獸用口服地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)的構建及其性質考察

時菲菲，丁 寧，周 芳，高建如，董培培，于生蘭

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院 動物藥學院，江蘇 泰州 225300)

地克珠利(Diclazuril)，化學名氯嗪苯乙氰，是三嗪類化學合成抗球蟲藥物，20世紀80年代由楊森公司開發(fā)，該藥物具有高效、低毒、廣譜等優(yōu)點，對球蟲發(fā)育的各個階段均具有有效的殺滅作用[1]，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)的球蟲病預防和治療中效果顯著[2-3]。但地克珠利具有水溶性差的缺點，目前在獸藥市場中應用劑型較少，主要以預混劑為主，極大限制了該藥物在臨床中的應用。同時由于地克珠利在臨床治療中所應用的劑量較低，其預混劑在使用過程中常出現(xiàn)難以與飼料充分混勻的問題，從而導致畜禽群體的給藥劑量均勻性差，治療效果不均一。納米乳(Nanoemulsion)遞藥系統(tǒng)是指粒徑在1～100 nm，外觀澄清、透明且動力學和熱力學穩(wěn)定的體系[4]，它具有增加難溶性藥物的溶解度和生物利用度[5-7]等優(yōu)點。近年來，納米乳遞藥系統(tǒng)已成功用于透皮、口服和注射給藥等多種給藥途徑[8-11]。本研究通過構建獸用口服地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)，來提高地克珠利的溶解性并解決其臨床給藥均勻性差的問題，從而有效提高地克珠利的生物利用度，進一步擴大地克珠利的臨床應用。

1 材料和方法

1.1 主要藥品與儀器

地克珠利(批號為M0222A，95%)購自大連美侖生物技術有限公司，大豆油(批號為P1246926，藥用級)購自上海泰坦科技股份有限公司，N,N-二甲基甲酰胺、蓖麻油聚氧乙烯醚(EL-40)、聚乙二醇400(PEG400)均購自成都艾科達化學試劑有限公司。

激光粒度分析儀(Zetasizer Nano ZS型)購自英國Malvern instrument公司，透射電子顯微鏡(HT7700)購自日本Hitachi公司，磁力攪拌器(JB-2型)購自上海雷磁新涇儀器有限公司，高速離心機(3K30型)購自德國Sigma公司。

1.2 地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)的處方篩選與制備

1.2.1 油相的篩選 分別取2 mL的肉豆蔻酸異丙酯(IPM)、大豆油、橄欖油于5 mL具塞西林瓶中，分別加入過量地克珠利，利用渦旋混合器混勻10 min，于(37±0.5)℃水浴振蕩器中振蕩72 h后，于3 000 r/min離心15 min，取上清液于277 nm波長處測定吸光度，比較地克珠利在各油相中的溶解度大小，確定適當?shù)挠拖唷?/p>

1.2.2 表面活性劑的篩選 選取EL-40、氫化蓖麻油脂(RH-40)、吐溫-80、吐溫-85共4種表面活性劑，分別與純水混合制備成2.5 mL的15%表面活性劑水溶液，加入5.0 μL的油相并充分渦旋，待溶液澄清后繼續(xù)加入5.0 μL的油相，直至溶液最終渾濁，選擇油相溶解性最好的表面活性劑用于制備地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)。

1.2.3 助表面活性劑的篩選 將篩選出的表面活性劑分別與助表面活性劑乙醇(Ethanol)、異丙醇(IPA)、正丁醇(n-butanol)、PEG400按照表面活性劑-助表面活性劑體積比(Vmix)為1∶1進行混合，再與油相分別按體積比為1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、6∶4(1∶0.70)、7∶3(1∶0.43)、9∶1進行混合制備空白納米乳，記錄納米乳體系由渾濁變澄清時各組分體積的百分比，最后分別以Vmix、油相、水相為頂點，利用Origin Pro 8.0軟件繪制偽三元相圖，篩選最佳助表面活性劑。

