• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    木槿ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

    2019-06-28 01:12:32任雪羽王曉紅
    河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年6期
    關(guān)鍵詞:木槿條帶用量

    任雪羽,王曉紅,肖 芬,周 英

    (中南林業(yè)科技大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410004)

    簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性,又稱ISSR(Inter-simple sequence repeat)分子標(biāo)記技術(shù),是在PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)上,利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行樣本檢測(cè)的DNA分子標(biāo)記[1]。具有模板需求量少、多態(tài)性豐富、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、信息量大等優(yōu)點(diǎn)[2],現(xiàn)已廣泛運(yùn)用于植物遺傳多樣性檢測(cè)[3-5]、親緣關(guān)系分析[6-8]、品種鑒定[9-11]及誘變育種材料的鑒定與選擇[12-14]研究中。木槿(HibiscussyriacusL.)為錦葵科木槿屬植物,開花于少花的夏秋季節(jié),花大色艷,花期長(zhǎng),是優(yōu)良的園林觀花樹種,兼具藥用與食用價(jià)值。目前,國(guó)內(nèi)主要研究集中在木槿繁殖技術(shù)[15-16]、抗性水平[17-18]等方面,對(duì)木槿的分子生物學(xué)研究較為落后。鑒于此,探索適宜木槿各品種的ISSR-PCR反應(yīng)體系并進(jìn)行優(yōu)化,為開展木槿分子水平研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 植物材料 于湖南省長(zhǎng)沙市中南林業(yè)科技大學(xué)木槿苗圃中,采集紫花單瓣、馬麗娜、白綢、玫瑰紅、中國(guó)薄綢、紫玉、牡丹木槿、木橋、大白花、薰衣草、哈馬博、雅致木槿、薰衣草薄綢、白花重瓣、紫柱、藍(lán)鳥、紅心、千層紅、紅暈、花斑、漢桑、阿娘、茹碧、忠武等24個(gè)木槿品種(編號(hào)分別為CK和1—23)的頂芽向下第2~4片葉片進(jìn)行試驗(yàn)。采摘后放入液氮中備用。

    1.1.2 生化試劑 320高效植物基因組提取試劑盒(DP320)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;瓊脂糖、Gene Green核酸染料、Taq酶(R001AM)均購(gòu)自Takara寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)UBC公司2006 年公布的引物序列,由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

    1.2 方法

    1.2.1 基因組DNA提取與檢測(cè) 使用天根320高效植物基因組DNA 提取試劑盒提取葉片DNA[19]。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA的完整性,采用BIO-RAD Doc-2000自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

    1.2.2 ISSR-PCR體系的建立與優(yōu)化 以紫花單瓣木槿DNA為模板,以初步篩選的UBC899號(hào)引物,即5′-CATG(GT)2TGGTCATTGTTCCA-3′,作為固定引物,對(duì)影響ISSR-PCR擴(kuò)增的主要參數(shù)進(jìn)行L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1),每個(gè)處理重復(fù)2次。各處理總體積為25 μL,均加入2.5 μL 10×buffer(Mg2+free),不足用超純水補(bǔ)足。

    表1 ISSR-PCR反應(yīng)體系中各因素的配比設(shè)置

    在PCR儀(BIO-RAD S1000 Thermal Cycler)上設(shè)置擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min; 94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,34 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸6 min,4 ℃保溫。

    根據(jù)正交試驗(yàn)篩選出的最優(yōu)組合進(jìn)行退火溫度單因素試驗(yàn)。溫度設(shè)置以引物Tm值為基準(zhǔn)上下浮動(dòng)1~2 ℃。設(shè)置了50~60 ℃的退火溫度區(qū)間。

    1.2.3 ISSR-PCR產(chǎn)物檢測(cè) 將10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與2 μL Loading Buffer混勻,加入1.2%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中。電壓110 V,電泳25 min后于自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)上觀察拍照。對(duì)各組擴(kuò)增條帶打分:條帶表現(xiàn)清晰穩(wěn)定,多態(tài)性高,記16 分;沒有條帶,記1 分。

    1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    用EXCEL對(duì)正交試驗(yàn)的分值進(jìn)行直觀分析,求出同一因素同一水平下的均值ki,及同一因素不同水平下平均值的極差R值。用SPSS 22.0進(jìn)行正交試驗(yàn)因素間的方差分析及Duncan’s多重比較。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 基因組DNA提取效果分析

