Lgr5、TFF2在萎縮性胃炎及低級別上皮內(nèi)瘤變中的表達及臨床意義

文娜　胡運蓮

[摘要] 目的 探討Lgr5、TFF2在萎縮性胃炎、低級別上皮內(nèi)瘤變中的表達及臨床意義。 方法 隨機選取2018年1～6月在湖北省中醫(yī)院病理科確診為萎縮性胃炎的胃鏡活檢蠟塊30例、低級別上皮內(nèi)瘤變的20例，采用免疫組織化學實驗檢測Lgr5、TFF2蛋白表達情況。 結(jié)果 Lgr5、TFF2蛋白表達均為陽性，Lgr5在低級別上皮內(nèi)瘤變中的表達水平高于萎縮性胃炎，但兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;TFF2在低級別上皮內(nèi)瘤變中的表達水平低于萎縮性胃炎，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結(jié)論 Lgr5、TFF2的表達與胃癌前病變的病理嚴重程度相關，可作為潛在預測胃癌發(fā)生、發(fā)展、預后的重要生物學標記。

[關鍵詞] Lgr5;TFF2;萎縮性胃炎;低級別上皮內(nèi)瘤變;胃癌前病變

[中圖分類號] R573.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）12-0020-04

Expression and clinical significance of Lgr5 and TFF2 in atrophic gastritis and low-grade intraepithelial neoplasia

WEN Na1 HU Yunlian2

1.Hubei University of Traditional Chinese Medicine， Wuhan 430061， China; 2.Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Wuhan 430061， China

[Abstract] Objective To explore the expression and clinical significance of Lgr5 and TFF2 in atrophic gastritis and low-grade intraepithelial neoplasia. Methods Thirty gastroscopic biopsy waxes diagnosed as atrophic gastritis and 20 waxes of low-grade intraepithelial neoplasia treated in our hospital from January to June 2018 were randomly selected. Immunohistochemistry was used to detect the expression of Lgr5 and TFF2 proteins. Results The expression of Lgr5 and TFF2 protein were positive. The expression level of Lgr5 in low-grade intraepithelial neoplasia was higher than that in atrophic gastritis， but there was no significant difference between the two groups（P>0.05）. The expression level of TFF2 in low-grade intraepithelial neoplasia was lower than that in atrophic gastritis， and the difference was significant （P<0.05）. Conclusion The expression of Lgr5 and TFF2 is related to the pathological severity of gastric precancerous lesions， and can be used as an important biomarker for predicting the occurrence， development and prognosis of gastric cancer.

[Key words] Lgr5; TFF2; Atrophic gastritis; Low-grade intraepithelial neoplasia; Gastric precancerous lesions

胃癌是世界范圍內(nèi)高發(fā)病率、高死亡率的癌癥之一，盡管有先進的診斷工具和治療方法，其5 年生存率仍低于30%[1]。腸型胃癌的發(fā)病是多因素、多步驟的病理過程，目前認可的病理變化是：慢性淺表性胃炎→慢性萎縮性胃炎→腸上皮化生→上皮內(nèi)瘤變→腸型胃癌，其中萎縮性胃炎是癌前疾病，而腸化、上皮內(nèi)瘤變是癌前病變。近年來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤可能起源于干細胞，胃腸道干細胞是存在于胃腸道組織中的成體干細胞，能分化形成各種胃腸道上皮細胞，目前可通過識別細胞表面標志物如CD44、CD133、TFF2、Lgr5等方法研究胃癌及癌前狀態(tài)的相關分子表達水平。本次實驗擬通過檢測Lgr5、TFF2在萎縮性胃炎、低級別上皮內(nèi)瘤變中的表達情況，來推測Lgr5、TFF2蛋白表達與胃癌發(fā)生的關系，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源

標本來自病理科2018年1～6月湖北省中醫(yī)院病理科歸檔的蠟塊，隨機法從中選出病理診斷為萎縮性胃炎的病例30例，其中男16例，女14例，年齡25～68歲，平均（51.5±8.13）歲;低級別上皮內(nèi)瘤變病例20例，其中男10例，女10例，年齡24～73歲，平均（51.7±11.3）歲;每個指標每例1張，共計50*2張，每例標本均經(jīng)本院資深的病理醫(yī)師行病理學診斷，病理資料齊全。

