連艾煎的體外抗氧化活性研究

吳子聰 高嘉敏 王一飛 王治平

【摘 要】目的：通過研究連艾煎的體外抗氧化作用，為充分利用連艾煎提供參考依據(jù)。方法：以黃連、艾葉質(zhì)量比2∶1制備水提液;以維生素C為對照，采用分光光度法測定連艾煎清除DPPH和ABTS自由基的能力;以N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）作為對照，采用熒光法測定連艾煎對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞活性氧簇（ROS）產(chǎn)生的影響。結(jié)果：連艾煎清除DPPH和ABTS自由基的IC50值分別為（2391.20±41.85）mg/L和（249.98±17.19）mg/L，且在一定濃度范圍內(nèi)存在量效關(guān)系;而連艾煎對ROS的產(chǎn)生具有促進作用。結(jié)論：連艾煎具有一定胞外抗氧化能力，在胞內(nèi)會促進ROS的生成，為連艾煎的充分利用提供參考。

【關(guān)鍵詞】連艾煎;艾葉;黃連;抗氧化;活性氧簇

【中圖分類號】R284 【文獻標(biāo)志碼】A【文章編號】1007-8517（2019）5-0014-05

連艾煎方出《松峰說疫》卷二，其配方為黃連與艾葉，具有調(diào)中下氣，清腸開噤之功效，主治瘟疫噤口下痢者[1]。黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.、三角葉黃連 Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao或云連 Coptis teeta Wall.的干燥根莖。以上三種分別習(xí)稱“味連”、“雅連”、“云連”。秋季采挖，除去須根和泥沙，干燥，撞去殘留須根。味苦，寒。歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)[2]。艾葉為菊科植物艾Artemisia argyi LevL et Vant.的干燥葉。夏季花未開時采摘，除去雜質(zhì)，曬干。艾葉氣清香，味苦，艾葉味辛、苦，溫;有小毒。歸肝、脾、腎經(jīng)[2]。黃連與艾葉皆為常用中藥，針對黃連或艾葉單方已有大量現(xiàn)代研究[3-9]。近年來，有關(guān)中藥復(fù)方的抗氧化研究備受廣泛關(guān)注，然而連艾煎作為一種傳統(tǒng)中藥復(fù)方，但在維普、CNKI或Pubmed等中內(nèi)外各文獻庫皆沒檢索出對連艾煎有任何現(xiàn)代研究，也沒有對其抗氧化能力或藥理作用的研究，本實驗開展連艾煎的體外抗氧化活性研究，為連艾煎的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）;紫外分光光度計（島津公司）;熒光顯微鏡（尼康公司）;電熱爐（廣州粵城電器廠）;循環(huán)真空泵（河南省予華儀器有限公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（海道夫公司），移液槍（艾本德公司）。

1.2 材料 黃連（產(chǎn)地：四川，批號：180801）、艾葉（產(chǎn)地：汕頭，批號：20180901），均購于大參林廣州心誼路店，經(jīng)廣東藥科大學(xué)王治平副研究員鑒定確定為毛茛科、黃連屬黃連Coptis chinensis Franch.及菊科植物艾Artemisia argyi LevL et Vant.;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（規(guī)格1g，純度96%，批號：W26F7E10072，源葉生物公司）;2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABT，批號E1506006，規(guī)格1g，純度98%，美國Aladdin公司）;維生素C（規(guī)格100g，純度99.7%，批號20130315，%國藥集團化學(xué)試劑有限公司）;過硫酸鉀（規(guī)格500g，純度99.5%，批號P112191，美國Aladdin公司）;NAC（規(guī)格25g，純度99%，批號A105420，美國Aladdin公司）;95%乙醇購自廣州化學(xué)試劑廠;ROS檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

2方法

2.1 連艾煎的制備 連艾煎由黃連6g，熟艾3g組成。按處方取藥材，溫水浸泡30min，加水100mL，煎煮提取3次，每次60min，過濾，合并濾液，濃縮至每1mL藥液含生藥66mg，即得。