    通過凝膠電泳檢測(cè),發(fā)現(xiàn)提取的木槿DNA質(zhì)量較好,亮度高,主帶清晰,無拖帶(圖1),符合后續(xù)PCR擴(kuò)增要求。

    圖1 部分木槿品種基因組DNA電泳結(jié)果Fig.1 Detection of genomic DNA of some materials by electrophoresis

    2.2 ISSR-PCR體系的建立與優(yōu)化

    2.2.1 PCR正交試驗(yàn)直觀分析 如圖2所示,在16個(gè)反應(yīng)組合中,第5、6、9、10組沒有擴(kuò)出條帶,其余組合均擴(kuò)增出可見條帶。

    極差R值反映不同因素對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響程度。R越大,影響越顯著。由表2可以看出,各因素對(duì)木槿ISSR(25 μL)反應(yīng)體系的影響依次為:Mg2+濃度>Taq酶用量>dNTPs濃度>模板DNA用量>引物濃度。平均值ki則反映了因素在該水平下對(duì)反應(yīng)體系的影響程度。結(jié)合圖2可直觀看出,16個(gè)組合中,第8組擴(kuò)增效果最好,其直觀分析分值最高。為了進(jìn)一步確定木槿PCR體系的最優(yōu)組合,進(jìn)行方差分析。

    泳道1—16分別對(duì)應(yīng)表1正交組合編號(hào);M.D2000 Marker

    2.2.2 PCR正交試驗(yàn)方差分析 方差分析結(jié)果表明,Taq酶用量、Mg2+濃度、dNTPs濃度的P小于0.01(表3),即Taq酶用量、Mg2+濃度、dNTPs濃度對(duì)木槿PCR反應(yīng)體系有極顯著影響。模板DNA用量和引物濃度的P大于0.05,則二者對(duì)PCR體系無顯著影響。同時(shí),由F值可知,Taq酶用量、Mg2+濃度、dNTPs濃度三因素對(duì)反應(yīng)體系的重要性與直觀分析一致,可對(duì)三因素進(jìn)行多重比較。

    表2 不同因素影響下PCR擴(kuò)增結(jié)果直觀分析

    表3 不同因素影響下PCR擴(kuò)增結(jié)果方差分析

    續(xù)表3 不同因素影響下PCR擴(kuò)增結(jié)果方差分析

    注:**代表在0.01水平差異顯著。

    Note:** means significant difference at 0.01 level.

    Mg2+濃度對(duì)反應(yīng)體系的影響最大,且隨濃度增加而上升,當(dāng)濃度為2.0 mmol/L時(shí)均值最高(圖3)。同時(shí)從泳道條帶擴(kuò)增有無的情況可直觀看出Mg2+濃度對(duì)于PCR反應(yīng)體系的重要性,以2.0 mmol/L Mg2+為該體系中最佳水平。

    Taq酶用量在PCR反應(yīng)體系中的影響水平僅次于Mg2+濃度。Taq酶用量過高或過低均易產(chǎn)生非特異性條帶,致使條帶減弱,清晰度下降[20]。故從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā),選擇0.75 U為Taq酶最佳反應(yīng)用量。

    dNTPs濃度為0.10 mmol/L時(shí)與其余三水平有極顯著差異,且均值隨dNTPs濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)(圖3)。從電泳結(jié)果來看,泳道2、8、11、13均能擴(kuò)出較為清晰的條帶。故可認(rèn)為,0.10 mmol/L dNTPs為最佳水平。

    圖3 不同Mg2+濃度、Taq酶用量、dNTPs濃度下估計(jì)邊際平均值多重比較分析Fig.3 Multiple comparative analysis of estimated marginal mean values at different Mg2+ concentration, Taq enzyme dosage and dNTPs concentration

    2.2.3 退火溫度對(duì)木槿ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響 50~60 ℃的退火溫度區(qū)間擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示,以泳道G、H兩者最佳,即50.9、50.0 ℃。其中,50.0 ℃下電泳的條帶清晰,亮度高,故選擇50.0 ℃作為最佳退火溫度。

    2.3 木槿最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的驗(yàn)證

    以紫花單瓣木槿為對(duì)照,對(duì)建立的ISSR-PCR反應(yīng)體系并隨機(jī)引物UBC 822號(hào)進(jìn)行24個(gè)木槿品種擴(kuò)增驗(yàn)證,電泳結(jié)果如圖5所示。擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定,無拖帶,多態(tài)性高。證明所得反應(yīng)體系與反應(yīng)程序?qū)δ鹃染哂羞m宜性與穩(wěn)定性。