1.2.4 表面活性劑-助表面活性劑最佳體積比(Smix)篩選 篩選出的Vmix分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶0、1∶2、1∶3，再按照Vmix-油相體積比為1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、6∶4(1∶0.70)、7∶3(1∶0.43)、9∶1進行混合制備空白納米乳，記錄納米乳體系由渾濁變澄清時各組分體積的百分比，最后分別以Vmix、油相、水相為頂點，利用Origin Pro 8.0軟件繪制偽三元相圖，分析相圖篩選出Smix。

1.2.5 Smix-油相體積比篩選 分析1.2.4中繪制的偽三元相圖，篩選出理想的Smix-油相體積比，以確定處方組成。

1.2.6 地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)樣品的制備 根據(jù)篩選出的油相、表面活性劑、助表面活性劑最佳種類及用量制備地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)。取處方量地克珠利于50 ℃水浴條件下0.1 mL的N,N-二甲基甲酰胺中，與處方量油相、表面活性劑、助表面活性劑在磁力攪拌器下攪拌2 min混合均勻。邊攪拌邊向混合溶液中滴加蒸餾水，至溶液澄清、透明、流動性好。

1.3 地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)的性質考察

1.3.1 外觀鑒別 肉眼觀察制備的樣品溶液是否呈現(xiàn)澄清、透明或半透明并伴有淡藍色乳光，且當平行光射入時有丁達爾現(xiàn)象。

1.3.2 類型判定 分別向樣品溶液中加入紅色油溶性染料蘇丹紅Ⅲ和藍色水溶性染料亞甲基藍，利用2種染料在其中的擴散速度鑒別類型。若藍色擴散速度明顯快于紅色擴散速度，可判定為水包油(O/W)型；若紅色擴散速度明顯快于藍色擴散速度，可判定為油包水(W/O)型。

1.3.3 冷-熱循環(huán)穩(wěn)定性檢測 將3 mL樣品置于5 mL具塞西林瓶中，于4 ℃恒溫條件下放置48 h，取出后再于45 ℃恒溫條件下放置48 h，冷-熱循環(huán)共6次，考察地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)的冷-熱循環(huán)穩(wěn)定性。

1.3.4 離心穩(wěn)定性檢測 經(jīng)冷-熱循環(huán)穩(wěn)定性考察后的樣品于12 000 r/min下高速離心15 min，觀察其外觀性狀是否發(fā)生變化，判定地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)的離心穩(wěn)定性。

1.3.5 凍-融穩(wěn)定性檢測 經(jīng)離心穩(wěn)定性考察后的樣品于-25 ℃恒溫條件下放置48 h，取出后再于25 ℃恒溫條件下放置48 h，考察地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)的凍-融穩(wěn)定性。

1.3.6 粒徑分布及Zeta電位檢測 取樣品溶液并分別稀釋10、100、1 000倍后于激光粒度分析儀下測定粒徑分布和Zeta電位值。

1.3.7 微觀形態(tài)觀察 取適量樣品溶液，用蒸餾水將其稀釋100倍，滴在覆有支持膜的銅網(wǎng)上，靜置20 min，濾紙吸干。滴加2%磷鎢酸溶液負染5 min，自然揮干，利用透射電鏡觀察其微觀形態(tài)。

2 結果與分析

2.1 地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)的處方與制備方法

2.1.1 油相篩選 納米乳遞藥系統(tǒng)的形成與藥物本身的性質密切相關，水溶性好的藥物適宜制備成W/O型，油溶性好的藥物適宜制備成O/W型，地克珠利水溶性較差，通過檢測地克珠利在IPM、大豆油、橄欖油中的溶解度發(fā)現(xiàn)，其溶解度順序為大豆油>橄欖油>IPM。因此，確定大豆油為制備地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)最佳油相。

2.1.2 表面活性劑篩選 確定油相為大豆油后，分別考察了EL-40、RH-40、吐溫-80、吐溫-85共4種表面活性劑對大豆油的溶解能力，結果表明，EL-40對大豆油的溶解能力最強，故選擇EL-40為制備地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)的表面活性劑。

