矮化核桃枝枯病病原菌的形態(tài)與分子鑒定

程相瑞 李丙雪 盧靖天

摘要 為了明確河南省洛陽(yáng)地區(qū)核桃枝條一種新病害的病原種類，對(duì)采自田間的典型癥狀枝條進(jìn)行了常規(guī)組織分離，對(duì)單孢菌株進(jìn)行了形態(tài)鑒定、rDNA ITS序列分析及致病性測(cè)定。結(jié)果表明，病原菌在PDA培養(yǎng)基上菌落初為白色，隨著色素的積累，由中心向邊緣變?yōu)榛揖G色，再變成墨綠色，最終全部變成黑色;氣生菌絲棉絮毛狀，菌落邊緣不整齊，近圓形或不規(guī)則形。分生孢子器散生或聚生，呈黑色小粒狀，分生孢子器球形或近球形，深褐色，具孔口;分生孢子梗短缺，無(wú)色，桿狀，末端產(chǎn)生分生孢子;分生孢子梭形、紡錘形，無(wú)色，無(wú)隔，基部鈍圓，頂部稍尖，單孢（24.5～29.0）μm×（4.8～7.5）μm。離體枝條接種結(jié)果表明，該菌能侵染核桃枝條引起與田間相同的癥狀。據(jù)此將分離物鑒定為葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea。

關(guān)鍵詞 核桃; 枝枯病; 葡萄座腔菌; 形態(tài)鑒定; 分子鑒定

中圖分類號(hào)： S 436.64

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018252

Abstract In order to clarify the pathogen of a new disease of walnut branch in Luoyang， Henan province， routine tissue separation of typical symptomatic branches from the field was carried out， and the morphological identification， rDNAITS sequence analysis and pathogenicity determination were performed for single spore strains. The results showed that the colony of the pathogen was initially white in the PDA medium， and with the accumulation of pigment， it was graygreen from the center to the edge; then it turned atrovirens， and eventually it turned black; the aerial hyphae were floccular and hairy， with irregular colony edge and nearly round or irregular shape. Pycnidia were scattered or aggregated， with small black granules， spherical or nearly spherical， dark brown， with orifice; conidiophores were short， colorless， rodshaped， and at the termina were conidia; conidium was fusiform， colorless， without septum， with obtuserounded base， slightly pointed apex， and single spores （24.5-29.0）μm×（4.8-7.5）μm. The results of inoculation in excised branches showed that the pathogen could infect the walnut branches and cause the same symptoms as those in the field. Accordingly， the isolate was identified as Botryosphaeria dothidea.

Key words walnut; branch blight; Botryosphaeria dothidea; morphological identification; molecular identification

核桃仁因含有多種人體必需的微量元素、礦物質(zhì)及一些維生素，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是世界著名的“四大干果”之一[1]，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。近年來(lái)，種植核桃市場(chǎng)前景廣闊，經(jīng)濟(jì)效益顯著，栽培面積迅速擴(kuò)大;但由于苗木引進(jìn)把關(guān)不嚴(yán)、栽培管理方式粗放等原因，病蟲(chóng)危害日益加重[2]。已報(bào)道核桃真菌性病害有核桃白粉病[3]、核桃潰瘍病[4]、核桃枝枯病、核桃腐爛病[5]、核桃葉斑病[6]等，有多種病原真菌可以侵染核桃引起枝枯病，包括胡桃楸擬莖點(diǎn)霉Phomopsis juglandina，葡萄座腔菌屬的Botryosphaeria dothidea、B. fabicercianum、B.obtusa，半知菌亞門黑盤孢M(jìn)elanconium juglandinum[7]以及新殼梭孢Neofusicoccumparvum[8]，越橘間座殼Diaporthe vaccinii[9]等。