    A—H泳道退火溫度分別為60.0、59.3、58.1、56.3、54.0、52.3、50.9、50.0 ℃;M.D2000 Marker

    圖5 最佳反應(yīng)體系并隨機(jī)引物UBC822號(hào)對(duì)24個(gè)木槿品種的擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Amplification of 24 Hibiscus species by the optimal reaction system with random primer UBC822

    3 結(jié)論與討論

    目前, ISSR-PCR試驗(yàn)條件常用的優(yōu)化方法有2種,即單因子優(yōu)化法和正交試驗(yàn)優(yōu)化法[20]。單因子優(yōu)化法是對(duì)各影響因素單獨(dú)研究,擁有操作簡(jiǎn)單快捷的優(yōu)點(diǎn),但工作量大,不能兼顧各影響因素之間的相互作用,故運(yùn)用較少;而正交試驗(yàn)法,在減少試驗(yàn)次數(shù)與工作量的同時(shí),可均衡分散、綜合各因素對(duì)結(jié)果的影響,是一種高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,能夠較快地找到最優(yōu)水平組合[21]。

    本試驗(yàn)綜合運(yùn)用了2種試驗(yàn)方法,分析了各因素對(duì)木槿ISSR-PCR體系的影響,最終得出了適宜木槿ISSR-PCR的反應(yīng)體系(25 μL):10×buffer(Mg2+free)2.5 μL、Taq酶0.75 U、Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 0.10 mmol/L、模板DNA 100 ng、引物濃度0.5 μmol/L。最佳退火溫度為50.0 ℃。