1.2 方法與試劑

DAB濃縮型試劑盒、蘇木素、中性樹膠均購自bioswamp公司，Lgr5多克隆兔抗體（工作濃度1：25）、TFF2多克隆兔抗體（工作濃度1：40）均購自Abcam公司。Lgr5陽性信號定位在細胞質(zhì)和細胞核，TFF2陽性信號定位在細胞質(zhì)和（或）細胞核。

1.3主要儀器

OLYMPUS正置顯微鏡、移液器、恒溫烘箱、石蠟切片機、攤片機、IMS圖像分析系統(tǒng)。

1.4免疫組織化學染色

采用免疫組化SP法，抗原修復采用高壓熱修復。每組染色均以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知的陽性組織作為陽性對照。具體實驗步驟如下：4 μm厚的石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、0.01 M檸檬酸鈉緩沖溶液高壓修復、3% H2O2室溫孵育阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS緩沖液沖洗。滴加一抗，4℃冰箱過夜，滴加二抗室溫孵育，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，光鏡下觀察結(jié)果。

1.5結(jié)果判定

由2位病理科醫(yī)師在未知臨床病理資料下讀取結(jié)果，并協(xié)商取得統(tǒng)一。判定方法參考黃江龍等[2]、江曉紅等[3]等采用的方法。Lgr5陽性定位為細胞質(zhì)和細胞核，以細胞核為主，有棕褐色或棕黃色著色者為陽性，TFF2陽性定位為細胞質(zhì)和（或）細胞核，以細胞核為主，有棕褐色或棕黃色著色者為陽性。先按染色強度計分，0分為無色，1分為淺黃色，2分為黃色，3分為深黃色;高倍鏡下隨機選取5個鏡野，計算500個細胞，按陽性細胞數(shù)占所計數(shù)的同類細胞數(shù)的比率，將結(jié)果分為4個等級，0級為陰性，計0分，1級為陽性細胞<20%，計1分，2級為陽性細胞20%～50%，計2分，3級為陽性細胞>50%，計3分;最后根據(jù)染色強度與陽性細胞比率等級的乘積分，為陰性0分（-），1～2分弱陽性（+），3～6分中度陽性（++），7～9分強陽性（+++）。

1.6 統(tǒng)計學方法

應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件，用秩次表示Lgr5、TFF2蛋白在不同胃黏膜中表達強度，等級資料采用非參數(shù)Wilcoxon mann-Whitney U秩和檢驗，檢驗水準為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Lgr5、TFF2蛋白的表達與胃黏膜病變的關系

Lgr5的反應物呈黃色或棕黃色，主要位于細胞核，萎縮性胃炎、低級別上皮內(nèi)瘤變中Lgr5的表達見封三圖1、2，兩者比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.49>0.05），見表1;TFF2的反應物呈黃色或棕黃色，位于細胞核、細胞質(zhì)，主要在細胞核，TFF2在萎縮性胃炎、低級別瘤變中的表達見封三圖3、4，兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.03<0.05）。見表2。

2.2 不同胃黏膜中Lgr5、TFF2蛋白的表達強度與性別、年齡的關系

萎縮性胃炎、低級別上皮內(nèi)瘤變中Lgr5、TFF2蛋白的表達與年齡、性別的關系比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表3～6。

