大葉白麻總黃酮中白麻苷的藥代動力學(xué)研究

張娟 馮春艷 卿德剛

【摘 要】 目的：建立大鼠血漿中白麻苷的HPLC含量測定方法，借助該法考察白麻苷在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征。方法：XTARRA RP18色譜柱，乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫，35℃，1mL/min，360nm檢測。6只雄性SD大鼠灌胃給予1.05g/Kg的大葉白麻總黃酮，測定不同給藥時間點，動物血漿中白麻苷的濃度，并對其藥代動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行研究。結(jié)果：白麻苷在0.0606～19.4040mg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R=0.9996），低、中、高3個濃度樣品的相對回收率分別為102.29%、92.95%、90.11%，日內(nèi)RSD分別為1.53%、1.07%、3.62%，日間RSD分別為8.33%、3.56%、4.03%。大鼠灌胃大葉白麻總黃酮后，白麻苷在大鼠體內(nèi)的代謝過程符合開放的二室模型，消除半衰期為474.13min。結(jié)論：白麻苷在大鼠體內(nèi)能迅速分布，并且持續(xù)時間較長。

【關(guān)鍵詞】 大葉白麻;白麻苷;HPLC;藥代動力學(xué)

【中圖分類號】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）3-0024-05

Abstract：Objective To establish the content determination method of Quercetin-3-O-sophoroside in plasma， and study the pharmacokinetics feature of Quercetin-3-O-sophoroside in rats. Mehtods XTARRA RP18 column was gradient eluted by acetonitrile-0.2% phosphate solution at 35℃， 1mL/min，360nm. 6 rats were administrated with the purified total flavonoids from Poacynum hendersoniiat a dose of 1.05g/kg， the concentrations of Quercetin-3-O-sophoroside in rat plasma were determined at different administrated time， and calculated the pharmacokinetic parameters. Results Excellent linear relationship was obtained in the range of 0.0606～19.4040mg/L（R=0.9996）， the relative recoveries of low， medium and high concentration samples were 102.29%，92.95% and 90.11%， the intra-day RSD were 1.53%，1.07% and 3.62% ， the inter-day RSD were 8.33%，3.56% and 4.03%.Quercetin-3-O-sophoroside in rats was consistent with the open two-compartment model，the elimination half-life time was 474.13min. Conclusion Quercetin-3- O-sophoroside distributed quickly and existed for a long time in rats.

Keywords：Poacynum henderconii;Quercetin-3-O-sophoroside;HPLC; Pharmacokinetics

白麻屬大葉白麻（Poacynum hendersonii Woodson）喜生于鹽堿荒地、沙漠及戈壁荒灘等干旱地區(qū)，主要分布在新疆、青海、內(nèi)蒙、甘肅等地區(qū)，其中新疆羅布泊、塔里木河、孔雀河畔及阿克蘇地區(qū)有豐富的大葉白麻野生資源 [1-2]?！毒S吾爾藥志》記載大葉白麻清熱涼血、利尿消腫、行氣涼肝、鎮(zhèn)靜安神，用于頭暈、心悸、神經(jīng)衰弱、高血壓及肝硬化引起的腹水 [3]。有學(xué)者認(rèn)為，大葉白麻和羅布麻藥理活性相似，金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷等黃酮類成分是二者的主要活性成分。然而，近年研究表明，二者在化學(xué)組成上有較大差異 [4-9]，比如羅布麻中金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷的含量均高于大葉白麻，并且二者特征成分不同，大葉白麻含白麻苷、蘆丁、biapigenin和加貫葉金絲桃素，羅布麻則含querciturone、乙酰金絲桃苷、穗花衫雙黃酮等成分 [8-10]。大葉白麻總黃酮由大葉白麻經(jīng)乙醇提取、大孔樹脂柱純化制得，其抗炎活性優(yōu)于羅布麻總黃酮 [11]，白麻苷作為其主要成分含量達(dá)11.98%，另有研究報道白麻苷具有抗氧化、腦缺血保護(hù)等作用 [12-13]。因此，本實驗以白麻苷為考察指標(biāo)，研究大葉白麻總黃酮在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征，以期為大葉白麻的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 U3000高效液相色譜儀（Thermo），MIKRO 220R冷凍離心機(jī)（Hettich），XH-C渦旋混合器（江蘇金怡儀器科技有限公司），DT2012電子天平（余姚市金諾天平儀器有限公司），AB265-S分析天平（梅特勒-托利多公司），JY92-2D超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料 白麻苷（批號：P09J6R1，上海源葉生物科技有限公司），大葉白麻（新疆），甲醇、乙腈為色譜純（Sigma），超純水（自制）。