    猜你喜歡
    木槿條帶用量
    2021年日本鈦加工材在各個(gè)領(lǐng)域用量統(tǒng)計(jì)
    《木槿》
    大豆種植意向增加16.4%化肥用量或?qū)p少
    書畫影苑
    中老年保健(2018年3期)2018-07-12 03:26:20
    Side force controlon slender body by self-excited oscillation flag
    挽留
    詩(shī)林(2016年5期)2016-10-25 06:07:54
    基于條帶模式GEOSAR-TOPS模式UAVSAR的雙基成像算法
    農(nóng)戶如何稱取和配制小用量固體農(nóng)藥
    人間(2015年11期)2016-01-09 13:12:58
    基于 Savitzky-Golay 加權(quán)擬合的紅外圖像非均勻性條帶校正方法
    一種基于MATLAB的聲吶條帶圖像自動(dòng)拼接算法
    海岸工程(2014年4期)2014-02-27 12:51:28
    精品久久久久久久末码| 午夜精品在线福利| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产成人aa在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 国产免费男女视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品免费一区二区三区在线| a级毛片a级免费在线| tocl精华| 99久久成人亚洲精品观看| 不卡av一区二区三区| 久久精品人妻少妇| 久久香蕉国产精品| 久久久国产成人免费| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 曰老女人黄片| 亚洲成人精品中文字幕电影| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产精品一区二区免费欧美| 又紧又爽又黄一区二区| 精品国产三级普通话版| 日日干狠狠操夜夜爽| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 曰老女人黄片| 午夜福利欧美成人| 日本免费a在线| 久久这里只有精品19| 欧美最黄视频在线播放免费| 身体一侧抽搐| 国产精品一区二区三区四区久久| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产亚洲欧美98| 久久久久久久久中文| 国产99白浆流出| 宅男免费午夜| 俺也久久电影网| 久久伊人香网站| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 波多野结衣高清无吗| 国产三级黄色录像| 国产欧美日韩一区二区精品| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 中文亚洲av片在线观看爽| 99久久精品热视频| 久久亚洲真实| 国产久久久一区二区三区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 一区二区三区高清视频在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| a在线观看视频网站| 亚洲av电影不卡..在线观看| 成人国产综合亚洲| 日本 av在线| 久久99热这里只有精品18| 成在线人永久免费视频| 久久草成人影院| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 精品人妻1区二区| 舔av片在线| 一a级毛片在线观看| 亚洲九九香蕉| 久久草成人影院| 国产精品乱码一区二三区的特点| 男女午夜视频在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 精品久久蜜臀av无| 手机成人av网站| 99re在线观看精品视频| a级毛片在线看网站| 亚洲国产精品久久男人天堂| 麻豆一二三区av精品| 亚洲中文日韩欧美视频| 麻豆国产av国片精品| 欧美色视频一区免费| 给我免费播放毛片高清在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产精华一区二区三区| 亚洲欧美激情综合另类| 欧美中文综合在线视频| 国产精品电影一区二区三区| 中文资源天堂在线| 亚洲精品在线美女| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲av熟女| 99在线视频只有这里精品首页| 国产激情久久老熟女| 国产乱人伦免费视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产视频内射| 婷婷亚洲欧美| 久久精品国产清高在天天线| 麻豆国产av国片精品| 国产1区2区3区精品| 波多野结衣高清无吗| 日韩欧美免费精品| 日本在线视频免费播放| 亚洲一区二区三区色噜噜| 88av欧美| 三级毛片av免费| 亚洲一区二区三区不卡视频| 最新中文字幕久久久久 | 成人三级做爰电影| 婷婷精品国产亚洲av| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产成人精品无人区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 女同久久另类99精品国产91| 免费高清视频大片| 国产日本99.免费观看| 国产免费男女视频| 黄色女人牲交| 青草久久国产| 亚洲av片天天在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 日本a在线网址| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 黄色成人免费大全| 99热只有精品国产| 久99久视频精品免费| 91在线观看av| 婷婷六月久久综合丁香| 久久久国产成人免费| 欧美日本视频| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 搡老岳熟女国产| 久久精品91无色码中文字幕| 欧美最黄视频在线播放免费| 91av网一区二区| 18美女黄网站色大片免费观看| 观看免费一级毛片| 又粗又爽又猛毛片免费看| 日本av手机在线免费观看| 99久久人妻综合| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久久久久久午夜电影| 亚洲欧美精品综合久久99| 免费av不卡在线播放| 国产成年人精品一区二区| 午夜激情福利司机影院| 国产精品乱码一区二三区的特点| 日日撸夜夜添| 午夜激情欧美在线| 伦理电影大哥的女人| 爱豆传媒免费全集在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 中文资源天堂在线| 国产成人91sexporn| 麻豆成人午夜福利视频| 搞女人的毛片| 精品午夜福利在线看| 在线免费观看不下载黄p国产| 色5月婷婷丁香| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 一区二区三区免费毛片| 午夜视频国产福利| 亚洲怡红院男人天堂| 老司机影院成人| 国产精品不卡视频一区二区| 日韩制服骚丝袜av| 久久人人爽人人片av| 久久久久国产网址| 高清av免费在线| 麻豆av噜噜一区二区三区| 91精品一卡2卡3卡4卡| 欧美又色又爽又黄视频| 色综合站精品国产| 午夜精品在线福利| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 国产高清视频在线观看网站| 卡戴珊不雅视频在线播放| 成人鲁丝片一二三区免费| 日韩一区二区视频免费看| 国产免费男女视频| 国产精品福利在线免费观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲18禁久久av| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久6这里有精品| 99热6这里只有精品| av在线老鸭窝| 