7 360例呼吸道感染兒童病毒抗原七聯(lián)檢的臨床結(jié)果分析

柳曉琴，崔亞利，沈 川，甘春玉，段義飛，彭磊文，李文勝△

(1.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科,四川成都 610041；2.出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610041)

病毒、細(xì)菌和非典型病原體是兒童患者3大類(lèi)主要致病源，病毒感染是引起兒童呼吸道感染的重要原因[1]。呼吸道病毒的檢測(cè)可以通過(guò)抗原或抗體進(jìn)行檢測(cè)鑒定，有資料證實(shí)，應(yīng)用直接熒光免疫方法(DFA)對(duì)抗原進(jìn)行早期檢測(cè)，可以使患者接受治療的時(shí)間降低2.5～4 d[2-3]。不同年齡階段的患兒對(duì)病毒的耐受力不同，免疫器官和組織發(fā)育階段不一致，患兒感染后會(huì)有不同程度的癥狀，尤其是處于嬰兒階段，一旦發(fā)病可能危及生命，所以早期明確病毒感染亟待解決[4-5]。

為了解本地區(qū)呼吸道病原體感染的病原學(xué)構(gòu)成和流行病學(xué)特征，本研究回顧性收集2016年4月至2018年3月期間在四川大學(xué)華西第二醫(yī)院就診的7 360例急性呼吸道感染患兒呼吸道病毒抗原的檢測(cè)結(jié)果，以期為臨床醫(yī)生對(duì)這類(lèi)患者進(jìn)行早期診斷，治療及合理用藥提供可靠的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 2016年4月至2018年3月在四川大學(xué)華西第二醫(yī)院就診，經(jīng)臨床確診為急性呼吸道感染、急性喘息性支氣管炎、急性扁桃體炎、急性支氣管炎、急性肺炎和急性重癥肺炎的疾病，年齡為0～15歲的患兒。

1.2標(biāo)本采集 根據(jù)本科的《標(biāo)本采集標(biāo)準(zhǔn)程序》要求在患兒平躺或頭仰起時(shí)，用植絨拭子從鼻孔插入鼻腔，到達(dá)鼻咽部來(lái)回旋轉(zhuǎn)2～3次后迅速抽出拭子放入加有2 mL生理鹽水的七聯(lián)檢專用離心管中，并立即送檢。

1.3試劑與儀器 7項(xiàng)呼吸道病毒檢測(cè)試劑盒(免疫熒光法)為美國(guó)Diagnostic Hybrids,Inc.公司的產(chǎn)品。檢測(cè)項(xiàng)目包括流感病毒A型(Flu A)、流感病毒B型(Flu B)、副流感病毒1型(PIV1)、副流感病毒2型(PIV2)、副流感病毒3型(PIV3)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)。2016年4月至2018年3月期間，所使用的批號(hào)分別為7R111715B、7R030916D、085046、092922、105269和114347，新批號(hào)啟用前，均按照ISO15189要求做新舊批號(hào)標(biāo)本比對(duì)，陰陽(yáng)性結(jié)果均一致。采用奧林巴斯BX43 LED熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.4操作方法

1.4.1樣本處理 將植絨拭子樣本在旋渦混勻器上劇烈渦旋混勻約30 d，見(jiàn)渾濁后去掉植絨拭子，離心2 000 r/min，10 min，棄去上清液(留400～500 μL )，吸管吹打混勻，形成混濁的細(xì)胞懸浮液。

1.4.2樣本制片 每份樣本在8孔的載玻片上，每孔中分別加入25 μL樣本懸浮液。在電吹風(fēng)冷風(fēng)下風(fēng)干10～15 min至干燥后浸沒(méi)在冷丙酮中固定10 min，取出晾干。

1.4.3樣本反應(yīng) 每份樣本的1孔到7孔分別加D3試劑(Flu A、Flu B、PIV1、PIV2、PIV3、RSV、ADV)25 μL，必須完全覆蓋待測(cè)樣本，將載玻片放在濕盒中置于37 ℃水浴箱，孵育15～30 min，取出載玻片用PBS沖洗1遍，后浸沒(méi)在PBS中洗2遍。

