金黃色葡萄球菌生物傳感檢測方法研究

摘 要：本文的目的是建立一種運用電化學(xué)免疫傳感器快速檢測金黃色葡萄球菌的方法。該傳感器采用微間隙陣列電極作為基礎(chǔ)電極，運用雙抗夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)和酶催化銀沉積反應(yīng)實現(xiàn)分析信號放大。該方法特異性良好，對非目標(biāo)菌株無交叉反應(yīng)，檢出限為104CFU/mL，線性范圍為104～108CFU/mL，傳感器的電導(dǎo)率與金黃色葡萄球菌濃度之間的線性關(guān)系較好，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.947。本研究證明，電化學(xué)免疫傳感器快速檢測金黃色葡萄球菌法具有檢測速度快、操作簡便、檢測成本低等優(yōu)點，為金黃色葡萄球菌的快速檢測工作提供了一種有效手段。

關(guān)鍵詞：微間隙陣列電極傳感器 金黃色葡萄球菌 酶催化銀沉淀

金黃色葡萄球菌是革蘭式陽性球菌中最為常見的一種，其廣泛存在于自然界，可引起食物中毒、腦膜炎、骨髓炎、心內(nèi)膜炎等疾病[1]。金黃色葡萄球菌是細(xì)菌性食物中毒事件的主要誘發(fā)因子[2]，因此準(zhǔn)確快速地檢測金黃色葡萄球菌對食品安全檢測工作來說非常重要。目前，針對金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法主要是微生物培養(yǎng)法，但需要增菌、分離、生化鑒定等步驟，檢測時間通常在4天以上[3]。該方法基于致病菌的生長代謝，操作復(fù)雜且檢測周期較長，無法滿足現(xiàn)場快速、準(zhǔn)確檢測的要求。本研究擬運用金黃色葡萄球菌特異性單、多克隆抗體，在微間隙陣列電極上包被多克隆抗體用于捕獲目標(biāo)物，當(dāng)目標(biāo)物存在時，單克隆抗體特異性識別目標(biāo)物就會形成三明治結(jié)構(gòu)的免疫復(fù)合物，體系中的堿性磷酸酶可將銀離子還原，而形成的銀單質(zhì)沉淀在電極表面及其間隙中。與此同時，電極間的電導(dǎo)率與銀單質(zhì)的沉淀量呈線性關(guān)系，可實現(xiàn)目標(biāo)物的定量分析[4]。本方法具有精準(zhǔn)快速、操作簡便的優(yōu)點，可用于金黃色葡萄球菌及其它食源性致病菌的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、沙門氏菌[CMCC（B）50115]、大腸桿菌O157：H7（ATCC 43889）、副溶血性弧菌（ATCC 17802）、阪崎腸桿菌（CICC 21561）、蠟樣芽胞桿菌[CMCC（B）63303]、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（ATCC 19115）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853），以上菌株均購買自相應(yīng)的菌種保藏中心。

抗金黃色葡萄球菌多克隆抗體、單克隆抗體，購自上海慧耘生物科技有限公司；堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、抗壞血酸磷酸酯（ascorbic acid 2-phosphatase，AAP），購自sigma公司；AgNO3、甘氨酸，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器：CHI760D電化學(xué)工作站，上海辰華儀器公司；LRH-250F數(shù)顯恒溫器，上海一恒科技有限公司；微間隙陣列電極傳感器件，實驗室設(shè)計[4]。

1.2 菌液準(zhǔn)備

菌種活化后，菌液用麥?zhǔn)媳葷峁軠y定其濃度，滅活后用生理鹽水稀釋制備成不同濃度的菌懸液。

1.3 試驗方法

微間隙陣列電極用無水乙醇和超純水清洗后晾干；工作芯片用5μg/mL金黃色葡萄球菌多克隆抗體包被；加入1%脫脂奶粉溶液200μL，在37℃恒溫孵育1h，封閉芯片表面未結(jié)合抗體的位點；加入滅活菌液100μL，37℃孵育1h；加入5μg/mL金黃色葡萄球菌單克隆抗體100μL，37℃孵育30min；加入AP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 100μL，37℃孵育30min；加入含1mmol/L AAP和5mmol/L AgNO3的底物溶液100μL，37℃避光孵育10min，用超純水清洗3次，晾干后待測。

