新疆塔城地區(qū)傳統(tǒng)酸馬奶中Lactobacillus的分離鑒定及其耐藥譜分析

高璇 羅寶龍 張艷

摘要 [目的]通過對(duì)新疆塔城地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶中Lactobacillus的分離鑒定和耐藥譜分析，確定乳桿菌組成及其安全性。[方法]采用梯度稀釋涂平板法分離，結(jié)合生理生化、屬引物和16S rRNA基因擴(kuò)增進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]從7份傳統(tǒng)酸馬奶中鑒定得到20株乳桿菌，L.plantarum為優(yōu)勢(shì)種。所有菌株對(duì)萬古霉素具有耐受性，多重耐藥菌株占85%。[結(jié)論]傳統(tǒng)酸馬奶中蘊(yùn)含優(yōu)良的微生物菌種資源，值得進(jìn)一步研發(fā)和保護(hù)。

關(guān)鍵詞 酸馬奶;乳桿菌;鑒定;耐藥譜

中圖分類號(hào) TS207.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）10-0144-03

Abstract [Objective] The composition and safety of Lactobacillus were determined by the isolation，identification and drug resistance spectrum analysis of Lactobacillus in traditional fermented koumiss in Tacheng area of Xinjiang.[Methods]The Lactobacillus were separated by gradient dilution coating plate method and combined with physiological and biochemical test， genusspecific primers amplification， and 16S rRNA gene amplification.[Results] Twenty strains of Lactobacillus were isolated from 7 samples， and L. plantarum was the dominant species. All strains were resistant to vancomycin， and multidrug resistant strains accounted for 85%. [Conclusion] Traditional fermented koumiss contains excellent microbial resources and is worthy of further research and development.

Key words Koumiss;Lactobacillus;Identification;Drug resistant spectrum

我國(guó)新疆塔城地區(qū)哈薩克族、維吾爾族、蒙古族等少數(shù)民族具有悠久的游牧歷史，擁有眾多具有民族特色的傳統(tǒng)乳品。其中，傳統(tǒng)酸馬奶因其特有風(fēng)味、口感及豐富的營(yíng)養(yǎng)和保健作用，深受人們喜愛。傳統(tǒng)的酸馬奶通常是在夏天將剛擠出的新鮮馬奶倒入皮囊中，加入適量自留的發(fā)酵引子，攪拌均勻后密封、保溫存放，每天不定時(shí)的攪拌，發(fā)酵數(shù)日即可[1]。這種傳統(tǒng)的發(fā)酵過程在酸馬奶中自然的篩選、富集了具有地理、環(huán)境、氣候、民俗等特征的土著性微生物，為工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵乳制品及益生菌產(chǎn)品提供了寶貴的菌種資源[2]。然而，受牧區(qū)衛(wèi)生條件的限制，人、畜常用的青霉素、卡那霉素、萬古霉素等抗生素藥殘?jiān)谒w、排泄物、土壤之間循環(huán)，產(chǎn)生了獲得性耐藥微生物，引起了微生物的耐藥基因不斷傳播和富集，對(duì)人類臨床疾病的治療和傳統(tǒng)發(fā)酵乳品的安全性造成了很大的影響[3]。因此，優(yōu)良微生物資源的開發(fā)及其安全性評(píng)估顯得非常有必要。該研究通過對(duì)新疆塔城地區(qū)傳統(tǒng)酸馬奶樣品中乳桿菌的分離、鑒定及其菌株耐藥譜分析，為乳桿菌資源的開發(fā)和乳品生物安全性評(píng)估提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

7份傳統(tǒng)酸馬奶樣品采集自額敏縣（Em）、和布克賽爾縣（Hb）、塔城市（Tc）、托里縣（Tl）;乳酸桿菌選擇性瓊脂（LSA）、MRS培養(yǎng)基生物純?cè)噭┵?gòu)自青島