2.2 溶液 配制61.8μg/mL DPPH工作液：稱取6.18mg DPPH粉末，用無水乙醇溶解并定容至100mL。ABTS+自由基儲備液：稱取9.67 mg ABTS 和64.26mg過硫酸鉀于10mL 的棕色瓶中，加蒸餾水定容至刻度線，避光靜置過夜。

2.3 連艾煎對DPPH自由基的清除能力 根據(jù)文獻[10-13]方法進行DPPH自由基清除能力測試。DPPH是一種在有機溶劑中相對穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液為紫色，需避光儲存，DPPH具有孤對電子，故有接受一個電子或氫離子的能力，在波長為517nm 下具有最大吸收，可用紫外可見分光光度計進行定量測定。當(dāng)有自由基清除劑存在時，DPPH·的單電子被配對而使其顏色變淺，從而導(dǎo)致517nm下吸光值下降，且下降程度呈線性關(guān)系，據(jù)此可以評價試驗樣品的抗氧化能力。取3.00mL 新配制的61.8μg/mL DPPH工作液置于10mL 具塞比色管中，使用移液槍分別加入90.91、121.21、151.52、181.82、212.12與242.42μL的樣品溶液，蒸餾水補充至4.00mL，混勻后室溫下避光反應(yīng)30min，在517nm處測定其吸光度A2。另外再取3.00mL 95%乙醇置于10mL具塞比色管中，然后分別加入與樣品管加入量相同體積的樣品溶液，蒸餾水補充至4.00mL，混勻后室溫下避光反應(yīng)30min，在517nm 處測定其吸光度A1，重復(fù)實驗3次。清除率計算公式：

DPPH自由基清除率（%）=A0-（A2-A1）A0×100%

其中，A0為空白吸光度，A1為樣品自身對照吸光度，A2為樣品吸光度。

2.4 連艾煎對ABTS自由基的清除能力 根據(jù)文獻方法進行ABTS自由基清除能力測定[14-15]。ABTS在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS·+，在抗氧化物存在時ABTS·+的產(chǎn)生會被抑制，在734nm或405nm測定ABTS的吸光度即可測定并計算出樣品的總抗氧化能力。實驗時，用80%乙醇將ABTS+儲備液稀釋成所需工作液，使其在室溫下于734nm 處測得的吸光度在0.700 ± 0.020。取3.00mL 新配制的濃度為ABTS+工作液置于10mL具塞比色管中，使用移液槍分別加入6.06、12.12、18.18、24.24、30.30及36.36μL的樣品溶液，蒸餾水補充至4.00mL，混勻后室溫下避光反應(yīng)30min，在734nm處測定其吸光度A2。另外再取3.00mL 95%乙醇置于10mL具塞比色管中，然后分別加入與樣品管加入量相同體積的樣品溶液，蒸餾水補充至4.00mL，混勻后室溫下避光反應(yīng)30min，在734nm 處測定其吸光度A1，重復(fù)實驗3次。清除率計算公式：

