宮頸癌細胞通過下調(diào)miR-301b表達促進基因組DNA損傷修復

楊 磊，穆 紅，謝莉麗

(天津市第一中心醫(yī)院檢驗科，天津 300192)

細胞的生存與基因組的完整性緊密相關(guān)，應(yīng)用離子射線、氧化劑以及基因組毒性藥物破壞細胞基因組DNA是殺傷腫瘤細胞的重要手段。然而，這些外界刺激會激活細胞內(nèi)特異的信號通路啟動DNA損傷修復反應(yīng)清除外源刺激物在基因組上造成的損傷，使腫瘤細胞對治療方法產(chǎn)生抵抗力[1-2]。微小RNA(MiRNA)是一種長度約20個核苷酸組成的小片段RNA分子，基于種子序列與靶基因mRNA非編碼區(qū)的特異性結(jié)合，在Ago蛋白復合物加工元件的作用下，實現(xiàn)靶基因mRNA的快速降解以及蛋白的翻譯阻滯，降低靶基因在細胞內(nèi)的水平，進而影響細胞表型[3-4]。近期報道顯示，microRNA分子通過調(diào)控靶基因的表達參與了細胞中基因組DNA的損傷修復過程。E3泛素化蛋白連接酶(Ndfip1)和蛋白磷酸酶調(diào)控亞基B′α(PPP2R5A)具有修復DNA、維持DNA穩(wěn)定性的功能，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中過表達miR-388-5p可以干擾上述2種蛋白分子的表達，進而干擾細胞修復DNA損傷[5]。在前列腺癌細胞中，miR-890和miR-744-3p分別通過抑制有絲分裂靜息蛋白缺陷2樣蛋白2(MAD2L2)和Rad23核剪切修復蛋白同源物B(Rad23B)阻礙離子輻射誘導性DNA損傷修復過程[6]。MiR-301b基因位點位于人類第22條染色短臂1區(qū)2帶，該基因首先轉(zhuǎn)錄加工成長度為78 bp的發(fā)卡狀前體RNA分子，進一步加工后形成成熟體非編碼RNAmiR-301b。MiR-301b在細胞增殖、侵襲以及凋亡等細胞生命活動中都發(fā)揮著重要作用[7-9]。C末端結(jié)合蛋白作用蛋白(Ctip)基因位點位于人類第18條染色體短臂1區(qū)2帶，其表達產(chǎn)物是一種內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶，可以特異性識別和結(jié)合分叉DNA分子的5′端折疊結(jié)構(gòu)，與Mre11雙鏈斷裂修復核酶、Rad50重組酶和Nbs11煙草花葉病毒抗性N樣蛋白結(jié)合后以同源重組(HR)的形式修復損傷DNA分子[10-11]。新輔助化療聯(lián)合放射治療是目前治療宮頸癌的常用手段，在治療中，化學藥物通過誘導DNA損傷、抑制細胞分裂增殖、促進細胞凋亡的方式殺傷癌細胞。但細胞中存在參與DNA修復的生物分子，這些分子阻礙了化學藥物對細胞的殺傷作用[12]。因此，揭示宮頸癌細胞中DNA修復機制，可以為探索干擾DNA損傷修復的方法奠定基礎(chǔ)，最終為克服宮頸癌細胞耐藥性及疾病治療提供幫助。在本項研究中，筆者探討了miR-301b與Ctip基因表達的作用關(guān)系及其機制、以及這種作用關(guān)系對基因組DNA損傷修復過程的影響，并以此為基礎(chǔ)提出了宮頸癌細胞修復DNA損傷的機制。

1 材料與方法

1.1材料 宮頸癌細胞株Siha購自于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 EnSpire Mutilabel Reader酶標儀，芬蘭PerkinElmer公司；Alpha Innotech FluroChem FC2凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Alpha Innotech公司；LightCycle96 熒光定量PCR儀，瑞士Roche 公司；BD Accuri C6 Plus流式細胞儀，美國BD Sciences公司。