1.3 動物 SPF級SD大鼠10只，雄性，體重為（200±20）g，新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）2016-0001。

2 方法

2.1 大葉白麻總黃酮制備 大葉白麻用20倍60%乙醇回流提取2次，每次1.5h，合并2次提取液，濃縮至無醇，過大孔樹脂柱，水洗除雜后，以3BV 60%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮、干燥，HPLC檢測黃酮含量 [14]。

2.2 大鼠血漿中白麻苷的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：XTARRA RP18（250mm×4.6mm，5μm）;乙腈：0.2%磷酸水溶液梯度洗脫（0～10min，15%∶85%;10～50min，18%∶82%;50～65min，18%∶82%）;柱溫：35℃;流速：1mL/min;檢測波長：360nm;進(jìn)樣量：100uL。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取白麻苷對照品適量，于10mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，制成濃度為97.0200mg/L的儲備液。分別精密吸取儲備液適量，用50%甲醇稀釋，制成濃度為97.0200、48.5100、24.2550、19.4040、9.7020、4.8510、2.4255、1.2128、0.6064、0.3032mg/L的系列對照品溶液，4℃保存，備用。

2.2.3 血漿樣品預(yù)處理 精密吸取大鼠血漿100μl，加入200μL甲醇沉淀蛋白，渦旋2min，13000r/min離心10min，取上清過0.22μm的微孔濾膜，即得。

2.2.4 專屬性 將空白血漿、白麻苷添加血漿、灌胃大葉白麻純化物后血漿，按“2.2.3”項下方法處理，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，考察方法專屬性。

2.2.5 線性關(guān)系考察? 精密吸取100μL大鼠空白血漿10份，于1.5mL的離心管中，分別加入25μL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成白麻苷濃度為19.4040、9.7020、4.8510、3.8808、1.9404、0.9702、0.4851、0.2426、0.1213、0.0606mg/L的血漿樣品，按“2.2.3”項下方法處理，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，血藥濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.6 精密度實驗制備 白麻苷濃度分別為0.4851、3.8808、19.4040mg/L的血漿樣品（n=5），按“2.2.3”項下方法處理，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)3d，分別計算日內(nèi)RSD和日間RSD。

2.2.7 準(zhǔn)確度實驗制備 白麻苷濃度分別為0.4851、3.8808、19.4040mg/L的血漿樣品（n=5），按“2.2.3”項下方法處理，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度和相對回收率。

相對回收率=測定量/實際添加量

2.2.8 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率實驗 制備白麻苷濃度分別為0.4851、3.8808、19.404mg/L的血漿樣品（n=5），按“2.2.3”項下方法處理，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣，峰面積為SET3。取空白血漿，按“2.2.3”項下方法處理，取上清液后加入對照品溶液，使其濃度與SET3一致（n=5），按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，峰面積作為SET2。將對照品溶液用50%甲醇溶液稀釋，使其濃度與SET3一致，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)5次，峰面積作為SET1。

基質(zhì)效應(yīng)=SET2/SET1提取回收率=SET3/SET2

2.2.9 穩(wěn)定性實驗 制備白麻苷濃度分別為0.4851、3.8808、19.4040mg/L的血漿樣品（n=3），室溫下放置24h后測定，考察短時穩(wěn)定性。于-20℃冰凍30d后取出后測定，考察長期穩(wěn)定性。