1.4.4樣本觀察 在載玻片中央加1滴封閉液，蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4.5結(jié)果判斷 熒光顯微鏡下顯示蘋(píng)果綠熒光的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，而被Evans藍(lán)染成紅色的細(xì)胞為陰性細(xì)胞。當(dāng)放大倍數(shù)為200倍時(shí)，在視野中找到≥2個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞，判為標(biāo)本陽(yáng)性。陰性對(duì)照/陽(yáng)性對(duì)照處理同樣本處理流程。合格的樣本要求在放大倍數(shù)為200倍下，每個(gè)視野至少有2個(gè)上皮細(xì)胞。陰性結(jié)果為至少含有20個(gè)柱狀上皮細(xì)胞的樣本中無(wú)熒光染色。如果樣本中上皮細(xì)胞數(shù)量少于20個(gè)則為樣本不合格，應(yīng)重新采樣再進(jìn)行檢測(cè)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1呼吸道病毒總檢出率 7 360例急性呼吸道感染標(biāo)本中，783例標(biāo)本呼吸道病毒抗原檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為10.64%(783/7 360)，其中2項(xiàng)同時(shí)有陽(yáng)性結(jié)果的8例，以RSV合并感染最常見(jiàn)，占總陽(yáng)性標(biāo)本的0.11%；陽(yáng)性率最高的是RSV(7.40%)，其次為PIV3(1.45%)，ADV(0.84%)，F(xiàn)lu B(0.34%)，F(xiàn)lu A(0.33%)，PIV1 (0.24%)和PIV2(0.03%)。結(jié)果見(jiàn)表1。在7 360例患兒檢測(cè)結(jié)果中，按年齡分為3組：嬰兒組(≤1歲)，幼兒組(1～3歲)，學(xué)齡后組(≥3歲)。不同年齡組患兒呼吸道病毒陽(yáng)性率見(jiàn)表2。多組樣本間呼吸道七聯(lián)檢用χ2檢驗(yàn)，由表2結(jié)果可知，嬰兒組與幼兒組病毒檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=120.89，P<0.001)；幼兒組與學(xué)齡后組病毒檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=34.72，P<0.001)；嬰兒組與學(xué)齡后組病毒檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=280.44，P<0.001)。

表1 7項(xiàng)呼吸道病毒檢測(cè)結(jié)果

2.2不同季節(jié)患兒呼吸道病毒發(fā)病率 此次統(tǒng)計(jì)得出，男性患兒4 288例，發(fā)病患兒陽(yáng)性率占11.22%，其中，女性患兒3 072例，發(fā)病患兒陽(yáng)性率占9.83%。男性與女性患兒檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.705，P>0.05)。按四季發(fā)病率統(tǒng)計(jì)，春季發(fā)病患兒2 328例，患兒陽(yáng)性率占14.05%；夏季發(fā)病患兒1 695例，患兒陽(yáng)性率占4.72%；秋季發(fā)病患兒1 449例，患兒陽(yáng)性率占5.31%；冬季發(fā)病患兒1 888例，患兒陽(yáng)性率占16.37%。春季與夏季檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=105.933，P<0.001)；秋季與冬季檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=114.824，P<0.001)；秋季與冬季檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=105.933，P<0.001)；春季與冬季檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=29.851，P<0.001)。

表2 不同年齡組患兒呼吸道病毒檢測(cè)結(jié)果

表3 不同季節(jié)患兒呼吸道病毒發(fā)病率

3 討 論

引起呼吸道感染的病原體種類(lèi)繁多，導(dǎo)致呼吸道感染病情復(fù)雜，臨床癥狀多樣[6]。因此，對(duì)于引起呼吸道感染的呼吸道病原體的準(zhǔn)確診斷變得十分重要，應(yīng)及早干預(yù)、診斷與治療，以降低其發(fā)病率及病死率[7-8]。這不僅對(duì)感染患者的健康恢復(fù)有重要的價(jià)值，另一方面，盡早發(fā)現(xiàn)疑似病例，快速確認(rèn)病原體，有利于對(duì)病原體流行爆發(fā)的控制，以避免危及更廣泛的人群，也可為流行病學(xué)調(diào)查、疾病治療及疫情防治提供強(qiáng)有力的支持[6,9]。