欧美日韩综合久久久久久| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美日韩在线观看h| 我要搜黄色片| 国产成人精品一,二区| 日本与韩国留学比较| 日韩av在线大香蕉| 国产午夜精品一二区理论片| 我的女老师完整版在线观看| 国产精品伦人一区二区| 国产精品一区二区性色av| 69人妻影院| 久久人妻av系列| 2022亚洲国产成人精品| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 麻豆av噜噜一区二区三区| 久久草成人影院| 亚洲国产最新在线播放| 国产精品久久电影中文字幕| 久久这里有精品视频免费| 在线免费十八禁| 99久久无色码亚洲精品果冻| 美女高潮的动态| 亚洲成av人片在线播放无| 日韩人妻高清精品专区| 国产高清视频在线观看网站| 性色avwww在线观看| 高清毛片免费看| 亚洲在久久综合| 亚洲欧美精品专区久久| 男女边吃奶边做爰视频| 国产美女午夜福利| 日韩一区二区视频免费看| 国产精品综合久久久久久久免费| 看非洲黑人一级黄片| 91精品伊人久久大香线蕉| 极品教师在线视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 欧美成人a在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 久久99热这里只有精品18| 久久精品国产亚洲网站| 国产免费福利视频在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美潮喷喷水| 国产成人91sexporn| 成年免费大片在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 在线观看美女被高潮喷水网站| 99久久成人亚洲精品观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 日本欧美国产在线视频| 看免费成人av毛片| or卡值多少钱| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 麻豆成人av视频| 五月玫瑰六月丁香| 欧美成人午夜免费资源| 精品人妻视频免费看| 欧美色视频一区免费| 白带黄色成豆腐渣| 中国国产av一级| 亚洲人成网站高清观看| 久久99热这里只有精品18| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产免费福利视频在线观看| 丰满少妇做爰视频| 国产精品国产高清国产av| 欧美性猛交黑人性爽| 国产乱人偷精品视频| av在线观看视频网站免费| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲最大成人中文| 国产精品女同一区二区软件| 国产在线男女| 久久精品影院6| 直男gayav资源| 亚洲欧美日韩无卡精品| 在线免费观看不下载黄p国产| 一级黄色大片毛片| 69av精品久久久久久| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 日韩欧美国产在线观看| 国产 一区精品| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产老妇女一区| 观看美女的网站| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲自偷自拍三级| 精品久久久久久久久久久久久| 欧美又色又爽又黄视频| 国产精品一区www在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 国产高清有码在线观看视频| 国产精品99久久久久久久久| 青春草亚洲视频在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 亚州av有码| 成年av动漫网址| 日韩欧美精品v在线| 51国产日韩欧美| 国产免费福利视频在线观看| 春色校园在线视频观看| 夫妻性生交免费视频一级片| av卡一久久| 内射极品少妇av片p| 有码 亚洲区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 久久久成人免费电影| 婷婷色av中文字幕| 免费看a级黄色片| 国产真实乱freesex| 欧美区成人在线视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 麻豆一二三区av精品| 国产成年人精品一区二区| 别揉我奶头 嗯啊视频| av国产免费在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 久热久热在线精品观看| 亚洲欧美精品专区久久| 国产69精品久久久久777片| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 六月丁香七月| av福利片在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 大香蕉久久网| 99久久无色码亚洲精品果冻| 伦理电影大哥的女人| 日本爱情动作片www.在线观看| 成人欧美大片| 久久人人爽人人爽人人片va| 啦啦啦韩国在线观看视频| 七月丁香在线播放| av黄色大香蕉| 色吧在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 日日撸夜夜添| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 在线播放无遮挡| 精品久久国产蜜桃| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产精品,欧美在线| 国产精品永久免费网站| 草草在线视频免费看| 亚洲av不卡在线观看| 日本色播在线视频| 久久久久久久国产电影| 26uuu在线亚洲综合色| 国产精品蜜桃在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 最新中文字幕久久久久| 91av网一区二区| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲激情五月婷婷啪啪| a级毛色黄片| 男人舔奶头视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日日啪夜夜撸| 国产视频内射| 哪个播放器可以免费观看大片| 日韩一区二区三区影片| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产精品国产三级国产专区5o | 又爽又黄无遮挡网站| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美又色又爽又黄视频| 韩国高清视频一区二区三区| 国产真实伦视频高清在线观看| 少妇熟女欧美另类| 91aial.com中文字幕在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 久久精品人妻少妇| 99热这里只有是精品在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 久久久久网色| 国内精品一区二区在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 水蜜桃什么品种好| 国产精品乱码一区二三区的特点| 村上凉子中文字幕在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 99热这里只有是精品50| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产精品,欧美在线| 成年免费大片在线观看| 国产精品久久久久久久电影| 搡老妇女老女人老熟妇| 中文字幕久久专区| 少妇被粗大猛烈的视频| 熟女人妻精品中文字幕| .