高效液相色譜法測定黑枸杞中花青素的不確定度評定

曹 秀，余明霞，馮慧慧，楊亞琴，劉秀娟，韋丹青，鐘紅艦

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，河南 鄭州 450002)

測量不確定度(以下簡稱不確定度)是與測量結(jié)果關(guān)聯(lián)的一個參數(shù)，用于表征合理賦予被測量值的分散性。不確定度不僅能度量測量結(jié)果誤差的大小，也能定量說明測量結(jié)果質(zhì)量的好壞[1-2]。ISO/IEC對不確定度都有明確規(guī)定，檢測報告必須有測量結(jié)果不確定度數(shù)據(jù)及說明[3-4]。對實(shí)驗(yàn)室而言，通過不確定度評估，發(fā)現(xiàn)評價檢測過程中“人、機(jī)、料、法、環(huán)、測”等 6 個管理要素中存在的問題，便于優(yōu)化檢測條件，提高檢測水平。對不確定度進(jìn)行分析是保證檢測結(jié)果可信和準(zhǔn)確的關(guān)鍵，能夠?yàn)閷?shí)現(xiàn)科學(xué)、準(zhǔn)確、可信的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供重要保障。

花青素是廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，具有較強(qiáng)的抗氧化性，能消除人體內(nèi)的自由基，并兼具抗癌、降血壓、軟化血管等保健功效[5]?；ㄇ嗨夭粌H可以作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑，還可以作為天然的食品添加劑[6]。自然界中已知的花青素有20多種，主要用于食品的有6種：天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥素、矮牽牛色素和錦葵色素。自然界中花青素較少以游離態(tài)的形式存在，常與1個或多個葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖等通過糖苷鍵形成花色苷[7]。花青素含量常用檢測方法有紫外分光光度法[8-10]、高效液相色譜法[11-14]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-16]。

本研究根據(jù)參考文獻(xiàn)JJF 1135—2005《化學(xué)分析測量不確定度評定》[17]和JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[1]，并參考JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[18]，結(jié)合檢測方法標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2640—2014《植物源性食品中花青素的測定 高效液相色譜法》[19]，對高效液相色譜法測定黑枸杞中花青素不確定度進(jìn)行評定。黑枸杞中花青素主要有飛燕草色素、矮牽牛色素、芍藥素和錦葵色素，因此，分別對上述4種色素進(jìn)行不確定度評定，找出影響其不確定度的主要因素，為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)儀器與試劑

試驗(yàn)用黑枸杞購于超市。

LC-20AT 高效液相色譜儀(SPD-M20A二極管陣列檢測器)購自日本島津公司；BS224S 分析天平(精確至0.000 1 g)購自德國Sartorius公司；AE240分析天平(精確至0.000 01 g)購自日本Mettler公司；鹽酸(分析純)購自煙臺市雙雙化工有限公司；甲酸(色譜純)購自麥克林公司；甲醇(色譜純)購自美國Fisher公司；試驗(yàn)用水均為超純水；試驗(yàn)所用分度吸量管及容量瓶均為A級。

標(biāo)準(zhǔn)品：飛燕草色素(純度為94.7%)、矢車菊色素(純度為95.0%)、矮牽牛色素(純度為94.1%)、天竺葵色素(純度為93.0%)、芍藥素(純度為97.6%)、錦葵色素(純度為94.8%)，均為鹽酸鹽形式，購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 參照檢測方法標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2640—2014《植物源性食品中花青素的測定 高效液相色譜法》中樣品前處理方法，準(zhǔn)確稱取0.500 0 g樣品于50 mL具塞量筒中，加入無水乙醇+水+鹽酸，V無水乙醇∶V水∶V鹽酸=2∶1∶1，定容至50 mL。搖勻，超聲提取30 min后，于沸水浴中水解1 h。取出冷卻，加入無水乙醇+水+鹽酸，V無水乙醇∶V水∶V鹽酸=2∶1∶1，定容至50 mL。靜置，取上清液，用0.45 μm水相濾膜過濾，待測。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18(2.1 mm×150 mm，5 μm)；流動相組成：流動相A(88%)為1%甲酸水溶液，流動相B(12%)為1%甲酸乙腈溶液；流速：0.5 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；檢測波長：530 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法測定黑枸杞中花青素的不確定度評定數(shù)學(xué)模型的建立

