甲炔諾酮對斑馬魚胚胎下丘腦-垂體-生長軸基因表達的影響

梁燕秋 岑美祈 李進

摘要 [目的] 研究甲炔諾酮對水生生物的生態(tài)毒理效應。

[方法] 將受精后的斑馬魚胚胎分別暴露在含0、6、45和87 ng/L的甲炔諾酮水環(huán)境中144 h，研究甲炔諾酮對斑馬魚胚胎下丘腦-垂體-生長軸相關基因轉錄表達的影響。[結果] 甲炔諾酮在不同暴露時間點可以調節(jié)生長激素釋放激素（ghrh）、胰島素生長因子1（igf1）和胰島素生長因子2b（igf2b）基因的轉錄表達，可以誘導生長激素（gh）基因的轉錄表達，但會抑制胰島素生長因子1受體b（igf1rb）基因的轉錄表達。此外，甲炔諾酮暴露對生長激素受體（ghra、ghrb）、胰島素生長因子2a（igf2a）和胰島素生長因子1受體a（igf1ra）基因的轉錄表達沒有顯著影響。[結論] 甲炔諾酮能夠改變斑馬魚早期胚胎發(fā)育階段下丘腦-垂體-生長軸相關基因的轉錄表達水平，進而對斑馬魚的生長發(fā)育具有潛在的危險。

關鍵詞 孕激素;甲炔諾酮;下丘腦-垂體-生長軸;基因表達

中圖分類號 S912文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）10-0094-03

Abstract [Objective]To study the ecotoxicological effect of norgestrel on aquatic organisms.[Method]Zebrafish embryos were exposed to 0，6，45 and 87 ng/L norgestrel for 144 h，and the effects of norgestrel on the transcriptional expression of the related genes with the hypothalamicpituitarygrowth axis in zebrafish embryos were studied.[Result]Norgestrel could mediate the transcriptional expression of growth hormonereleasing hormone （ghrh），insulinlike growth factor 1 （igf1） and insulinlike growth factor 2b （igf2b） genes at different exposure time points.Norgestrel exposure could induce the transcriptional expression of growth hormone （gh） gene，but it inhibited the transcriptional expression of insulinlike growth factor 1 receptor，beta （igf1rb） gene.In addition，norgestrel exposure had no significant effect on the transcriptional? expression of target genes associated with growth hormone receptor （ghra，ghrb）， insulinlike growth factor 2a （igf2a） and insulinlike growth factor 1 receptor，alpha （igf1ra） genes.[Conclusion]Norgestrel could? affect the transcriptional expression levels of the related genes with hypothalamicpituitarygrowth axis，so it had potential risks on the growth of zebrafish.

Key words Progestin;Norgestrel;Hypothalamicpituitarygrowth axis;Gene expression

近年來，已有研究報道孕激素在水環(huán)境的污染分布特征，發(fā)現(xiàn)它們廣泛存在于污水處理廠、養(yǎng)殖場和地表水等環(huán)境介質中，濃度范圍從幾納克每升到幾萬納克每升不等[1-2]。其中，甲炔諾酮作為主要的孕激素污染物之一，在地表水中的檢出濃度為22 ng/L[3]。甲炔諾酮也殘留在城市污水處理廠出水中，平均濃度為11 ng/L[4]。另外，在養(yǎng)豬場和奶牛場沖刷水中還檢出相當高濃度的甲炔諾酮，濃度分別為10 800和6 460 ng/L[5-6]。甲炔諾酮在養(yǎng)豬場廢水排放河流中也有檢出，濃度高達465 ng/L[5]。目前報道的孕激素含量往往要比雌激素高出許多倍。然而，關于雌激素的預測無效應濃度有不少學者定為1 ng/L，即當水環(huán)境中雌激素含量大于1 ng/L時會對水生生物產生內分泌干擾效應[7]。因此，環(huán)境中高濃度甲炔諾酮的內分泌干擾效應應該引起高度重視，需要進一步研究。