国产精品久久| 免费大片18禁| 日韩视频在线欧美| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产淫片久久久久久久久| av在线蜜桃| 能在线免费观看的黄片| 欧美又色又爽又黄视频| 一级av片app| 久久国产乱子免费精品| 国产91av在线免费观看| 国产精品,欧美在线| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 床上黄色一级片| 99久久精品一区二区三区| 国产精品日韩av在线免费观看| 可以在线观看毛片的网站| 少妇的逼好多水| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 我要搜黄色片| 国产精品1区2区在线观看.| 一级毛片我不卡| 亚洲中文字幕日韩| 乱系列少妇在线播放| 日韩一本色道免费dvd| 久99久视频精品免费| 久久久午夜欧美精品| 秋霞在线观看毛片| 日韩中字成人| 国产av一区在线观看免费| 婷婷六月久久综合丁香| 黄色欧美视频在线观看| 久久久久久大精品| 欧美激情国产日韩精品一区| 91久久精品国产一区二区成人| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产毛片a区久久久久| 免费搜索国产男女视频| 少妇高潮的动态图| 99久久精品国产国产毛片| 中文天堂在线官网| 女人被狂操c到高潮| 91aial.com中文字幕在线观看| 欧美3d第一页| 日韩精品有码人妻一区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 亚洲国产精品专区欧美| 精品国内亚洲2022精品成人| 成人漫画全彩无遮挡| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产在视频线精品| 日韩人妻高清精品专区| 久热久热在线精品观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久久a久久爽久久v久久| 国产成人福利小说| 内射极品少妇av片p| 亚洲精品影视一区二区三区av| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 美女内射精品一级片tv| 午夜福利网站1000一区二区三区| 免费黄色在线免费观看| 精品久久久久久久久亚洲| 天堂影院成人在线观看| 亚洲国产欧美人成| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 色噜噜av男人的天堂激情| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 少妇裸体淫交视频免费看高清| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 国产单亲对白刺激| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美3d第一页| 亚洲欧美日韩无卡精品| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 性色avwww在线观看| 女人久久www免费人成看片 | 伊人久久精品亚洲午夜| 国产视频首页在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 少妇丰满av| 如何舔出高潮| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 久久99精品国语久久久| 丝袜美腿在线中文| 国产成人freesex在线| av在线播放精品| 精品酒店卫生间| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲经典国产精华液单| 丰满少妇做爰视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 九九在线视频观看精品| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 嫩草影院入口| 免费av不卡在线播放| 一区二区三区免费毛片| av福利片在线观看| av卡一久久| 国产精品1区2区在线观看.| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 熟女人妻精品中文字幕| 男的添女的下面高潮视频| 国产淫片久久久久久久久| 午夜福利网站1000一区二区三区| 性色avwww在线观看| 人体艺术视频欧美日本| 成人无遮挡网站| av天堂中文字幕网| 97热精品久久久久久| 欧美最新免费一区二区三区| 精品久久久久久久末码| av福利片在线观看| 成人无遮挡网站| 全区人妻精品视频| 男女边吃奶边做爰视频| 成人欧美大片| 一级毛片电影观看 | 精品免费久久久久久久清纯| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美性猛交黑人性爽| 少妇的逼水好多| 男女国产视频网站| 麻豆一二三区av精品| 九九热线精品视视频播放| 成人综合一区亚洲| 国产黄a三级三级三级人| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产成人精品婷婷| 国产激情偷乱视频一区二区| 一级毛片电影观看 | 久久久午夜欧美精品| 色视频www国产| 国产真实伦视频高清在线观看| 成年免费大片在线观看| 国产精品无大码| 午夜福利成人在线免费观看| 婷婷六月久久综合丁香| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲综合色惰| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲内射少妇av| 日韩欧美在线乱码| 综合色丁香网| 精品酒店卫生间| 能在线免费看毛片的网站| 国内精品宾馆在线| 精品熟女少妇av免费看| 最近的中文字幕免费完整| 日本色播在线视频| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产精品电影一区二区三区| 深爱激情五月婷婷| 亚洲经典国产精华液单| 午夜免费激情av| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 成人综合一区亚洲| 欧美bdsm另类| 在线播放国产精品三级| 久久久成人免费电影| 久久人妻av系列| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产探花在线观看一区二区| 乱人视频在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 久久精品影院6| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产一区亚洲一区在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 天天一区二区日本电影三级| 嫩草影院入口| 身体一侧抽搐| 免费在线观看成人毛片| 久久国产乱子免费精品| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲自偷自拍三级| 日韩欧美在线乱码| av在线播放精品| 国产av码专区亚洲av| 在线免费十八禁| 中文欧美无线码| 日本三级黄在线观看| 日韩大片免费观看网站 | 国产av码专区亚洲av| 成人av在线播放网站| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产成人91sexporn| 99久久精品一区二区三区| 超碰av人人做人人爽久久| h日本视频在线播放| 亚洲真实伦在线观看| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 九色成人免费人妻av| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 永久免费av网站大全| 久久精品夜色国产| 免费观看a级毛片全部| 国产v大片淫在线免费观看| 日韩三级伦理在线观看| 国产成人一区二区在线| av国产久精品久网站免费入址| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 一区二区三区乱码不卡18| 国产精品1区2区在线观看.| 免费观看的影片在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男|