1.2.2試劑 miR-301b模擬物、miR-301b抑制物以及陰性對照核酸N.C.和抑制物N.C.由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成；質(zhì)粒構(gòu)建、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)實驗中用到逆轉(zhuǎn)錄、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增引物均由北京天潤奧科生物科技有限公司合成；RNA/DNA X-fect轉(zhuǎn)染試劑、PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶以及SYBR Premix Ex Taq Ⅱ熒光定量PCR試劑盒購自日本 Takara生物技術(shù)有限公司；兔抗人Ctip、 GADPH抗體以及HRP標記羊抗兔IgG Fc抗體購自美國Proteintech公司；鼠抗人γ-H2AX蛋白抗體及Alexa Fluor?488 dye 標記兔抗鼠抗體購自美國 Abcam有限公司；mirVana RNA提取試劑盒來源于美國Ambion公司；Annexin-V 凋亡檢測試劑盒來源于美國BD Sciences公司。

1.3方法

1.3.1質(zhì)粒構(gòu)建 本項目構(gòu)建的質(zhì)粒包括靶基因過表達質(zhì)粒pcDNA3.1/Ctip；熒光報告質(zhì)粒pcDNA3.1/EGFP-Ctip-wtUTR和pcDNA3.1/EGFP-Ctip-mutUTR。質(zhì)粒構(gòu)建時逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃，1 h，70℃，15 min；PCR擴增條件：94 ℃，2 min； 94 ℃，30 s、57 ℃，30 s、72 ℃，3 min，32個循環(huán)；72 ℃，10 min；UTR核酸模擬物退火條件：100 ℃，5 min，水浴緩慢降至37 ℃。寡核苷酸引物序列請見表1。

表1 實驗中用到的寡核苷酸片段

注：5′,3′分別代表核酸片段的5′和3′末端

1.3.2細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將細胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的1640細胞培養(yǎng)液，于37 ℃，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將細胞以約5×104個/毫升的密度種于培養(yǎng)板，待細胞貼壁后，用RNA/DNA X-fectTM轉(zhuǎn)染試劑將寡核苷酸miR-301b模擬物、miR-301b抑制物、N.C.、抑制物N.C.、以及質(zhì)粒pcDNA3.1/Ctip、pcDNA3.1/EGFP-Ctip-wtUTR和pcDNA3.1/EGFP-Ctip-mutUTR轉(zhuǎn)染至細胞。

1.3.3細胞藥物刺激 將TNF-α粉末溶解于磷酸緩沖液(PBS)中制備成200 μg/mL的藥物原液，置于-80 ℃條件下儲存。用時取一定體積的藥物原液加入至細胞培養(yǎng)液，稀釋成100 ng/mL的工作液刺激細胞1.5、3和6 h。

1.3.4實時定量聚合酶鏈式(PCR)反應(yīng) 對目標基因miR-301b、Ctip mRNA以及內(nèi)參基因U6小RNA、β-actin mRNA的進行熒光半定量，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，擴增35個循環(huán)后進行熔解曲線分析并應(yīng)用2-ΔΔCt方法，按公式：Folds=2-ΔΔCt,ΔΔCt=(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)，其中Ct1為處理樣品中待測基因(miR-301b和Ctip)的臨界循環(huán)數(shù)，Ct2為處理樣品中待測基因?qū)?yīng)的內(nèi)參基因(U6和β-actin)的臨界循環(huán)數(shù)，Ct3為對照樣品中待測基因的臨界循環(huán)數(shù)，Ct4為對照樣品中待測基因?qū)?yīng)的內(nèi)參基因的臨界循環(huán)數(shù)，計算出每組細胞中目標基因的相對表達水平。寡核苷酸引物序列請見表2。

1.3.5Western-blot蛋白印跡實驗 對目的Ctip蛋白及其內(nèi)參蛋白GADPH進行電泳分離、抗體標記及化學顯影步驟。實驗條件：上樣量，25 μg每孔；轉(zhuǎn)膜電流及時間，260 mA、2 h；抗體加入量，1∶500(1抗)、1∶2 000(2抗)；抗體孵育時間，1 h(1抗)、2 h(2抗)。影像捕捉后，根據(jù)目的樣本灰度值(目的蛋白條帶亮度-背景值)與對應(yīng)內(nèi)參蛋白灰度值(內(nèi)參看白GADPH條帶亮度-背景值)的比值，得到目的蛋白的相對表達量。