目前，已有研究報道了孕激素（如黃體酮、左炔諾孕酮、炔諾酮、孕二烯酮、屈螺酮、去氧孕烯、醋酸甲地孕酮和去氫孕酮）在ng/L水平上就能抑制魚的生殖功能[8-14]。Liang等[15]研究表明低濃度的甲炔諾酮沒有抑制斑馬魚的產卵量。但是，長期暴露于低濃度的甲炔諾酮能夠干擾斑馬魚的性別分化，引起更多的雄魚產生[16]。此外，甲炔諾酮還會干擾斑馬魚早期胚胎發(fā)育階段下丘腦-垂體-性腺軸和下丘腦-垂體-甲狀腺內分泌系統(tǒng)[17-18]。然而，目前關于甲炔諾酮對魚類下丘腦-垂體-生長軸的影響尚未見報道。筆者將斑馬魚胚胎暴露于甲炔諾酮144 h，每天測定下丘腦-垂體-生長軸相關基因的轉錄表達水平，進而探討甲炔諾酮對魚類生長軸的潛在風險。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年斑馬魚購自廣州市花鳥魚蟲市場，在實驗室馴養(yǎng)至穩(wěn)定后方可用于試驗。將雌雄斑馬魚進行配對產卵，并將受精卵收集起來，用胚胎培養(yǎng)液沖洗干凈。挑選發(fā)育正常且處于囊胚期（受精后2～4 h）的受精卵用于暴露試驗。

1.2 試驗化合物 試驗所用化合物為甲炔諾酮（norgestrel），純度100%，用無水乙醇將其配制成濃度1 mg/mL的儲備液，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 胚胎暴露試驗設計

甲炔諾酮濃度設置3個名義濃度，分別為5、50和100 ng/L，另設置溶劑對照組。甲炔諾酮處理組和溶劑對照組均含有0.001%的乙醇助溶劑。每個處理組設置4個平行，每個平行放入160個發(fā)育正常且處于囊胚期的胚胎。連續(xù)暴露144 h，在此期間每隔24 h換水1次。暴露期間，將胚胎放入人工氣候箱中培養(yǎng)，溫度保持在（26±1）℃，光暗周期比為14 h：10h。在暴露24、48、72、96、120和144 h時，每個平行隨機挑選15個胚胎/幼體，保存于RNAlater中，用于此后的基因轉錄表達分析。

1.4 基因轉錄表達分析

根據Liang[17-18]的研究方法，對斑馬魚胚胎/幼體進行RNA提取、cDNA合成和實時熒光定量PCR。選取9個與下丘腦-垂體-生長軸相關的基因，檢測了斑馬魚早期發(fā)育階段生長激素釋放激素（ghrh）、生長激素（gh）、生長激素受體（ghra和ghrb）、胰島素生長因子（Igf1、Igf2a和Igf2b）以及胰島素生長因子受體（Igf1ra和Igf1rb）基因的轉錄表達水平。采用β-actin、RpL13α和EF1-α這3個內參基因的平均值對目標基因進行歸一化處理。參照Livak等[19]的2-ΔΔCt方法計算目標基因相對于參照因子（溶劑對照組的樣品）的相對表達量，并以2為底數取對數值。

1.5 暴露水溶液中甲炔諾酮的實測濃度

為了測定甲炔諾酮在暴露水中的實際濃度，需要對溶劑對照組和各處理組水樣進行化學分析，水樣的采集和分析測定參照Liang[17-18]的方法。甲炔諾酮在3個濃度處理組的平均實測濃度為6、45和87 ng/L，而溶劑對照組未檢測到甲炔諾酮[17-18]。以下試驗所有暴露濃度數據都以它們的實測濃度表示。

1.6 數據統(tǒng)計與分析

試驗數據均以平均值±標準差表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，并用OriginPro 2016進行繪圖。采用單因素方差分析方法（ANOVA）中的Tukey多重比較法檢驗不同濃度組各個基因的轉錄表達差異。

2 結果與分析

2.1 不同濃度甲炔諾酮暴露對斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中

2.2 不同濃度甲炔諾酮暴露對斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中生長激素（gh）及其受體（ghra和ghrb）基因轉錄表達的影響

2.3 不同濃度甲炔諾酮暴露對斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中胰島素生長因子（Igf1、Igf2a和Igf2b）及其受體（Igf1ra和Igf1rb）基因轉錄表達的影響 從圖3可以看出，6 ng/L甲炔諾酮暴露24 h提高了igf1基因的轉錄表達，而45 ng/L甲炔諾酮暴露72 h抑制了其轉錄表達水平。45和87 ng/L的甲炔諾酮分別暴露72和144 h降低了igf2b基因的轉錄表達水平，但暴露120 h提高了其轉錄水平。此外，6、45和87 ng/L的甲炔諾酮分別暴露72和144 h抑制了igf1rb基因的轉錄表達水平。然而，甲炔諾酮的暴露對igf2a和igf1ra基因的轉錄表達沒有產生影響。

