肝纖維化指標與miRNA-200b、TAP聯(lián)合檢測與原發(fā)性肝癌預(yù)后的相關(guān)性研究

李章勇，夏 川，李剛勇，顏 彥，林應(yīng)標△

(湖南省郴州市第一人民醫(yī)院，1.檢驗醫(yī)學中心；2.肝病科，湖南郴州 423000)

原發(fā)性肝癌是目前我國最為常見的一種惡性腫瘤，具有較高的致死率，全球范圍內(nèi)發(fā)病率均較高[1]。且原發(fā)性肝癌患者在發(fā)病早期缺乏典型的臨床癥狀，往往確診時已進入中晚期，臨床治療難度較大，預(yù)后多不良[2]。因此，對于原發(fā)性肝癌患者及早確診、及早治療在改善患者預(yù)后、提高生存率方面具有重要意義。MiR-200家族作為miRNA的重要組成部分之一，在多種腫瘤組織中均有異常表達，尤其是miR-200家族是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。miR-200b為miR-200家族的重要成員，亦參與腫瘤細胞浸潤、轉(zhuǎn)移等多種生物學行為[5]。最近發(fā)現(xiàn)，正常細胞惡變時，細胞膜表面的聚糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，最常見的是N-鏈聚糖分支的增加，產(chǎn)生多種異常糖鏈糖蛋白即腫瘤異常蛋白(TAP)，可釋放到體液中。當腫瘤細胞產(chǎn)生的TAP量達到一定程度時，即可以在末梢血液中檢出[6]。亦有研究認為肝臟纖維化病情進展，最終可導(dǎo)致原發(fā)性肝癌。在此背景下，本研究旨在探討miRNA-200b、TAP蛋白表達水平與肝纖維化指標聯(lián)合檢測在原發(fā)性肝癌疾病診斷中的意義，為臨床做好原發(fā)性肝癌早期診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年2月至2018年1月在本院接受治療的73例原發(fā)性肝癌患者病例資料作為研究對象，其中有男58例，女15例，年齡23～79歲，平均(57.11±8.32)歲。根據(jù)預(yù)后情況將患者分為預(yù)后良好組和預(yù)后不良組，以隨訪2年內(nèi)復(fù)發(fā)或死亡為預(yù)后不良組，隨訪期間未發(fā)生病情惡化為預(yù)后良好組。結(jié)果預(yù)后良好患者45例，其中男37例，女8例，年齡23～76歲，平均(58.06±7.41)歲。預(yù)后不良患者38例，男31例，女7例，年齡24～79歲，平均(57.34±6.27)歲。兩組患者性別比例、年齡等基礎(chǔ)資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，入組患者及家屬均對本研究方案之前同意并簽署知情同意書。

1.2納入與排除標準 納入標準：(1)根據(jù)中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會修訂的肝癌診斷標準[7]；(2)樣本采集前未經(jīng)過放療、化療或介入治療等措施。排除標準：(1)伴有自身免疫性疾病的患者；(2)伴有其他系統(tǒng)惡性腫瘤者。

1.3觀察指標及方法

1.3.1標本采集 入組研究者均使用真空采血管采集空腹靜脈血4 mL，室溫自然凝集30 min，室溫，4 000 r/min離心15 min，離心半徑16 cm，移取上層血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2miRNA-200b mRNA檢測 術(shù)中采集肝組織標本，放入液氮中冷凍，之后轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱保存。取肝癌及癌旁組織標本，研磨，采用TRIzol試劑盒提取組織中總RNA。所有操作嚴格按照說明書進行，并對獲得的總RNA進行檢測，取A260/A280>1.8的標本完成后續(xù)實驗。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，之后采用RT-qPCR測定肝癌組織中miRNA-200b mRNA的表達水平。

1.3.3TAP的檢測 取各組研究對象指端末梢血，推制成厚薄均勻的血片3張，自然干燥。將TAP檢測試劑充分搖勻，用滴管垂直滴加在血片上，每張3滴；等血片上凝聚助劑自然干燥形成圓形“斑點”，將標本置于TAP集成閱片儀下，尋找特異形態(tài)的凝聚物。TAP正常/無明顯凝聚物：面積0～121 μm2；TAP異常/凝聚物較?。好娣e121～225 μm2；TAP異常/凝聚物較大：面積≥225 μm2。試劑和儀器均購自浙江瑞生醫(yī)療科技有限公司。

1.3.4肝臟纖維化指標 測定儀器為新產(chǎn)業(yè)MAGLUMIN 2000全自動化學發(fā)光儀,試劑盒由深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學工程有限公司提供,檢測入組研究人群血清透明質(zhì)酸(HA)，Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、層粘連蛋白(LN)水平。

1.4統(tǒng)計學處理 采用EXCEL軟件進行原始數(shù)據(jù)的錄入和預(yù)處理，采用SPSS 22.2軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用t檢驗，采用Spearman相關(guān)性分析肝纖維化指標及血清TAP，癌組織miRNA-200b與預(yù)后的相關(guān)性，預(yù)后良好賦值為1，預(yù)后不良賦值為0，并采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平與肝纖維化指標聯(lián)合檢測在原發(fā)性肝癌預(yù)后的評估價值，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA比較 預(yù)后不良組患者肝組織miRNA-200b mRNA表達量均低于預(yù)后良好組，預(yù)后良好組患者血清TAP顯著高于預(yù)后不良組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者血清TAP、癌組織miRNA-200b水平比較