3討論

富含亮氨酸重復序列的 G 蛋白偶聯(lián)受體5（Lgr5）是由18個富含亮氨酸的重復單位和 7個跨膜區(qū)域組成的G 蛋白偶聯(lián)受體，其分布廣泛，在大腦、脊髓、乳腺、毛囊、眼睛、生殖器官及胃腸道等均有表達[4-7]，已有研究發(fā)現(xiàn)Lgr5為Wnt信號通路的下游靶向基因，可作為胃、腸、毛囊等部位的干細胞標記物[8];體內(nèi)的細胞譜系示蹤技術和體外培養(yǎng)系統(tǒng)研究[9]表明Lgr5+細胞是局限于胃竇腺體基底部的成體干細胞，是胃黏膜上皮更新的源泉，可維持正常數(shù)量的胃黏膜上皮細胞及腺體，提示Lgr5是胃多能干細胞的標志物。研究發(fā)現(xiàn)在新生的胃中，Lgr5主要在胃體及幽門腺體底部表達，但在成熟的胃中，Lgr5局限于幽門腺體底部[9-10]。在病理狀態(tài)下，如淺表性胃炎、胃潰瘍、胃癌中Lgr5的表達部位分別是在黏液頸區(qū)域、管腔表面、腫瘤中央和侵襲部位前面[11];研究發(fā)現(xiàn)Lgr5與多種癌癥相關，如結(jié)直腸癌[12]、原發(fā)性肝癌[13]、胃腺癌[2]、子宮頸鱗狀細胞癌[14]。Xiu-Bin Li等[15]發(fā)現(xiàn)胃Lgr5+干細胞是致癌細胞，并可能作為癌癥傳播細胞，使之惡化。本研究發(fā)現(xiàn)Lgr5在萎縮性胃炎中主要表達于胃小凹及萎縮區(qū)域附近的腺體;在低級別上皮內(nèi)瘤變中主要表達于腺體底部，且腺腔基底側(cè)的染色強度高于腔面?zhèn)?，兩組比較，Lgr5在低級別上皮內(nèi)瘤變中的表達強度高于萎縮性胃炎，進一步提示Lgr5有促進胃黏膜病變加重的作用，可能是一種促進炎癥發(fā)展的因子，但兩組比較無統(tǒng)計學意義，考慮此次樣本量較少，后續(xù)應增加樣本量，進一步研究Lgr5在不同胃黏膜中的表達情況。

TFF家族成員包括TFF1、TFF2、TFF3，是一種小肽分子，因其形狀類似三葉草，故稱為TFF，其中TFF2在胃、十二指腸特異性表達，具有減少胃酸分泌、與黏液蛋白結(jié)合形成保護屏障、促進損傷組織修復的功能，從而起到保護胃黏膜的作用。生理情況下TFF2主要表達于胞質(zhì)，在胃黏膜上皮、表面黏液層、胃腺細胞和胃小凹中可見，病理情況下如消化性潰瘍、胃癌時，TFF2分別在胃潰瘍的基底部及邊緣，慢性萎縮性胃炎的黏膜表面、萎縮腺體及腸上皮化生的周圍表達增強[16]。當損傷因子加重，或保護因子減少，則黏膜進一步受損。周學文等[17]發(fā)現(xiàn) TFF2的表達在淺表性胃炎中低、在糜爛性胃炎中次低，在胃潰瘍中最低，病情輕重程度與TFF2的表達呈負相關，說明TFF2可作為一種保護性因子。宋潔等[18]發(fā)現(xiàn)正常胃黏膜組織中 TFF2為陽性表達，表達率為100%，而在腸化生、異型增生以及胃癌組織中，其陽性表達率依次逐漸下降。

本次研究發(fā)現(xiàn)TFF2在萎縮性胃炎中主要表達于腺體底部，靠近萎縮區(qū)域;在低級別上皮內(nèi)瘤變中主要表達于腺體頸部，腺腔基底側(cè)的染色強度高于腔面?zhèn)?兩組比較，TFF2在萎縮性胃炎中的表達強度高于低級別上皮內(nèi)瘤變，且有統(tǒng)計學意義。此次研究提示TFF2可作為胃黏膜的保護因子，或許在胃黏膜病變時可給予外源性TFF因子以利于胃黏膜的修復。

綜上所述，通過本次研究發(fā)現(xiàn)Lgr5、TFF2在萎縮性胃炎、低級別上皮內(nèi)瘤變中的表達情況不同，一方面間接驗證了Correa級聯(lián)學說的部分內(nèi)容;另一方面有助于臨床上更準確的判斷癌前病變嚴重性及預后，也為研究治療腫瘤的靶向藥物提供了新的思路。但本次實驗樣本量偏少，且因使用的是胃黏膜活檢蠟塊，取材淺，黏膜各層次無法全部展示，后續(xù)實驗擬增加樣本量，或進行動物實驗，以進一步明確Lgr5、TFF2在不同胃黏膜中的表達情況及其臨床意義。

[參考文獻]

[1] Li M，Zhang B，Zhang Z，et al. Stem cell-like circulating tumor cellsindicate poor prognosis in gastric cancer[J]. Biomed Res Int，2014，2014：981261.