3 討論

魚類的生長發(fā)育主要與下丘腦-垂體-生長軸的調控有關，生長激素釋放激素（growth hormonereleasing hormone，GHRH）、生長激素（growth hormone，GH）、生長激素受體（growth hormone receptor，GHR）、胰島素生長因子（insulinlike growth factor，IGF）以及胰島素生長因子受體（insulinlike growth factor receptor，IGFR）在魚類的生長發(fā)育中起到非常重要的作用。其中，下丘腦分泌的GHRH的生理功能是調節(jié)垂體中GH的釋放和合成，而GH是調控魚類生長發(fā)育、繁殖和免疫的重要激素。GH通過與膜上的GHR結合，從而刺激IGF的合成與分泌，進而與IGFR結合來發(fā)揮其生物學效應。該研究結果表明，在斑馬魚早期胚胎發(fā)育階段6 ng/L甲炔諾酮暴露能夠改變下丘腦-垂體-生長軸相關的一些基因的轉錄水平。

甲炔諾酮分別暴露24和144 h對ghrh基因的轉錄水平有促進作用，而甲炔諾酮分別暴露72和96 h則抑制了ghrh基因的轉錄水平，暗示了ghrh基因的轉錄變化是時間依賴模式，可能與發(fā)育階段有關。關于甲炔諾酮這種時間依賴轉錄模式以前已有文獻報道[17-18，20]。通常來說，成魚的生長激素釋放激素（GHRH）主要調節(jié)成年個體大腦中垂體生長激素（GH）的合成和分泌，因此ghrh基因的轉錄表達變化可能會改變GHRH的激素水平，從而調節(jié)GH的合成。該研究發(fā)現(xiàn)甲炔諾酮改變了gh基因的轉錄表達水平。

生長激素（GH）調節(jié)著胰島素生長因子（IGF）的合成和分泌。該研究發(fā)現(xiàn)甲炔諾酮暴露24 h顯著提高了gh基因的轉錄水平，進而可能會干擾GH的合成，從而影響IGF的轉錄表達水平。該研究發(fā)現(xiàn)igf1、igf2b、igf1rb基因的轉錄表達水平在甲炔諾酮的處理下發(fā)生改變。

綜上所述，甲炔諾酮暴露能夠干擾斑馬魚早期胚胎發(fā)育時期下丘腦-垂體-生長軸相關基因的轉錄表達，進而是否會對后期的生長發(fā)育產生影響則需要進一步研究。

參考文獻

[14] ZHAO Y B，CASTIGLIONI S，F(xiàn)ENT K.Synthetic progestins medroxyprogesterone acetate and dydrogesterone and their binary mixtures adversely affect reproduction and lead to histological and transcriptional alterations in zebrafish （Danio rerio）[J].Environmental science & technology，2015，49（7）：4636-4645.

[15] LIANG Y Q，HUANG G Y，LIN Z，et al.Reproductive effects of synthetic progestin norgestrel in zebrafish （Danio rerio）[J].Chemosphere，2018，190：17-24.

[16] LIANG Y Q，HUANG G Y，LIU S S，et al.Longterm exposure to environmentally relevant concentrations of progesterone and norgestrel affects sex differentiation in zebrafish （Danio rerio）[J].Aquatic toxicology，2015，160：172-179.

[17] LIANG Y Q，HUANG G Y，YING G G，et al.A timecourse transcriptional kinetics of the hypothalamicpituitarygonadal and hypothalamicpituitaryadrenal axes in zebrafish eleutheroembryos after exposure to norgestrel[J].Environmental toxicology and chemistry，2015，34（1）：112-119.

[18] LIANG Y Q，HUANG G Y，YING G G，et al.Progesterone and norgestrel alter transcriptional expression of genes along the hypothalamicpituitarythyroid axis in zebrafish embryoslarvae[J].Comparative biochemistry and physiology part C，2015，167：101-107.

[19] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method[J].Methods，2001，25：402-408.

[20] ZUCCHI S，CASTIGLIONI S，F(xiàn)ENT K.Progestins and antiprogestins affect gene expression in early development in zebrafish （Danio rerio） at environmental concentrations[J].Environmental science & technology，2012，46（9）：5183-5192.