1.3.6γ-H2AX免疫熒光實驗 滅活固定細胞后，用磷酸化H2AX蛋白抗體標記細胞內(nèi)的靶蛋白、流式細胞術(shù)檢測靶蛋白熒光強度。實驗條件：1%甲醛細胞滅活15 min；70%乙醇細胞固定3 h；抗體加入量，1∶100(1抗)、1∶100(2抗)；抗體孵育時間，2 h(1抗)、30 min(2抗)；流式細胞采集量，10 000個。在研究中，依據(jù)藥物處理條件、轉(zhuǎn)染寡核酸、質(zhì)粒種類不同，每個實驗組都對應(yīng)著各自對照組。對應(yīng)關(guān)系如下：磷酸鹽緩沖液對照組與TNF-α處理實驗組；N.C.轉(zhuǎn)染對照組與miR-301b模擬物轉(zhuǎn)染實驗組；抑制物N.C.轉(zhuǎn)染對照組與抑制物轉(zhuǎn)染實驗組；pcDNA3.1與miR-301b模擬物共轉(zhuǎn)染對照組與pcDNA3.1/Ctip與miR-301b模擬物共轉(zhuǎn)染實驗組。實驗組和對照組細胞經(jīng)抗體標記后，可以直接在流式細胞術(shù)平臺上進行檢測，上樣檢測后，各組細胞群的γ-H2AX蛋白的平均熒光強度會顯示在平臺上，每組細胞各做3個平行樣。

1.3.7彗星實驗 將400 mL含有8 000個細胞的磷酸鹽緩沖液與1.2 mL 1%的低熔點瓊脂糖凝膠混合，平鋪在載玻片上。膠凝固后，將載玻片置于裂解液(2%肌氨酰，0.5 mol/L乙二胺四乙酸二鈉，0.5 mg/mL蛋白酶K)中37 ℃孵育過夜。用電泳液(90 mmol/L三羥基氨基甲烷，90 mmol/L硼酸，2 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉)浸洗載玻片3次，每次20 min。浸洗后，在電壓為14 V的條件下，電泳25 min。用濃度為2.5 μg/mL的溴化乙錠水溶液浸泡載玻片20 min。染色后，用400 mL去離子水浸洗載玻片20 min。然后在熒光顯微鏡下進行觀察和拍照。利用彗星實驗成像工程軟件(CASP)計算DNA尾距，每個實驗組計算50個DNA尾距。

表2 實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)用到的引物序列

注：5′、3′分別代表核酸片段的5′和3′末端

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以百分數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1宮頸癌Siha細胞修復基因組DNA損傷的分析 用TNF-α試劑(處理組)和等體積的磷酸鹽緩沖液(對照組)作用Siha細胞后，測定各組細胞內(nèi)γ-H2AX表達的平均水平以及DNA彗星狀平均尾距，監(jiān)測胞內(nèi)DNA損傷程度。與對照組細胞相比，TNF-α處理組細胞經(jīng)藥物刺激1.5和3 h后，胞內(nèi)γ-H2AX蛋白平均表達水平分別上升了0.26和0.48倍，同時平均尾距增加了0.58和0.96倍(P<0.05)，而藥物刺激細胞6 h后，TNF-α處理組細胞中的γ-H2AX蛋白平均表達水平以及平均尾距與對照組相比無明顯差異(圖1A和B)。

2.2miR-301b模擬物、miR-301b抑制物對宮頸癌細胞中Ctip基因表達的影響 應(yīng)用PCR實驗分別檢測TNF-α處理組和對照組細胞中miR-301b、Ctip mRNA相對表達水平。在藥物刺激1.5和3 h后，與對照組相比，TNF-α處理組細胞中miR-301b表達水平分別下降了25.33%和38.63%(P<0.05)(圖2)，同時Ctip mRNA的水平分別上升了0.19和0.37倍(P<0.05)(圖3)。分別轉(zhuǎn)染miR-301b模擬物(miR-301b模擬物組)、miR-301b陰性對照核酸N.C.(N.C.組)、miR-301b抑制物 (抑制物組)以及抑制物對照核酸抑制物N.C.(抑制物N.C.組)至細胞，應(yīng)用PCR和Western-blot實驗檢測各組細胞中Ctip mRNA和蛋白表達水平。與N.C.組細胞相比，miR-301b組細胞中Ctip mRNA和蛋白表達水平分別下降44.60%和30.53%(P<0.05)；與抑制物N.C.組細胞相比，抑制物組細胞中Ctip mRNA和蛋白水平分別上升0.34和0.27倍(P<0.05)(圖4)。TargetScanHuman、miRBD、DIANA TOOL以及Pictar 4種生物信息學軟件預(yù)測結(jié)果顯示，Ctip mRNA上3208至3214核苷酸位點的核酸序列與miR-301b的2到8核苷酸位點的種子序列反向互補，是miR-301b潛在的靶定位點(圖5)；熒光報告實驗結(jié)果顯示，與N.C.組細胞相比，嵌合有野生型Ctip mRNA3′UTR的報告載體(pcDNA3.1/EGFP-Ctip -wtUTR)上的綠色熒光蛋白報告基因在miR-301b模擬物組細胞中的表達水平下降19.53%(P<0.05)；與抑制物N.C.組細胞相比，報告基因在抑制物組細胞中的表達水平上升0.15倍(P<0.05)；然而嵌有突變型3′UTR載體(pcDNA3.1/EGFP-Ctip-mutUTR)上的報告基因表達水平在上述各組細胞中的表達水平無明顯差異(圖6)。