黑枸杞樣品花青素總含量為4種花青素含量之和,其含量以ω表示。樣品中各花青素的含量按下式計算：

式中，ω為樣品中各花青素的含量(mg/kg)；m為樣品質(zhì)量(g)；V1為上機(jī)液定容體積(mL)，V2為分取試液體積(mL)，V3為定容體積(mL)；ρ為待測液中各花青素的質(zhì)量濃度(μg/mL)。

2.2 高效液相色譜法測定黑枸杞中花青素的不確定度來源的識別

分析整個檢測過程，結(jié)合數(shù)學(xué)模型，不確定度主要來源于V1、V2、V3、ρ、m以及測量過程中隨機(jī)效應(yīng)(ωRep)。從測量方法看，各個影響參數(shù)相互獨(dú)立，根據(jù)不確定度傳播規(guī)律，測量結(jié)果的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度用各參數(shù)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度采用方和根法合成：

式中，urel(ω)為測量結(jié)果的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度；urel(m)為樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度；urel(V) 為樣品前處理過程中體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度；urel(ρ) 為待測液中各花青素質(zhì)量濃度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度；urel(ωRep)為測量過程隨機(jī)效應(yīng)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.3 高效液相色譜法測定黑枸杞中花青素的不確定度分量評定

2.3.2 樣品前處理過程中體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度[urel(V)]樣品前處理過程中體積引入的不確定度主要是由V1、V2和V3引起。體積引入的不確定度由容器的3個方面組成：容器允差引入的不確定度、提取液體積因溫差(溫度波動)引入的不確定度和讀數(shù)重復(fù)性引入的不確定度，結(jié)果見表1。

表1 高效液相色譜法測定黑枸杞中花青素樣品前處理過程中容器的不確定度Tab.1 Uncertainty resulting from glass container in determination of anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr.by HPLC

讀數(shù)重復(fù)性引入的不確定度：采用A類評定(不確定度用統(tǒng)計分析的評定方法進(jìn)行評定)，單次量取的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[u(V讀)]用標(biāo)準(zhǔn)偏差[S(V讀)]表示， 用貝塞爾公式計算：

黑枸杞中花青素含量測定按1.2.1進(jìn)行，定容體積(V3)為50 mL。黑枸杞中飛燕草色素、芍藥素和錦葵色素含量較低，提取液不稀釋，直接上機(jī)測定。黑枸杞中矮牽牛色素含量高，提取液稀釋10倍，即用1 mL分度吸量管準(zhǔn)確移取1.000 mL(V2，分取試液體積)提取液定容至10.00 mL(V1，上機(jī)液定容體積)容量瓶中，稀釋液上機(jī)測定黑枸杞中矮牽牛色素含量。分析可知，測定飛燕草色素、芍藥素和錦葵色素時，前處理過程體積引入的不確定度均由50 mL具塞量筒產(chǎn)生；測定矮牽牛色素含量時，前處理過程體積引入的不確定度由1 mL分度吸量管、10 mL容量瓶和50 mL具塞量筒產(chǎn)生，其相互獨(dú)立，采用方和根法求得樣品稀釋過程引入的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，結(jié)果見表2。

表2 高效液相色譜法測定黑枸杞中花青素前處理過程體積引入的不確定度Tab.2 Uncertainty resulting from the volume during sample processing in determination of anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr.by HPLC

2.3.3 待測液中各花青素質(zhì)量濃度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度[urel(ρ)]黑枸杞中飛燕草色素、矮牽牛色素、芍藥素和錦葵色素含量采用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，其不確定度來源由兩方面組成，即標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合時所引入的不確定度。其中標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度、標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制和儲備液稀釋3個部分。