海博生物技術(shù)有限公司;Pre-Mix購(gòu)自TaKaRa公司;PCR引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成;抗生素紙片（氯霉素，C30;環(huán)丙沙星，CIP5;慶大霉素，CN10;紅霉素，E15;卡那霉素，K30;新霉素，N30;青霉素G，P10;利福平，RD5;鏈霉素，S10;四環(huán)素，TE30;萬古霉素，VA30）為英國(guó)的Oxoid;其余分析純?cè)噭┵?gòu)自天津市化學(xué)試劑三廠。模式菌株為L(zhǎng).plantarum CGMCC1.7487、L.raffinolactis CGMCC1.1935、L.casei CGMCC1.575。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀為德國(guó)Biometra公司Tprofessional;凝膠成像系統(tǒng)為法國(guó)Vilber多功能成像系統(tǒng);水平電泳儀為美國(guó)Bio-Rad公司PowerPac Universal。

1.3 方法

1.3.1 分離純化。

移取10 mL樣品于90 mL無菌生理鹽水，振蕩混勻。采用梯度稀釋法，取10-2、10-3、10-4各100 μL分別在LSA、MRS培養(yǎng)基上涂布，37 ℃培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等表面特征差異隨機(jī)挑取10個(gè)不同的單菌落在相應(yīng)的培養(yǎng)基上純化3次后接種至MRS肉湯37 ℃富集24 h，補(bǔ)充25%的滅菌甘油冷凍保藏在-80 ℃[4]。

1.3.2 初篩。

參考東秀珠等[5]的方法，純培養(yǎng)物通過革蘭氏染色和接觸媒試驗(yàn)的初步篩選，將篩選到的G+、接觸酶陰性、細(xì)胞形態(tài)為桿狀的菌株作為疑似乳桿菌進(jìn)一步鑒定。

1.3.3 菌株屬水平PCR擴(kuò)增。

參考Justé等[6]的方法提取初篩菌株的基因組DNA保存于-20 ℃。

參考文獻(xiàn)[7]，選用乳桿菌屬特異性引物L(fēng)bLMA1-rev（5'-CTTGAGAGTTTGATCCTGG-3'）、R16-1（5'-CTCAAAACTAAACAAAGTTTC-3'）進(jìn)行擴(kuò)增，以標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽(yáng)性對(duì)照，目標(biāo)片段大小約200 bp。其PCR擴(kuò)增體系：Pre-Mix 12.5 μL，引物（20 μmol/L）各1 μL，DNA約50 ng，ddH2O補(bǔ)足25 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，4.5 V/cm電泳1.5 h，使用Vilber多功能成像系統(tǒng)對(duì)電泳凝膠進(jìn)行成像分析。

1.3.4 乳桿菌16S rRNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析。

將乳桿菌屬特異性PCR擴(kuò)增結(jié)果呈陽(yáng)性的菌株，采用細(xì)菌通用引物27F、1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增[8]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，由生工生物工程（上海）股份有限公司純化后進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST在線分析，下載GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性達(dá)到98%以上的基因序列，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。用ClustalX 1.83軟件將序列進(jìn)行排列[9]，用鄰接法neighbor-joining method計(jì)算進(jìn)化距離，距離模型采用P-distances法和Kimura-2parameter雙參數(shù)法進(jìn)行，進(jìn)化樹分支模式的穩(wěn)定性用MEGA 5.0[10]軟件分析，可靠性驗(yàn)證采用Bootstrap法，重復(fù)次數(shù)為1 000。

1.3.5 耐藥譜。

參考賈麗艷[11]的方法，將篩選的乳桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，調(diào)整菌液濃度為（2.0～2.5）×108 CFU/mL，移取200 μL，用無菌棉簽將菌液涂布于MRS培養(yǎng)基。將抗生素紙片分別等距貼于平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，利用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑。每種紙片3個(gè)平行，結(jié)果求平均值。參考臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）制定的《抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》分析菌株的耐藥性[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離、初步鑒定

將7份樣品處理后從2種培養(yǎng)基中共分離到135株疑似乳桿菌純培養(yǎng)物。通過革蘭氏染色、鏡檢，篩選到59株細(xì)胞形態(tài)為桿狀、G+菌株，其中41株接觸媒試驗(yàn)呈陰性。菌落顏色主要有乳白色、白色、乳黃色，菌落大部分中部凸起，表面濕潤(rùn)。在液體富集時(shí)，培養(yǎng)基底部有沉淀，越靠上培養(yǎng)基越澄清，表明菌株嗜好低濃度氧的環(huán)境。