傳統(tǒng)的真菌形態(tài)學(xué)鑒定為其分類提供了基本的依據(jù)，但是有一些真菌例如Botryosphaeria類真菌，僅依靠形態(tài)學(xué)特征并不能準(zhǔn)確做出關(guān)于其發(fā)育的系統(tǒng)分類，而rDNA的ITS序列分析則可以彌補(bǔ)單獨(dú)依靠形態(tài)學(xué)特征所不能完成的真菌種、屬的鑒定[10]。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在河南省洛陽(yáng)市農(nóng)豐科技有限公司核桃園所種植的矮化核桃品種，病害發(fā)生嚴(yán)重，影響了該公司核桃的產(chǎn)量、質(zhì)量。為了查明病因，減少核桃種植的損失，課題組采集具典型癥狀的核桃枝枯病病樣，對(duì)病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、純化與鑒定，以進(jìn)一步確定病原菌的種類，為枝枯病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離、純化與培養(yǎng)

2017年3月至2018年3月，從河南省洛陽(yáng)市農(nóng)豐科技有限公司核桃園采集具有典型病害癥狀的枝條，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行流水清洗，依次編號(hào)并拍照。帶有病原菌子實(shí)體病癥的枝條，直接挑取子實(shí)體于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng);無(wú)病原菌子實(shí)體病癥的枝條進(jìn)行常規(guī)的病菌組織分離[11]。將分離純化獲得的菌株轉(zhuǎn)至PDA斜面試管保存。

1.2 致病性測(cè)定

挑選健康、幼嫩的矮化核桃枝條，無(wú)菌水沖洗，70%乙醇表面消毒;用滅菌針在枝條上針刺形成輕微傷口;用滅菌的打孔器將在PDA培養(yǎng)基上活化3 d的供試菌株菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，將菌餅有菌絲的一面粘貼于枝條的傷口處;將接種后的枝條置于保濕器內(nèi)，25℃條件下光照培養(yǎng)，觀察記錄發(fā)病情況。以無(wú)菌的PDA菌餅為對(duì)照，重復(fù)3次[12]，每一重復(fù)5個(gè)枝條。

1.3 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

將分離純化的菌株接種于PDA培養(yǎng)基，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后測(cè)量菌落的直徑，觀察菌落顏色、表面的紋飾、形態(tài)與質(zhì)地，描述其培養(yǎng)特征。

從田間采回的發(fā)病枝條，選取具子實(shí)體的典型樣本，制臨時(shí)水玻片，在光學(xué)顯微鏡（帶測(cè)微尺）下觀察其形態(tài)特征，并測(cè)量分生孢子、分生孢子器、子囊座、子囊及子囊孢子的大小;選取具子實(shí)體的發(fā)病枝條，進(jìn)行石蠟切片[12]，在顯微鏡下進(jìn)一步觀察病原菌的形態(tài)特征。

1.4 rDNAITS序列分析

在PDA上培養(yǎng)5～7 d后的菌落，用改良的CTAB法[13]提取菌株DNA;利用通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）將提取出來(lái)的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)25 μL PCR反應(yīng)體系：10×Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL、10 μmol/L ITS1 1 μL、10 μmol/L ITS4 1 μL、5 U/μL rTaq酶 0.25 μL、模板DNA 1.0 μL，用ddH2O將反應(yīng)體系補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸105 s，共30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，4℃保存，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)GelRed染色，在紫外燈下檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的有效性。檢測(cè)到合適條帶后，將其所對(duì)應(yīng)的原始擴(kuò)增產(chǎn)物（未純化）送交上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

獲得序列用CLUSTAL軟件比對(duì)拼接后，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中用 BLAST進(jìn)行ITS序列比對(duì)，將目標(biāo)序列及其同源性高的序列編輯后，通過(guò)MEGA 軟件用鄰接法（neighbourjoining）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離物的致病性

在核桃園，枝枯病一般發(fā)生在樹(shù)干的側(cè)枝或新生枝的末端，發(fā)生病變的枝干表層呈現(xiàn)暗灰褐色、或者淺紅褐色、或深灰色，呈干枯狀（圖1a）。發(fā)生病害部位與其他地方相比稍微凹陷，并與健康部位交界處形成“V”形或橢圓形病斑，顏色深褐色（圖1b）;在發(fā)病后期，出現(xiàn)典型的病征：病枝皮層下會(huì)形成許多近圓形瘤狀突起的小黑點(diǎn)，直徑大約0.4 mm，埋生或半埋生，群生且較密，為病原菌的分生孢子器或子囊座（圖1c、d）。有的核桃樹(shù)主枝上也有，說(shuō)明發(fā)病后病菌會(huì)從側(cè)枝逐漸蔓延到主枝;患病枝條的葉片黃化、枯萎、卷曲，甚至脫落。

