)FL1通道檢測(cè)綠色熒光。若AnnexinV-FITC與PI均為陽(yáng)性，則為壞死細(xì)胞或晚期凋亡細(xì)胞，若AnnexinV-FITC陽(yáng)性，PI陰性則為早期凋亡細(xì)胞，反之為正常細(xì)胞。

1.2.8 實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化? 細(xì)胞經(jīng)處理后用 Trizol 法提取總 RNA，定量后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成 cDNA。隨后通過(guò)實(shí)時(shí)定量 PCR 進(jìn)行擴(kuò)增，并利用BioRad CFX Manager軟件進(jìn)行定量分析。

其中引物序列如下：E-cadherin 正義5'-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3'，反義5'-GGGTGTCGAG-GGAAAAATAGG-3';N-cadherin正義5'-TCAG-GCGTCTGTAGAGGCTT-3'，反義5'-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG-3';Vi-mentin正義5'-GACGCCATCAACACCGAGTT-3'，反義5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3';β-actin正義5'-CATGTACGT-TGCTATCCAGGC-3'，反義5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。

1.2.9 Western blot檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)情況[8]? 將細(xì)胞中的組織蛋白采用蛋白裂解液法進(jìn)行提取，并通過(guò)Western blot法檢測(cè)其中的E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用 SPSS19. 0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

由封三圖6、7可知，轉(zhuǎn)染空載體BIU-87的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與BIU-87細(xì)胞相似，而C4-2 DN細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯慢于未轉(zhuǎn)染的BIU-87細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體的C4-2 E細(xì)胞。BIU-87細(xì)胞生長(zhǎng)7 h細(xì)胞數(shù)為（600.35±121.46），C4-2 DN細(xì)胞生長(zhǎng)7 h細(xì)胞數(shù)為（325.14±102.47），C4-2 E細(xì)胞生長(zhǎng)7 h細(xì)胞數(shù)為（598.77±119.58），三組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.720，P=0.002）。

2.2 不同組細(xì)胞的凋亡

C4-2 DN細(xì)胞在24 h、48 h及72 h細(xì)胞凋亡率均明顯高于轉(zhuǎn)染空載體的C4-2 E的細(xì)胞，且組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)封三圖8、圖1及表1。

2.3 AMPK抑制TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移

進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別給TGF-β1、AMPK 激活劑處理，24 h時(shí)后觀察結(jié)果顯示，AMPK 激活劑處理的劃痕間距明顯寬于TGF-β1 因子刺激組。隨后的transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AMPK 激活劑處理組遷移細(xì)胞數(shù)（0.23±0.02）明顯少于TGF-β1 因子刺激組（0.59±0.11），組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.256，P=0.00），見(jiàn)封三圖9、10。

2.4 AMPK對(duì)膀胱癌細(xì)胞EMT的影響

實(shí)時(shí)定量PCR顯示，AMPK 激活劑處理后細(xì)胞內(nèi)E-cadherin 的 mRNA水平上調(diào)，N-Cadherin和Vimentin的mRNA水平下調(diào)（P<0.05，表2）。此外，通過(guò)Western blot發(fā)現(xiàn)AMPK 激活劑處理后細(xì)胞內(nèi)的N-Cadherin和Vimentin蛋白水平明顯下調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)，見(jiàn)圖2。

3討論

本研究主要比較不同轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組之間的細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染空載體BIU-87的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與BIU-87細(xì)胞相似，而C4-2 DN細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯慢于未轉(zhuǎn)染的BIU-87細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體的C4-2 E細(xì)胞，且C4-2 DN細(xì)胞在24 h細(xì)胞凋亡率均明顯高于C4-2 E細(xì)胞，提示轉(zhuǎn)染AMPK能夠抑制BIU-87細(xì)胞的生長(zhǎng);對(duì)比轉(zhuǎn)染AMPK的C4-2 DN細(xì)胞與僅轉(zhuǎn)染空載體的C4-2 E細(xì)胞兩者生長(zhǎng)情況后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染AMPK的C4-2 DN細(xì)胞生長(zhǎng)速率明顯低于僅轉(zhuǎn)染空載體的C4-2 E細(xì)胞，在24 h凋亡率均明顯高于轉(zhuǎn)染空載體C4-2 E細(xì)胞，進(jìn)一步驗(yàn)證了抑制BIU-87細(xì)胞生長(zhǎng)的因素是AMPK，而不是載體Lipofectamine2000。分析AMPK抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制，可能與以下機(jī)制有關(guān)：（1）AMPK 具有抑制TSC2-mTOR蛋白合成，間接地抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的功能[9-10];（2）AMPK 通過(guò)調(diào)節(jié) p53-p21表達(dá)，從而平衡細(xì)胞的增殖與凋亡，調(diào)控細(xì)胞周期[11];（3）AMPK通過(guò)上調(diào)p53蛋白水平，阻斷細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[12-13];（4）AMPK能夠抑制TGF-β誘導(dǎo)的Smad2/3磷酸化，阻斷Smad2/3核定位[14]，從而阻礙腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

為進(jìn)一步探討AMPK與TGF-β 信號(hào)通路間的關(guān)系，本研究分別給TGF-β1、AMPK 激活劑處理BIU-87細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞劃痕試驗(yàn)，結(jié)果顯示，AMPK激活劑處理的劃痕間距明顯寬于TGF-β1因子刺激組，提示AMPK對(duì)于細(xì)胞遷移的抑制作用與TGF-β信號(hào)通路有關(guān)。而Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，AMPK激活劑處理組遷移細(xì)胞數(shù)明顯少于TGF-β1因子刺激組（P<0.05）。經(jīng)Lin H等[14]研究證實(shí)，AMPK 可通過(guò)抑制 Smad2/3 靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄，從而降低TGF-β促轉(zhuǎn)移作用。

EMT是由上皮細(xì)胞變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程，參與腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處遷移和局部浸潤(rùn)。既往研究[15-17]表明，腫瘤細(xì)胞通過(guò) EMT獲取間質(zhì)細(xì)胞的侵襲性，從而浸潤(rùn)至相鄰組織，最終形成腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。此外，EMT過(guò)程中MMPs、N-cadherin、纖維連接蛋白（Fi-bronectin）、波形蛋白（Vimentin）等間質(zhì)細(xì)胞因子表達(dá)增加，E-鈣黏著蛋白（E-cadherin）的合成受到抑制，細(xì)胞極性降低，緊密連接破壞，間質(zhì)特征增強(qiáng)[18]。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AMPK激活劑處理后細(xì)胞內(nèi)的N-cadherin和Vimentin蛋白水平明顯下調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)，提示AMPK具有抑制EMT進(jìn)程的能力。由于TGF-β/Smad信號(hào)通路是誘導(dǎo)EMT的關(guān)鍵通路[19]，AMPK能夠阻斷TGF-β/Smad信號(hào)通路，因此也能夠抑制EMT進(jìn)程，從而影響上皮細(xì)胞特征標(biāo)志物（N-cadherin、Vimentin、E-cadherin等）的表達(dá)。Bays JL等[20]發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)AMPK的活性，能夠明顯降低N-Cadherin和Vimentin蛋白水平，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，降低腫瘤細(xì)胞的惡性程度。

綜上所述，AMPK活性大小與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，其在人體內(nèi)的表達(dá)缺失、突變或許是膀胱癌早期癌變的預(yù)兆，AMPK通過(guò)抑制TGF-β信號(hào)通路減輕EMT誘導(dǎo)膀胱癌轉(zhuǎn)移，有望成為膀胱癌未來(lái)診斷以及治療的潛在靶標(biāo)，為疾病的治療提供新思路。

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