2.2 乳桿菌屬特異性PCR擴(kuò)增

41株初步篩選的疑似乳桿菌經(jīng)屬特異性引物PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，條帶大小與模式菌株一致且符合目標(biāo)片段的菌株共有20株（圖1）。

2.3 乳桿菌16S rRNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過對(duì)20株菌株進(jìn)行16S rRNA基因的擴(kuò)增、測(cè)序后得到菌株序列，通過Blast工具在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與已發(fā)表的16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性比較，選取相似性在98%以上的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），由系統(tǒng)發(fā)育樹可知20株菌株均為L(zhǎng)actobacillus，包括L.plantarum、L.fermentum、L.acidophilus、L.casei、L.paracasei共5個(gè)種。其中Hb1-M-6、Hb1-L-1、Hb3-M-7、Tc-L-10、Tl1-L-6、Tl2-M-7、Tl2-L-9、Tl2-M-6的序列與L.plantarum的相似性達(dá)100%;Hb1-M-1、Hb2-M-1、Hb2-L-4、Tc-L-6、Tl1-M-10的基因序列與L.fermentum的相似性高于98%;Hb1-M-5、Hb2-L-3、Hb3-M-4、Hb3-M-8與已知的L.acidophilus的相似性均達(dá)99%;Em-L-9、Tl1-L-3與L.casei的相似性為99%，Tl1-L-5與L.paracasei的序列相似性為100%。

2.4 耐藥譜

20株Lactobacillus對(duì)11種常用抗生素的耐藥性統(tǒng)計(jì)如圖3，所有菌株對(duì)萬古霉素（VA30）具有耐受性，16株乳桿菌對(duì)卡那霉素（K30）具有耐受性，所有菌株對(duì)利福平（RD5）敏感。85%的菌株表現(xiàn)為多重耐藥（MDR），耐受5、6種抗生素的菌株分別占35%、20%，菌株Tl1-L-3對(duì)7種抗生素具有耐受性。

3 討論與結(jié)論

近年來，土著性優(yōu)勢(shì)微生物資源的開發(fā)受到國(guó)內(nèi)廣大學(xué)者的關(guān)注，尤其以Lactobacillus、Bifidobacterium、Bacillus等益生菌為主。我國(guó)新疆具有悠久的游牧歷史，傳統(tǒng)的發(fā)酵乳品種類繁多，發(fā)酵制品中包含了大量的土著性微生物，是優(yōu)良菌種研發(fā)的一個(gè)重要資源庫(kù)。該研究通過屬特異性引物PCR擴(kuò)增，結(jié)合16S rRNA基因測(cè)序，從7份傳統(tǒng)酸馬奶中分離、鑒定得到20株乳桿菌，包括5個(gè)種。其中，植物乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌種占40%，發(fā)酵乳桿菌和嗜酸乳桿菌分別為25%、20%，干酪乳桿菌分離到2株（10%），副干酪乳桿菌只有1株（5%）。孫天松等[13]的研究中瑞士乳桿菌為優(yōu)勢(shì)種，其次為嗜酸乳桿菌;孟和畢力格等[14]從內(nèi)蒙古采集的酸馬奶中干酪乳桿菌最多占32%，嗜酸乳桿菌占20%，植物乳桿菌8株占16%;張明珠[15]從烏魯木齊市郊采集的樣品中分離得到干酪乳桿菌占15.8%。相比發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)、不同研究中乳桿菌在種水平上的組成比例相差較大，這是由于地域、自然環(huán)境、季節(jié)等差異導(dǎo)致酸馬奶營(yíng)養(yǎng)成分、發(fā)酵條件不同。同時(shí)，不同地區(qū)、家庭、民族的制作方法、發(fā)酵引子、衛(wèi)生習(xí)慣存在很大差異，從而導(dǎo)致微生物組成存在差異[16]。