急性呼吸道感染中80%由呼吸道病毒引起，研究表明呼吸道病毒七聯(lián)檢是檢測(cè)小兒呼吸道病毒感染的有效手段[10-11]。近年來(lái)，有研究表明嬰幼兒急性肺炎是我國(guó)住院患兒死亡的主要原因之一[12]，每年因呼吸道感染病死的兒童占患兒死亡人數(shù)的20%左右，嚴(yán)重影響著兒童的身體健康[13-14]。兒童呼吸道的感染與病原體、年齡、飲食、心理及兒童所在的地區(qū)差異有關(guān)，其中病原體因素占主導(dǎo)地位。隨著科技的發(fā)展，抗菌藥物的生產(chǎn)隨之增多，臨床上的抗菌藥物得到廣泛應(yīng)用，呼吸道感染有所降低，但其他病原體感染卻有上升之勢(shì)[15-16]。錢(qián)熊杰等[17]的研究表明，兒童急性呼吸道感染中，上呼吸道感染主要由病毒引起(53.78%)。

本研究結(jié)果顯示，7 360例急性呼吸道感染患兒標(biāo)本中，有783例呼吸道病毒檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)10.64%。陽(yáng)性率由高到低依次為RSV、PIV3、ADV、Flu B、Flu A、PIV1、PIV2，這與FEARNS等[18]報(bào)道的結(jié)果是一致。在年齡分組結(jié)果中，嬰兒組患兒檢出陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于幼兒組和學(xué)齡后組，這提示臨床醫(yī)生嬰兒呼吸道病毒感染的概率高于幼兒和學(xué)齡后兒童，進(jìn)一步提示這類(lèi)患兒就診時(shí)可以進(jìn)行早期呼吸道病原體篩查。春季和冬季7項(xiàng)呼吸道病毒感染的檢出率遠(yuǎn)高于夏季和秋季，這與賴偉蘭等[19]得出的結(jié)論一致。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性呼吸道感染情況受年齡和季節(jié)的影響較大，并表現(xiàn)出各年齡段兒童的感染率不同。鑒于近年來(lái)RSV感染明顯增多，每個(gè)地區(qū)一年四季均可發(fā)病，常引起嚴(yán)重的呼吸道疾病，所以在臨床上不容忽視[20]。流感病毒感染發(fā)生高峰在北半球一般是從11月至來(lái)年4月，腺病毒出現(xiàn)在深冬到夏初，RSV通常是在冬天到早春，持續(xù)5個(gè)月流行，副流感病毒爆發(fā)會(huì)持續(xù)1年。

通過(guò)檢測(cè)呼吸道病毒抗原可有效發(fā)現(xiàn)疫情的暴發(fā)流行，早期進(jìn)行呼吸道病毒七聯(lián)檢可以及時(shí)有效地篩查出患兒所感染病毒種類(lèi)，監(jiān)測(cè)患兒病情，指導(dǎo)臨床合理的用藥，為做好嬰幼兒的預(yù)防及醫(yī)院儲(chǔ)備相關(guān)藥品等起到一定提示作用，進(jìn)而為嬰幼兒急性呼吸道感染治療的相關(guān)探索研究提供流行病學(xué)依據(jù)。但是，該檢測(cè)方法存在一定局限性，如標(biāo)本采集質(zhì)量不合格易發(fā)生漏檢，且檢測(cè)結(jié)果未經(jīng)核酸檢測(cè)驗(yàn)證，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性。盡管如此，該方法相較于核酸檢測(cè)對(duì)人員及設(shè)備要求均不高，且成本較低，可廣泛適用于基層醫(yī)院開(kāi)展。早期診斷對(duì)使用抗病毒藥物治療、緩解流感癥狀、縮短病程、降低并發(fā)癥發(fā)生率、縮短排毒時(shí)間、降低病死率有積極作用，在流行期間，預(yù)防性使用抗病毒藥物可能降低患病率，節(jié)省患者開(kāi)支和醫(yī)院資源。

4 結(jié) 論

呼吸道病原體的準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)呼吸道感染的早期診斷、干預(yù)及治療具有重要的指導(dǎo)意義。急性呼吸道感染情況受年齡和季節(jié)影響大。呼吸道病毒七聯(lián)檢是檢測(cè)小兒呼吸道病毒感染的有效手段。