2.2兩組患者肝臟纖維指標比較 觀察組患者血清 PCⅢ、Ⅳ-C、LN以及HA水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平及肝纖維化指標與預(yù)后的相關(guān)性分析 如表3所示，血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平對原發(fā)性肝癌診斷的臨界值分別為0.58和94.02 μm2(r=-0.213、0.715，P<0.05)。肝纖維化指標PCⅢ、Ⅳ-C、LN和HA對原發(fā)性肝癌診斷的臨界值分別為102.3 μg/L、98.1 μg/L、122.4 μg/L和106.5 μg/L(r=-0.512、-0.608、-0.743、-0.673，P<0.05)。

表2 兩組患者肝臟纖維指標比較

2.4血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平與肝纖維化指標聯(lián)合檢測在原發(fā)性肝癌預(yù)后的ROC曲線分析 血清血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平與肝纖維化指標聯(lián)合檢測評估原發(fā)性肝癌預(yù)后的靈敏度、準確度和特異度分別為0.985、0.972和0.832。見表3、圖1。

表3 血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平與

圖1 血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達

3 討 論

近年來，有研究表明腫瘤的生物學行為受到腫瘤自身及腫瘤微環(huán)境的影響，對其演變和轉(zhuǎn)歸均會產(chǎn)生重要影響[8-10]。趨化因子能夠?qū)C體免疫細胞募集至腫瘤病灶處，分泌多種細胞因子，影響腫瘤的生長及附近血管的生成[11]。有大量報道表明，TAP與多種腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且能夠?qū)δ[瘤患者的預(yù)后進行評估[12-15]。

本研究結(jié)果表明，預(yù)后不良組患者血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平高于對照組。相關(guān)研究表明miRNA-200b mRNA高表達者中位生存期長于低表達者，表明miRNA-200b mRNA高表達可提高患者生存率，延長生存期，與楊西勝等[16]報道基本一致。推測 miRNA-200b mRNA在肝癌發(fā)生中可能發(fā)揮抑癌基因作用，高表達miRNA-200b mRNA可能通過下調(diào)E-cadherin 或直接抑制EMT而減少腫瘤細胞遷移、侵襲的發(fā)生。

TAP是腫瘤細胞在新陳代謝過程中排放的糖蛋白和鈣-組蛋白復(fù)合物的總稱，TAP的出現(xiàn)間接表示細胞癌變的數(shù)量和程度。當TAP達到一定程度后，這類物質(zhì)向血液排放，并較多地存在于外周血液。TAP在肝臟腫瘤具有較高表達，陽性率為70%～95%[17]。將其作為肝癌血清學檢測的指標，對發(fā)現(xiàn)癌前病變有較高的靈敏度和特異度。

正常肝臟細胞外基質(zhì)的主要成分有蛋白多糖、LN和膠原。HA，一種蛋白多糖，在肝組織發(fā)生纖維化時，其在血清中的含量會明顯升高，同時分布于內(nèi)皮細胞的HA受體會相應(yīng)降低，其降解途徑受到抑制，因此在肝臟發(fā)生纖維化時，血清HA水平發(fā)生較大波動，是目前能夠反映肝臟纖維化較為敏感的生化指標之一[18]。慢性肝炎患者的血清PCⅢ持續(xù)升高提示病情向肝硬化發(fā)生了進一步的進展，而其血清含量的降低則預(yù)示了病情有所緩解。此外，LN及Ⅳ-C也是反映肝纖維化的重要指標。隨著肝炎患者病情進展，逐漸演變成肝硬化乃至肝癌，肝纖維化指標均會發(fā)生相應(yīng)的變化，因此肝纖維化指標是反映機體肝臟健康狀況的重要指標。本研究結(jié)果表明，預(yù)后不良組患者血清PCⅢ、Ⅳ-C、LN以及HA水平均低于預(yù)后良好組，說明肝癌患者的預(yù)后與肝纖維指標存在較好的相關(guān)性。

根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果，結(jié)果表明血清血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平與肝纖維化指標聯(lián)合檢測對原發(fā)性肝癌疾病預(yù)后評估的靈敏度、準確度和特異度分別為0.985、0.972和0.832。說明血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平聯(lián)合肝纖維化指標能夠?qū)υl(fā)性肝癌進行有效診斷，其原因是血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平作為在肝癌發(fā)生過程中即會明顯變化的指標，用其預(yù)測肝臟疾病預(yù)后具有一定的臨床意義，而肝纖維化是肝臟病變逐漸進展接近肝癌的一個病理期，因此兩種指標聯(lián)合能夠兼顧特異度和準確性。

4 結(jié) 論

血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平與肝纖維化指標聯(lián)合檢測可用于對原發(fā)性肝癌的預(yù)后進行評估診斷，其靈敏度、特異度及準確度均較高，具有較好的臨床應(yīng)用前景。