注：A為TNF-α刺激對γ-H2AX蛋白水平的影響；B為TNF-α刺激對DNA彗星狀尾距的影響

圖1TNF-α刺激對γ-H2AX蛋白水平和DNA彗星狀尾距的影響

圖2 TNF-α刺激對miR-301b表達水平的影響

圖3 TNF-α刺激對Ctip mRNA表達水平的影響

2.3miR-301b對宮頸癌細胞修復DNA損傷的影響 分別向細胞轉(zhuǎn)染miR-301b模擬物、miR-301b抑制物以及它們各自的陰性對照核酸N.C和抑制物N.C.后，測定各組細胞內(nèi)γ-H2AX蛋白平均表達水平和DNA彗星狀平均尾距。TNF-α刺激細胞6 h后，與N.C.組細胞相比，miR-301b模擬物組細胞中γ-H2AX平均表達水平和平均尾距分別上升0.78倍和0.42倍(P<0.05)；刺激細胞3 h后，與抑制物N.C.組細胞相比，抑制物組細胞中γ-H2AX蛋白平均表達水平和平均尾距分別下降22.13%和26.09%(P<0.05)(圖7A和B)。

圖4 轉(zhuǎn)染miR-301b模擬物、抑制物對Ctip

圖5 miR-301b與Ctip mRNA 3′UTR及其突變體

圖6 miR-301b與Ctip mRNA 3′UTR及其突變體

注：A為轉(zhuǎn)染miR-301b模擬物、抑制物對γ-H2AX蛋白表達水平的影響;B為轉(zhuǎn)染miR-301b模擬物、抑制物對DNA彗星狀尾距的影響

圖7轉(zhuǎn)染miR-301b模擬物、抑制物對γ-H2AX蛋白表達水平和DNA彗星狀尾距的影響

2.4Ctip基因表達對miR-301b干擾宮頸癌細胞修復DNA損傷的影響 分別將pcDNA3.1/Ctip或其對照載體pcDNA3.1與miR-301b模擬物共轉(zhuǎn)染至靶細胞，測定各組細胞內(nèi)γ-H2AX蛋白平均表達水平和DNA彗星狀平均尾距。TNF-α刺激細胞1.5和3 h后，與共轉(zhuǎn)染miR-301b模擬物和pcDNA3.1的細胞相比，共轉(zhuǎn)染miR-301b模擬物和pcDNA3.1/Ctip質(zhì)粒的細胞中γ-H2AX蛋白平均表達水平分別下降39.02%和44.35%，與此同時，平均尾距分別下降33.60%和38.12%(P<0.05)(圖8A和B)。

注：A為過表達Ctip基因?qū)iR-301b模擬物轉(zhuǎn)染組細胞中γ-H2AX蛋白表達水平的影響;B為過表達Ctip基因?qū)iR-301b模擬物轉(zhuǎn)染組細胞中彗星狀DNA尾距的影響