人工接種第2～3天后，在幼嫩枝條上接有菌餅的地方出現(xiàn)橢圓形或“V”形病斑，病斑處顏色為褐色，中部顏色較淺，水漬狀，且略微有凹陷，大小約為1.6 cm×0.7 cm（圖2a、b）。接種第5天，對(duì)照組不發(fā)?。▓D2c），而接種核桃枝條在原接種處有白色棉絮狀菌絲產(chǎn)生，并且褐色病斑已擴(kuò)展至整根枝條的2/3左右，侵染嚴(yán)重的地方顏色變?yōu)樯罨疑鹾谏▓D2d）。接種15 d，整根枝條變?yōu)楹谏?，且在枝條上出現(xiàn)黑色小點(diǎn)（圖2e）。從接種發(fā)病的核桃枝條上挑取菌絲、小黑點(diǎn)，以及從病健交界處獲取發(fā)病組織，再次進(jìn)行分離、純化，重新獲得了病原菌，且菌落形態(tài)和分生孢子形態(tài)上與接種所用的病原菌完全一致，證實(shí)該菌對(duì)矮化核桃枝條具有致病性，并產(chǎn)生枝枯癥狀。

2.2 形態(tài)學(xué)特征

在田間發(fā)病的枝條上，分生孢子器和子囊座自皮層下頂出，呈黑色瘤狀突起，群生。分生孢子器黑色，球形或近球形。光學(xué)顯微鏡下觀察，分生孢子器球形或近球形，顏色深褐色或黑色，具孔口（104.3～115.2）μm×（118.5～123.2）μm（平均110.0 μm×120.0 μm）（圖3a）;分生孢子梭形、紡錘形，無(wú)色，單孢（25.0～31.2）μm×（5.8～8.0）μm（平均27.1 μm×7.3 μm）（圖3b）。子囊座黑色，具孔口（220.0～228.0）μm×（260.0～276.0）μm（平均224.0 μm×275.0 μm）（圖3c）;子囊長(zhǎng)棍棒形，具短柄，雙層壁，成熟時(shí)易消解（19.8～22.3）μm×（147.5～158.2）μm（平均20.7 μm×150.0 μm），內(nèi)含8個(gè)子囊孢子（圖3d）;子囊孢子雙列，橢圓形，單孢，無(wú)色，內(nèi)有油滴狀物（17.8～26.3）μm×（8.4～12.5）μm（平均24.6 μm×11.2 μm）（圖3d）。

在PDA培養(yǎng)基上，菌絲3～4 d即可布滿全皿（90 mm），菌落初為白色（圖4a1、a2），漸變?yōu)榛疑?、黑色，氣生菌絲棉絮毛狀，在培養(yǎng)皿中部往往形成菌絲束直達(dá)皿蓋（圖4c1、c2）;菌落邊緣不整齊，近圓形或不規(guī)則形，培養(yǎng)3～4 d后出現(xiàn)色素，隨著色素的積累，由中心向邊緣初為灰綠色，再變成墨綠色，最終全部變成黑色。菌落日生長(zhǎng)速率約為17.1 mm/d。6～7 d左右，部分菌絲糾結(jié)在皿底形成分生孢子器，散生或聚生，呈黑色小粒狀，內(nèi)有大量分生孢子（圖4b1、b2）。光學(xué)顯微鏡下觀察，菌絲透明無(wú)色或褐色，有隔，直徑約為4.8 μm。分生孢子器球形或近球形，深褐色，具孔口（圖3e）;分生孢子梗短缺，無(wú)色，桿狀，末端產(chǎn)生分生孢子（圖3f）;分生孢子梭形、紡錘形，無(wú)色，無(wú)隔，基部鈍圓，頂部稍尖，單孢（24.5～29.0）μm×（4.8～7.5）μm（平均26.2 μm×5.4 μm）（圖3f）。在PDA上培養(yǎng)的菌株未發(fā)現(xiàn)子囊座、子囊以及子囊孢子。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察，初步鑒定分離菌株為葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea。