2.1.3 助表面活性劑篩選 通過繪制偽三元相圖篩選乙醇、異丙醇、正丁醇、PEG400，其中形成納米乳區(qū)域面積最大的即可作為助表面活性。繪制的偽三元相圖如圖1所示，各相圖形成納米乳區(qū)域面積大小的順序為正丁醇<乙醇

2.1.4 Smix的篩選 設置Smix分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶0、1∶2、1∶3時繪制的偽三元相圖見圖2，當Smix為1∶1時形成納米乳區(qū)域最大，故選擇Smix為1∶1。

2.1.5 Smix-油相體積比篩選 通過分析在Smix為1∶1時繪制的偽三元相圖發(fā)現(xiàn)，Smix-油相體積比為6∶4(1∶0.70)、7∶3(1∶0.43)、9∶1時均可形成納米乳遞藥系統(tǒng)，同時以使用低濃度的表面活性劑為原則，故確定Smix-油相最佳體積比為7∶3(1∶0.43)和 6∶4(1∶0.70)。

2.1.6 地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)的處方 如表1所示，最終選擇大豆油、EL-40和PEG400分別作為最佳油相、表面活性劑和助表面活性劑，選擇Smix為1∶1，最佳的Smix-油相體積比為7∶3(1∶0.43)和 6∶4(1∶0.70)，分別以其確定Ⅰ號和Ⅱ號2個處方用于地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)的制備。

2.2 地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)的性質考察

2.2.1 外觀及類型 以2個處方制備的地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)均呈現(xiàn)澄清、透明狀，且具有淡藍色乳光，當平行光線射入時出現(xiàn)丁達爾現(xiàn)象。分別經(jīng)染色法進行鑒別發(fā)現(xiàn)，兩者的藍色擴散速度均快于紅色擴散速度，因此，以2個處方制備的地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)均為O/W型。

圖1 不同助表面活性劑的偽三元相圖Fig.1 Pseudoternary phase diagrams with different cosurfactants

2.2.2 冷-熱循環(huán)穩(wěn)定性 將2個處方制備的樣品進行冷-熱循環(huán)試驗發(fā)現(xiàn)，均保持外觀澄清、透明且流動性好，未出現(xiàn)分層、破乳等現(xiàn)象，冷-熱循環(huán)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 離心穩(wěn)定性 將2個處方制備的樣品進行離心試驗發(fā)現(xiàn)，均無分層、破乳現(xiàn)象，離心穩(wěn)定性良好。

2.2.4 凍-融穩(wěn)定性 將2個處方制備的樣品進行凍-融試驗發(fā)現(xiàn)，以Ⅰ號處方制備的樣品未出現(xiàn)分層、破乳等現(xiàn)象，外觀澄清、透明，流動性好，以Ⅱ號處方制備的樣品出現(xiàn)分層現(xiàn)象。

2.2.5 地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)的粒徑分布及Zeta電位 將通過Ⅰ號處方制備的樣品用蒸餾水分別稀釋10、100、1 000倍后，經(jīng)激光粒度分析儀測定發(fā)現(xiàn)，其平均粒徑分別為15.81、15.85、22.44 nm，多分散系數(shù)(PDI)為0.096、0.051、0.184，粒子分散較好，粒徑分布范圍較窄，基本呈正態(tài)分布，基本不受蒸餾水稀釋作用的影響(圖3)。此外，將通過Ⅰ號處方制備的樣品用蒸餾水稀釋10、100、1 000倍后，測得其Zeta電位分別為-3.180、-1.620、-0.786 mV(圖4)。

圖2 不同Smix的偽三元相圖

Prescription/mgDiclazurilN,N-/mLN,N-dimethylformamide/mLSoybean oil/mL EL-40400/mLPEG400/mLWaterⅠ200.13.03.53.56.0Ⅱ200.14.03.03.06.0

A：稀釋10倍； B：稀釋100倍； C：稀釋1 000倍

A：稀釋10倍； B：稀釋100倍； C：稀釋1 000倍

2.2.6 地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)的微觀形態(tài) 以Ⅰ號處方制備的樣品經(jīng)蒸餾水稀釋10倍后用電鏡拍照，如圖5所示，樣品粒子外觀呈球形，大小均勻，無黏連。