2.3 藥代動力學(xué)實驗 雄性SD大鼠10只，灌胃給藥前禁食不禁水。4只大鼠作為空白，6只大鼠灌胃大葉白麻總黃酮（1.05g/kg，按白麻苷折算給藥劑量為125.79mg/kg），灌胃體積10mL/kg，于給藥前后0、5、10、20、30、45min、1、2、3、4、6、8、12h眼眶后靜脈叢取血0.5mL，置于1.5mL已肝素化的離心管中，13000r/min離心10min，分離得到血漿，-20℃保存。

2.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)均用Excel處理，表示為（x±s），藥動學(xué)參數(shù)采用 PK solution 2.0TM（Summit Research Services，USA）藥代動力學(xué)軟件分析。

3 結(jié)果

3.1 大葉白麻總黃酮含量測定 HPLC檢測，大葉白麻總黃酮中白麻苷、異槲皮苷、紫云英苷、蘆丁和金絲桃苷的含量分別為11.98%、7.44%、0.67%、0.30%和0.14%。如圖1所示。

3.2 大鼠血漿中白麻苷的含量測定

3.2.1 專屬性 白麻苷的保留時間為19.793min，分離度>9，理論塔板數(shù)>10000，拖尾因子均符合測定要求，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾白麻苷的含量測定。如圖2所示。

3.2.2 線性關(guān)系考察 白麻苷在0.0606～19.4040mg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=0.1290869X-0.0310899（R=0.9996）。如圖3所示。

3.2.5 基質(zhì)效應(yīng)和回收率實驗 白麻苷檢測基本不受基質(zhì)干擾，平均提取回收率為97.91%，符合生物樣品檢測要求。見表2、表3。

3.2.6 穩(wěn)定性實驗 ”低、中、高3個濃度的血漿樣品，室溫下放置24h后測定RSD分別為4.10%、4.08%和4.26%，-20℃冰凍30d后測定RSD分別為3.93%、3.56%和3.69%，血漿樣品短時、長期穩(wěn)定性良好。

3.3 藥代動力學(xué)實驗 6只大鼠以1.05g/kg劑量的大葉白麻總黃酮灌胃給藥，3h后檢測不到白麻苷，血藥濃度-時間曲線如圖4所示。 白麻苷在大鼠體內(nèi)的代謝過程符合開放的二室模型：吸收速率常數(shù)Ka=0.47min，表明白麻苷在胃腸道能很快的被吸收;灌胃后血漿中白麻苷在15min即達(dá)峰值CMAX=0.53mg/L，且分布速率常數(shù)Kd=0.03min，表明白麻苷進(jìn)入大鼠體循環(huán)后，分布迅速;消除速率常數(shù)Ke=0.00 1min，消除半衰期t=474.13min，表明白麻苷在體循環(huán)中消除的很慢。見表4。

4 結(jié)論

本實驗建立了大鼠血漿中白麻苷的HPLC含量測定方法，方法專屬性良好、簡便易行，相對回收率、精密度、穩(wěn)定性等均符合生物樣品的分析要求。以1.05g/kg劑量的大葉白麻總黃酮提取物灌胃大鼠，其主要成分——白麻苷在體內(nèi)代謝過程符合開放二室模型，在體內(nèi)能迅速分布發(fā)揮藥效，同時持續(xù)時間較長。大葉白麻總黃酮的主要成分是白麻苷，并含有異槲皮苷、紫云英苷、蘆丁及金絲桃苷。文獻(xiàn)報道，大鼠灌胃羅布麻提取物后，血漿中可檢測到金絲桃苷和異槲皮苷 [15-16]。筆者在實驗中嘗試檢測大鼠血漿中的金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁、紫云英苷，但均未檢測到化合物原型，而是出現(xiàn)了其他色譜峰，但是鑒于檢測手段的局限性，無法確認(rèn)代謝產(chǎn)物，這與文獻(xiàn)報道有一定差異。一方面可能是由于這些黃酮成分代謝很快，在大鼠體內(nèi)快速轉(zhuǎn)化為其他成分，另一方面也可能與樣品處理及方法檢出限有關(guān)。

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