表3 高效液相色譜法測定黑枸杞中花青素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度Tab.3 Uncertainty resulting from the purity of anthocyanidins in determination of anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr.by HPLC

2.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度[urel(C配)](1)花青素標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度[urel(C1)]。用十萬分之一天平分別稱取飛燕草色素、矮牽牛色素、芍藥素、錦葵色素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于10 mL容量瓶中，用10%鹽酸甲醇溶液定容，得到1 mg/mL的花青素標(biāo)準(zhǔn)儲備液。因此，花青素標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制引入的不確定度主要由兩方面組成，即由十萬分之一天平稱量和10 mL容量瓶定容引入的不確定度組成。

(2)標(biāo)準(zhǔn)系列工作液配制過程引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度[urel(C2)]?；ㄇ嗨貥?biāo)準(zhǔn)系列工作液按照圖1進(jìn)行配制，用10%鹽酸甲醇溶液定容，得到質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液?；ㄇ嗨貥?biāo)準(zhǔn)系列工作液配制過程中由量器引入的不確定度見表4。

分析可知，標(biāo)準(zhǔn)系列工作液配制過程中由1、2、5 mL分度吸量管和10 mL容量瓶引入的不確定度分量相互獨(dú)立，可用方和根法求得各花青素在稀釋過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel(C2)=

綜上所述，花青素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

增加壩基砂土層的上覆有效壓力，再加以設(shè)置排水措施，加速輕壤土的排水固結(jié)。2002年中國水利水電科學(xué)研究院對陡河水庫壩基壩體滲流穩(wěn)定分析結(jié)果顯示壩基滲流在正常蓄水位下呈下降趨勢。

2.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度[urel(x0)]將花青素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL，各取5 μL，分別按1.2.2重復(fù)進(jìn)樣3次，以花青素的濃度(Ci)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積(Aji)為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法擬合而成線性回歸方程A=bC+a(式中，a為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的截距，b為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率)，各花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見表5。對黑枸杞中各花青素含量進(jìn)行測定，平行測定6次， 具體見表6。

表4 高效液相色譜法測定黑枸杞花青素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液配制過程所用容器引入的不確定度Tab.4 Uncertainty resulting from stock solution dilution by glass container in determination of anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr.by HPLC

圖1 高效液相色譜法測定黑枸杞中花青素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的配制流程 Fig.1 Preparation process of standard series working fluid in determination of anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr.by HPLC

表5 高效液相色譜法測定黑枸杞花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Tab.5 Results of standard curves in determination of anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr.by HPLC

續(xù)表5 高效液相色譜法測定黑枸杞花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Tab.5 (Continued)Results of standard curves in determination of anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr.by HPLC

表6 高效液相色譜法測定的黑枸杞中花青素含量Tab.6 Determination results of anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr.by HPLC

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差(S)、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度殘差平方和(Sxx)、由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合求得待測液中花青素含量而引入的不確定度[u(x0)]的計算公式分別如下：

黑枸杞中花青素含量由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(x0)=u(x0)/x0，具體見表7。

表7 高效液相色譜法測定黑枸杞中花青素最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度相關(guān)量Tab.7 Uncertainty resulting from curve fitting in determination of anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr.by HPLC

表8 高效液相色譜法測定黑枸杞中花青素由樣品待測液質(zhì)量濃度引入的不確定度Tab.8 Uncertainty resulting from mass concentration of tested sample in determination of anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr.by HPLC

2.4 高效液相色譜法測定黑枸杞中花青素測量結(jié)果的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度[urel(ω)]

總結(jié)上述各不確定度分量(表10)，將各分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成為各花青素測量結(jié)果的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度[urel(ω)]。

表9 高效液相色譜法測定黑枸杞中花青素由測量過程隨機(jī)效應(yīng)引入的不確定度 Tab.9 Uncertainty resulting from random effects in determination of anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr.by HPLC

表10 高效液相色譜法測定黑枸杞中花青素各不確定度分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Tab.10 List of relative standard uncertainty components in determination of anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr.by HPLC