圖5 地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)的微觀形態(tài)

3 結論與討論

地克珠利是水難溶性藥物，主要用于防治動物球蟲病[11]，臨床治療使用劑量小，在市場上多以預混劑形式存在。與飼料混合給藥的過程中，存在給藥均勻性差、劑量難以控制的問題。本研究利用納米乳化技術將地克珠利制備成O/W型納米乳遞藥系統(tǒng)，通過與飲水混合后進行口服給藥，能夠有效解決給藥均勻性差、劑量難以控制的問題。本研究中，利用蒸餾水分別將制備的地克珠利納米乳樣品稀釋10、100、1 000倍后發(fā)現(xiàn)，地克珠利納米乳樣品外觀澄清、透明，平均粒徑無明顯變化，但隨稀釋倍數(shù)的增大，其Zeta電位值逐漸升高，說明制備的地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)在與水以任意比例混合的過程中穩(wěn)定性良好。

納米乳遞藥系統(tǒng)輔料篩選主要包括油相、表面活性劑和助表面活性劑的種類及用量的篩選。對于水難溶性的藥物一般適宜將藥物溶解于油相中制備成O/W型納米乳遞藥系統(tǒng)，油相的篩選是關鍵步驟，能夠影響納米乳遞藥系統(tǒng)的載藥量及穩(wěn)定性，且藥物在油相中溶解性越好則穩(wěn)定性越高，如果藥物的溶解依賴于表面活性劑或助表面活性劑，則不利于穩(wěn)定，在稀釋過程中易出現(xiàn)由于表面活性劑和助表面活性劑溶解能力降低而導致的藥物析出[12-14]。在納米乳遞藥系統(tǒng)制備中離不開表面活性劑的使用，但高濃度的表面活性劑會引起一系列毒副作用[13,15]，故應該以盡量使用低濃度的表面活性劑為原則。歐陽艷等[16]利用在60 ℃條件下地克珠利溶于吐溫-80的性質，以吐溫-80和司盤-80為表面活性劑制備了地克珠利納米乳，理論上存在穩(wěn)定性風險，且使用表面活性劑濃度較高，為油相用量的3倍。本研究通過考察地克珠利在不同油相中的溶解度，確定了大豆油作為制備地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)的油相，通過考察4種表面活性劑對大豆油的溶解能力，確定了溶解能力最強的EL-40為表面活性劑，再利用偽三元相圖篩選Smix，并通過穩(wěn)定性考察確定了最佳處方，其中Smix-油相體積比為7∶3(1∶0.43)時穩(wěn)定性好，通過這種方法確定表面活性劑用量最大程度保證了使用較低濃度表面活性劑，以降低毒副作用。

偽三元相圖的繪制需要獲取大量的試驗數(shù)據(jù)，尤其是在需要準確繪制相圖邊界的情況下，雖然納米乳遞藥系統(tǒng)的形成僅需要較低自由能，且其屬于熱力學穩(wěn)定體系，但試驗過程中需要謹慎判斷呈現(xiàn)出外觀澄清、透明的納米乳體系是否處于亞穩(wěn)定狀態(tài)。通過分析偽三元相圖可以了解油相、表面活性劑、助表面活性劑和水相混合物相的行為，以確定最佳處方組成。理想的納米乳遞藥系統(tǒng)應同時具有熱力學穩(wěn)定性和動力學穩(wěn)定性[17]。本研究構建的地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)分別通過冷-熱循環(huán)穩(wěn)定性、高速離心穩(wěn)定性和凍-融穩(wěn)定性試驗考察表明，其熱力學和動力學穩(wěn)定性良好。

綜上，本研究所構建的地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)穩(wěn)定性良好，在養(yǎng)禽業(yè)、養(yǎng)兔業(yè)球蟲病預防和治療中具有潛在應用價值，有利于地克珠利獲得更廣的臨床應用，值得作為獸用新型納米制劑進行深入研究。