將微間隙陣列電極傳感器的電極與電化學(xué)工作站的工作電極連接，采用線性掃描伏安法在0～50mV點位范圍檢測。

1.4 特異性分析

以金黃色葡萄球菌為陽性對照，以沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7等標(biāo)準(zhǔn)菌株作為特異性檢測菌株，以PSBT做空白對照，從而驗證方法的特異性。

1.5 靈敏度分析

將金黃色葡萄球菌滅活菌液稀釋為1.0×10⁴、1.0×10⁵、1.0×10⁶、1.0×10⁷、1.0×10⁸CFU/mL等5個濃度梯度，以PBST作為陰性對照，通過檢測電導(dǎo)信號確定方法的檢測靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法特異性

使用微間隙陣列電極傳感器檢測了8種致病菌，以測試該方法的特異性，不同菌種檢測的電導(dǎo)值變化見圖1。由圖1可見，只有加入金黃色葡萄球菌懸液的傳感器電導(dǎo)率變化明顯，空白對照和非目標(biāo)菌株的電導(dǎo)率變化不明顯，說明該方法對金黃色葡萄球菌的特異性較高，且與其他菌株無交叉反應(yīng)。

2.2 檢測方法靈敏度

金黃色葡萄球菌濃度在10⁴～10⁸CFU/mL范圍內(nèi)變化時，其LSV響應(yīng)曲線見圖2。由圖2可知，菌液濃度越高，其電導(dǎo)值越大，該方法的檢測限為10⁴CFU/mL。同時，金黃色葡萄球菌濃度越高，檢測到的電導(dǎo)率越大，二者之間呈線性關(guān)系（如圖3），其線性方程為：電導(dǎo)率（pS）=1169LogC（CFU·mL-1）-1141，R2=0.947。

3 結(jié)論

本文采用微間隙陣列電極作為基礎(chǔ)電極，結(jié)合雙抗夾心免疫反應(yīng)構(gòu)建了電化學(xué)免疫傳感器，通過電化學(xué)分析，實現(xiàn)了對金黃色葡萄球菌的檢測。實驗結(jié)果顯示，該方法特異性良好，檢測靈敏度可達104CFU/mL，檢測電導(dǎo)率和菌濃度呈正相關(guān)，線性相關(guān)系數(shù)為0.947。本方法利用堿性磷酸酶的催化作用，使銀離子還原成銀單質(zhì)沉淀在電極之間，相鄰的電極被導(dǎo)通從而在有外加電壓時產(chǎn)生電流信號，電化學(xué)信號放大系統(tǒng)具有靈敏度高、高效、背景干擾低等優(yōu)點。免疫反應(yīng)采用雙抗夾心法，包被抗體為多克隆抗體，能有效捕獲目標(biāo)菌株，識別抗體為單克隆抗體，有效提高了該方法的特異性。該方法將電化學(xué)生物傳感技術(shù)與免疫學(xué)方法有效結(jié)合，可以將封閉好的芯片真空干燥后密閉保存，現(xiàn)場試驗只需加增菌液的后續(xù)步驟，從而縮短了檢測時間，可以滿足現(xiàn)場檢測的需要。

參考文獻：

[1] Ding Tian， Shim Young-Hwan， Choi Na-Jung， et al. Mathematical modeling on the growth of Staphylococcus aureus in sandwich. Food Sci Biotechnol， 2010，19（3）：763-768.

[2] Argudín M–， Mendoza MC， Rodicio MR. Food poisoning and Staphylococcus aureus enterotoxins. Toxins 2010，2： 1751–1773.

[3] Murakami T. Filter-based pathogen enrichment technology for detection of multiple viable foodborne pathogens in 1 day. J Food Prot， 2012，75：1603–1610.

[4] 楊麗霞，邱華麗，周金沙等.基于微間隙陣列電極傳感器檢測副溶血性弧菌的方法初探.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報.2017，8（8）：3151-3155.

基金項目：國家公益性行業(yè)科研專項項目（編號：201310130）；長沙市科技計劃項目（kq1801151）。