圖8過表達Ctip基因?qū)iR-301b模擬物轉(zhuǎn)染組細胞中γ-H2AX蛋白表達水平和彗星狀DNA尾距的影響

3 討 論

TNF-α是一種相對分子質(zhì)量為26×103的跨膜蛋白，經(jīng)金屬轉(zhuǎn)換酶的作用后，可由跨膜型蛋白轉(zhuǎn)換為可溶性型細胞因子，在不同的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[13]。TNF-α處理細胞后，會使細胞線粒體內(nèi)產(chǎn)生大量胞內(nèi)活性氧中間分子(ROI)，這些分子經(jīng)金屬離子催化后能形成具有強氧化活性的羥基自由基，產(chǎn)生的這些自由基可以通過氧化反應(yīng)氧化DNA分子中核苷酸，造成DNA損傷[14-15]。文獻記錄顯示，用濃度為1、10和100 ng/mL的TNF-α試劑處理淋巴細胞1 h后，細胞內(nèi)DNA損傷標志物的水平即可出現(xiàn)顯著升高，而藥物處理4 h后，損傷標志物水平出現(xiàn)下降。在藥物處理24 h后，濃度為1、10 ng/mL TNF-α試劑造成標志物水平升高的現(xiàn)象消失，100 ng/mL TNF-α試劑造成標志物水平升高的現(xiàn)象仍存在。這些文獻中報道的數(shù)據(jù)說明2個問題：(1)TNF-α處理細胞后能夠誘發(fā)DNA損傷修復反應(yīng)；(2)100 ng/mL TNF-α試劑對細胞DNA損傷作用更持久[16]。目前還沒有利用TNF-α試劑誘導宮頸癌細胞DNA損傷修復反應(yīng)的文獻記錄，因此，本研究依據(jù)現(xiàn)有文獻報道，將TNF-α試劑濃度設(shè)定為100 ng/mL，分別在藥物處理后，1.5、3 h 2個時間點觀察DNA損傷標志物的水平確定TNF-α能否造成宮頸癌細胞中DNA的損傷，6、24 h 2個時間點觀察損傷標志物的水平確定TNF-α誘導性DNA損傷可否被宮頸癌細胞修復。本研究的實驗結(jié)果顯示，與對照組細胞相比，用TNF-α刺激Siha細胞1.5和3 h后，細胞中的DNA損傷標記物γ-H2AX蛋白的平均表達水平以及DNA彗星狀平均尾距均出現(xiàn)明顯升高，然而當TNF-α刺激時間延長至6 h，γ-H2AX蛋白平均表達水平及DNA平均尾距卻未出現(xiàn)顯著差異。這說明TNF-α可以造成Siha細胞內(nèi)基因組DNA的損傷，但該損傷在6 h內(nèi)就可以被細胞完全修復。TNF-α刺激造成了miR-301b的上升和Ctip mRNA水平的下降。為探索miR-301b和Ctip mRNA表達水平變化之間有無關(guān)聯(lián)，筆者利用轉(zhuǎn)染技術(shù)，對TNF-α處理細胞進行了信號通路干預(yù)。與相應(yīng)對照核酸相比，轉(zhuǎn)染miR-301b模擬物會導致Ctip mRNA和蛋白水平的降低，而轉(zhuǎn)染miR-301b抑制物會使Ctip mRNA和蛋白水平升高。該結(jié)果說明，miR-301b可能影響Ctip基因表達。生物信息學分析預(yù)測出了Ctip mRNA 3′UTR上miR-301b的靶定位點。與相應(yīng)對照組細胞相比，pcDNA3.1/EGFP-Ctip-wtUTR載體上報告基因的表達強度在miR-301b模擬物組細胞中顯著降低、在抑制物組細胞中明顯升高；而pcDNA3.1/EGFP-Ctip-mutUTR載體上報告基因表達強度在上述兩組細胞中無顯著變化。 這些說明，miR-301b是通過直接結(jié)合Ctip mRNA 3′UTR上預(yù)測出的靶定位點來抑制Ctip基因表達的。TNF-α作用后，細胞內(nèi)miR-301b、Ctip mRNA表達水平的變化說明這兩種分子可能參與了基因組DNA的損傷修復過程。此外，該基因產(chǎn)物還可以通過微同源介導末端連接的方式(MMEJ)完成損傷DNA分子的修復[17]。因此，miR-301b對Ctip基因表達的調(diào)控可能會影響細胞中DNA損傷修復過程。與相應(yīng)對照組細胞相比，miR-301b模擬物組細胞中γ-H2AX蛋白平均表達水平以及DNA彗星狀平均尾距的上升以及抑制物組細胞中γ-H2AX蛋白平均表達水平和平均尾距的下降說明miR-301b會干擾DNA的損傷修復。而與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1的細胞相比， pcDNA3.1/Ctip質(zhì)粒與miR-301b模擬物共轉(zhuǎn)染導致細胞內(nèi)γ-H2AX蛋白平均表達水平下降則說明miR-301b可通過抑制Ctip基因表達干擾DNA的損傷修復。

4 結(jié) 論

宮頸癌Siha細胞通過下調(diào)miR-301b增強Ctip基因表達促進基因組DNA的損傷修復。