2.3 rDNAITS序列分析

對(duì)分離物的PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序后，其有效序列長(zhǎng)度577 bp。將分離物測(cè)序獲得的序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得其ITS序列登錄號(hào)為：MH329650。在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果表明，該序列與KU686880.1等的B.dothidea（葡萄座腔菌）序列同源性大于99%。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，將分離的核桃枝枯病病原菌鑒定為葡萄座腔菌B.dothidea，其分類地位為真菌界，子囊菌門，腔菌綱，格孢腔菌目，葡萄座腔菌科，葡萄座腔菌屬（圖5）。

3 結(jié)論與討論

依據(jù)分離物的形態(tài)學(xué)觀察、ITS序列分析及致病性測(cè)定，將引起洛陽(yáng)地區(qū)矮化核桃枝枯病的病原菌鑒定為葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea，其分類地位為真菌界，子囊菌門，腔菌綱，格孢腔菌目，葡萄座腔菌科，葡萄座腔菌屬。該病原菌與趙丹等[12]報(bào)道的引起洛陽(yáng)牡丹潰瘍病的葡萄座腔菌以及徐成楠等[14]報(bào)道的引起遼寧地區(qū)越橘枝枯病的葡萄座腔菌相一致。

葡萄座腔菌存在有性型和無(wú)性型階段，關(guān)于無(wú)性型的報(bào)道比較多，包括Dothiorella、Diplodia、Lasiodiplodia、Fusicoccum和Sphaeropsis等屬[15]。其主要分類特征為子座、子囊、子囊孢子以及分生孢子的形狀、紋飾、顏色、分隔、長(zhǎng)寬比、大小及壁厚度等[16]。但是，由于在自然界和實(shí)驗(yàn)室人工條件下培養(yǎng)的葡萄座腔菌Botryosphaeriaceae通常以無(wú)性型較常見(jiàn)，有性型少見(jiàn)，長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)于該屬真菌的分類學(xué)鑒定主要基于無(wú)性型的形態(tài)特征。另外，培養(yǎng)菌落顏色、氣生菌絲生長(zhǎng)情況及子囊孢子表面超微結(jié)構(gòu)（紋飾）也可用于葡萄座腔菌科真菌的分類和鑒定。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，rDNAITS序列分析作為一種快速準(zhǔn)確的手段被廣泛用于植物病原真菌的分類鑒定[17]。核糖體DNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNAITS）序列是真核生物rDNA的內(nèi)含子序列，因其在進(jìn)化上具有顯著的種屬特異性，已被廣泛應(yīng)用于很多真菌目、科、屬、種等的分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析。位于5.8S和18S之間的ITS1，在種及種以下水平的研究中非常有價(jià)值。位于5.8S和28S之間的ITS2，有關(guān)研究證明其在更高級(jí)生物分類學(xué)水平上包含有價(jià)值的生物學(xué)信息。因此ITS序列可用于了解基因組同源性、物種系統(tǒng)發(fā)育史、基因滲透和其他進(jìn)化問(wèn)題[18]。

葡萄座腔菌是一類世界性分布的真菌，在國(guó)外引起藍(lán)莓枝枯病[19]、蘋果輪紋病[20]、葡萄潰瘍病[21]等病害。在國(guó)內(nèi)主要分布于華北、東北、江淮等地區(qū)，侵染多種木本植物引起潰瘍病或干腐病，是重要的生物災(zāi)害之一[22]。該菌在河南洛陽(yáng)侵染核桃引起大片干枯死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，建議生產(chǎn)中應(yīng)冬季清除病原，早春提前預(yù)防，降低病害的危害程度。

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（責(zé)任編輯：田 喆）