微生物菌株對(duì)抗生素的敏感性是篩選益生菌和發(fā)酵劑時(shí)需首要考慮的安全特性[17]。該研究從7份傳統(tǒng)酸馬奶樣品中分離的20株Lactobacillus均對(duì)萬古霉素耐藥，最多耐受7種抗生素，多重耐藥率達(dá)85%。大量的研究報(bào)道了乳桿菌對(duì)萬古霉素具有天然耐受性[18-19]，張愛民[20]、梁萌萌等[21]的研究結(jié)果與該研究較為接近。

新疆塔城地區(qū)傳統(tǒng)酸馬奶中Lactobacillus資源豐富，大量的菌株具有多重耐藥性，優(yōu)良菌株的開發(fā)和保護(hù)迫在眉睫。

參考文獻(xiàn)

[1] 額爾登孟克，潘琳，阿木爾圖布興，等.傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品酸馬奶的研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，37（2）：134-140.

[2] 孔杭如，唐善虎，胡洋，等.酸馬奶研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2016，44（5）：32-35.

[3] BERENDS B R，VAN DEN BOGAARD A E，VAN KNAPEN F，et al.Human health hazards associated with the administration of antimicrobials to slaughter animals.Part I.An assessment of the risks of residues of tetracyclines in pork[J].Veterinary quarterly，2001，23（1）：2-10.

[4] 倪亞雯.新疆北疆地區(qū)自然發(fā)酵乳品中Lactobacillus遺傳差異及益生特性研究[D].石河子：石河子大學(xué)，2016.

[5] 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001：364-398.

[6] JUST A，THOMMA B P H J，LIEVENS B.Recent advances in molecular techniques to study microbial communities in food-associated matrices and processes[J].Food microbiology，2008，25（6）：745-761.

[7] DUBERNET S，DESMASURES N，GUGUEN M.A PCRbased method for identification of lactobacilli at the genus level[J].FEMS Microbiology Letters，2002，214（2）：271-275.

[8] KHALIL E S，ABD MANAP M Y，MUSTAFA S，et al.Probiotic properties of exopolysaccharide-producing Lactobacillus strains isolated from Tempoyak[J].Molecules，2018，23（2）：398-417.

[9] THOMPSON J D，GIBSON T J，PLEWNIAK F，et al.The CLUSTAL_X windows interface：Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic acids research，1997，25（24）：4876-4882.

[10] TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Molecular biology and evolution，2011，28（10）：2731-2739.

[11] 賈麗艷.產(chǎn)類細(xì)菌素菌株的篩選鑒定及類細(xì)菌素的研究[D].太谷：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[12] FALLIS A G.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing，Clinical and Laboratory Standards institute，CLSI[J].Journal of chemical information and modeling，2013，53（9）：1689-1699.

[13] 孫天松，王俊國(guó)，張列兵，等.中國(guó)新疆地區(qū)酸馬奶中乳酸菌生物多樣性研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，2007，34（3）：451-454.

[14] 孟和畢力格，烏日娜，王立平，等.不同地區(qū)酸馬奶中乳桿菌的分離及其生物學(xué)特性的研究[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2004，32（11）：6-11.

[15] 張明珠.新疆酸馬奶中乳酸菌的多態(tài)性分析及發(fā)酵性能研究[J].食品與發(fā)酵科技，2015，51（3）：44-48.

[16] 陸東林，劉朋龍.傳統(tǒng)酸馬奶中的微生物多樣性及其益生作用[J].新疆畜牧業(yè)，2018，33（5）：4-9.

[17] PARK M S，JI G E.Development of probiotics and industrialization[J].Food science and industry，2014，47：19-28.

[18] HUMMEL A S，HERTEL C，HOLZAPFEL W H，et al.Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of lactic acid bacteria[J].Applied & environmental microbiology，2007，73（3）：730-739.

[19] 邵玉宇.干酪乳桿菌和植物乳桿菌耐藥分子機(jī)制的研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[20] 張愛民.不同來源乳酸菌的耐藥性分析及藥敏性乳酸菌的應(yīng)用[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2008.

[21] 梁萌萌，張柏林，趙紫華，等.幾株益生乳桿菌耐藥性的研究[J].河北工業(yè)科技，2011，28（4）：250-253.