[2] 黃江龍，魏波，鄭宗珩，等. 干細胞標記物Lgr5在胃癌組織中的表達及臨床意義[J]. 中華普通外科學文獻（電子版），2016 ，10（6）：406-409.

[3] 江曉紅，張燕萍.Lgr5在子宮頸鱗狀細胞癌中的表達及其與預后的相關性[J].臨床與實驗病理學雜志，2016， 32（3）：323-325.

[4] Plaks V，Brenot A，Lawson DA，et al.Lgr5-expressingcells are sufficient and necessary for postnatal mammarygland organogenesis[J]. Cell Rep，2013，3（1）：70-78.

[5] Mardaryev AN，Meier N，Poterlowicz K，et al.Lhx2 dif-ferentially regulates Sox9，Tcf4 and Lgr5 in hair folliclestem cells to promote epidermal regeneration after injury[J]. Development，2011，138（22）：4843-4852.

[6] Nakata S，Campos B，Bageritz J，et al. LGR5 is a markerof poor prognosis in glioblastoma and is required for survival of brain cancer stem-like cells[J]. Brain Pathol，2013，23（1）：60-72.

[7] De Visser KE，Ciampricotti M，Michalak EM，et al. Developmental stage-specific contribution of LGR5+cells tobasal and luminal epithelial lineages in the postnatal mam-mary gland[J].J Pathol，2012，228（3）：300-309.

[8] Gong，Xing，Azhdarinia，A，Ghosh Sukhen C，et al.Lgr5-Targetef Antibody-Drug Conjugate Eradicates Gastrointestinal Tumors and Prevents Recurrence[J]. Mol Cancer Ther，2016，15（7）：1580-1590.

[9] Barker N，Huch M，Kujala P，et al.Lgr5（+ve） stem cells drive selfrenewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro[J]. Cell Stem Cell，2010，6（1）：25-36.

[10] Brabletz S，Schmalhofer O，Brabletz T. Gastrointestinal stem cells indevelopment and cancer[J].J Pathol，2009，217（2）：307-317.

[11] Simon E，Petke D，Bger C，et al.The spatial distribution of LGR5+ cells correlates with gastric cancer progression[J]. PLo S One，2012，7（4）：e35486.

[12] 劉麗娜，殷云勤，張兆美，等. AGR2、Lgr5在結(jié)直腸癌中的表達及其臨床意義[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生，2014，52（14）：8-12.

[13] 鄒來賓，王健，吳佳勉，等. LGR5參與了肝癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[J]. 嶺南現(xiàn)代臨床外科，2017， 17（3）：278-283.

[14] 錢萍，高寶蓮. 子宮頸鱗狀細胞癌中Lgr5的表達及其臨床意義[J]. 臨床與實驗病理學雜志，2017，33（1）：42-45.

[15] Xiu-Bin Li，Guan Yang，Liang Zhu，et al. Gastric Lgr5+ stem cells are the cellular origin of invasive intestinal-type gastric cancer in mice[J]. Cell Res，2016，26（7）：838-849.

[16] 侯亮，榮芳. 三葉因子Ⅱ在不同胃黏膜病變中的表達及意義[J]. 長治醫(yī)學院學報，2010，24（1）：13-15.

[17] 周學文，周天羽，才麗萍，等. 三葉因子2在胃黏膜病變中的表達[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2010，18（2）：95-97.

[18] 宋潔，郭瑞芳，蘇日拉，等. TFF2、CLDN18、MUC5AC蛋白在胃黏膜病變過程中的表達變化及其臨床意義[J].胃腸病學，2015，20（7）：394-397.

（收稿日期：2018-11-05）