2.5 高效液相色譜法測定黑枸杞中花青素的不確定度表示方式

2.5.1 用標(biāo)準(zhǔn)不確定度[u(ω)]表示 若試驗(yàn)測定黑枸杞中各花青素的含量為ω(mg/kg)，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(ω)=ω×urel(ω)，黑枸杞中花青素含量用標(biāo)準(zhǔn)不確定度表示，具體見表11。以黑枸杞中飛燕草色素為例，6次測量飛燕草色素含量，其平均值為415.70 mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(ω)=ω×urel(ω)=415.70×0.060 492=25.15 mg/kg。用標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果表示為ω=415.70 mg/kg，u(ω)=25.15 mg/kg。

表11 高效液相色譜法測定黑枸杞中花青素含量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度表示方式Tab.11 Results expressed by standard uncertainty and expanded uncertainty in determination of anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr.by HPLC

2.5.2 用擴(kuò)展不確定度(u95)表示 根據(jù)測量不確定度評定指南對一般實(shí)驗(yàn)室的要求，查表得，在包含概率P=95%時，包含因子k=2，因此相對擴(kuò)展不確定度u95,rel=k×urel(ω)。若試驗(yàn)測定黑枸杞中花青素的含量為ω(mg/kg)，則擴(kuò)展不確定度u95=ω×u95,rel=ω×k×urel(ω)=k×u(ω)。黑枸杞中花青素含量用擴(kuò)展不確定度表示，具體見表11。以黑枸杞中飛燕草色素為例，6次測量飛燕草色素含量，其平均值為415.70 mg/kg，取包含因子k=2，包含概率P=95%，擴(kuò)展不確定度u95=k×u(ω)= 2×25.15=50.30 mg/kg。用擴(kuò)展不確定度結(jié)果表示為u95=(415.70 ± 50.30)mg/kg，k=2。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用高效液相色譜法測定黑枸杞中花青素的含量，根據(jù)測定不確定度的評定方法建立數(shù)學(xué)模型，分析整個測量過程中不確定度來源對其分析結(jié)果的影響，為提高黑枸杞花青素檢測的準(zhǔn)確性提供依據(jù)。本研究系統(tǒng)深入地對樣品稱量、前處理過程體積(包含玻璃器皿的容量允差、溫度波動、讀數(shù)重復(fù)性)、花青素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的配制(包含標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制和標(biāo)準(zhǔn)儲備液的稀釋)和測量過程隨機(jī)效應(yīng)等因素進(jìn)行綜合評定。結(jié)果表明，由測量過程隨機(jī)效應(yīng)引入的不確定度最大，其次是由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的配制、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度和樣品前處理過程體積產(chǎn)生的不確定度，而樣品稱量引入的不確定度可忽略不計。黑枸杞中花青素含量分別用標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度表示，當(dāng)黑枸杞中花青素含量介于21.40～2 745.00 mg/kg時，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度介于0.87～163.76 mg/kg，擴(kuò)展不確定度介于1.75～327.52 mg/kg(k=2)。

因此，使用高效液相色譜測定花青素含量時，應(yīng)根據(jù)各不確定度分量加強(qiáng)準(zhǔn)確測量，注意以下幾點(diǎn)：(1)樣品的均勻性?；ㄇ嗨睾扛叩臉悠罚Q樣量少，試驗(yàn)前應(yīng)混合均勻，增加平行樣的測定。(2)花青素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度。由于花青素的提純技術(shù)要求高，難度大，因此，目前市場上的花青素標(biāo)準(zhǔn)品的純度都很難達(dá)到98%以上。此外，花青素標(biāo)準(zhǔn)品不穩(wěn)定，極易受到環(huán)境的影響。在日常檢測過程要嚴(yán)格按要求,于-18 ℃存儲花青素標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)儲備液，并密切關(guān)注其濃度的動態(tài)變化。(3)由于樣品中各花青素的含量高低不一，合理稀釋樣品并選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液范圍進(jìn)行定量，增加測定次數(shù)，增加平行樣品的測定。(4)注意標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制過程及提升檢測人員的試驗(yàn)操作水平等，以確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。