ABTS自由基清除率（%）=A0-（A2-A1）A0 ×100%

其中，A0為空白吸光度，A1為樣品自身對照吸光度，A2為樣品吸光度。

2.5 連艾煎對細胞內(nèi)的活性氧簇（ROS）水平的影響 ROS水平檢測實驗根據(jù)參考文獻[16]，使用ROS檢測試劑盒進行。DCFH-DA探針法是一種利用熒光探針DCFH-DA進行ROS檢測的方法，DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內(nèi)后，可以被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內(nèi)，細胞內(nèi)的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細胞內(nèi)活性氧的水平。取處于對數(shù)期的RAW264.7細胞（2×107個）接種于6孔板，分為空白組、ROS陽性對照組（Rosup，ROS檢測試劑盒提供，50mg/L）、LPS組（100μg/L）、LPS+ROS抑制劑（NAC，1.0g/L）組、LPS+連艾煎組（1.5g/L）、連艾煎自身對照組（1.5g/L）。除ROS陽性對照組外，分別以相應(yīng)藥物刺激細胞24h，ROS陽性對照組刺激2h。在超凈工作臺中避光下，DCFH-DA探針（ROS檢測試劑盒提供）用無血清培養(yǎng)基稀釋，使DCFH-DA終濃度為4.9mg/L，每孔加入1mL的DCFH-DA探針，在細胞培養(yǎng)箱中避光孵育細胞1h，使用無血清培養(yǎng)基在超凈工作臺中避光清洗3次，以充分去除未結(jié)合的游離的DCFH-DA探針;在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞內(nèi)的熒光強度的變化，激發(fā)波長488nm，檢測波長525nm，并對其進行拍照（200×）記錄（激發(fā)時間10s，曝光時間1s）。同時，使用ImageJ圖像處理軟件對ROS熒光強度進行灰度分析，隨機選取十個視野，獲取平均光密度，根據(jù)光密度對各組ROS進行相對定量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件，計量資料采用（x±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗。P< 0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 連艾煎清除DPPH自由基試驗 如表1所示，在一定的濃度范圍內(nèi)，連艾煎對DPPH自由基具有一定的清除能力，隨著濃度的增加，對DPPH自由基的清除率也逐步增加。連艾煎清除DPPH自由基的IC50為（2391.21±41.85）mg/L，陽性藥物維生素C清除DPPH自由基的IC50為（0.73±0.02）mg/L，兩者之間的差異非常顯著（P< 0.01）。

3.2 連艾煎清除ABTS自由基試驗 在一定的濃度范圍內(nèi)，連艾煎對ABTS自由基具有一定的清除能力，隨著濃度的增加，對ABTS自由基的清除率也逐步增加。連艾煎清除ABTS自由基的IC50為（240.96±4.66）mg/L，陽性藥物維生素C清除ABTS自由基的IC50為（1.14±0.04）mg/L，兩者之間的差異非常顯著（P<0.01），結(jié)果見表2。

3.3 連艾煎對RAW264.7細胞ROS水平的影響試驗 如圖1所示，空白組的細胞沒有檢測出ROS熒光，LPS組和ROS陽性組都檢測出明顯的ROS亮斑，而ROS抑制劑NAC則抑制了LPS引起的ROS升高。從圖1.e可以看出，連艾煎沒有抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞的ROS產(chǎn)生，反而增加了其生成，在LPS+連艾煎（1.5g/L）的ROS熒光比之前4組都要高。從圖1.f可以看出，單用連艾煎刺激RAW264.7細胞也產(chǎn)生了類似的結(jié)果。使用ImageJ軟件對ROS熒光進行灰度分析（圖2），可知Rosup組和LPS組的ROS熒光都比空白組高，且差異非常顯著（P< 0.01），LPS+連艾煎組ROS熒光比LPS組高，且差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01），而連艾煎自身對照組ROS熒光則比空白組和LPS組都要高，且差異顯著（P< 0.05），說明連艾煎自身可以引起細胞ROS升高。

4 討論

4.1 連艾煎方 出《松峰說疫》卷二，其處方包括黃連及艾葉，具有調(diào)中下氣，清腸開噤之功效，主治噤口痢，下痢赤白，腹中疼痛，里急后重，得食則吐者[1，17]。推測其解腸胃熱毒功能可能與其

抗氧化能力有關(guān)，故對其抗氧化能力作初步測試[18]。連艾煎體外抗氧化實驗研究表明，連艾煎對DPPH及ABTS自由基具有一定的清除作用，雖然清除活性不如維生素C，但在一定范圍內(nèi)其抗氧化作用與濃度也能呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。為了進一步探究連艾煎的抗氧化能力，我們使用了RAW264.7細胞模型檢測連艾煎對細胞ROS的影響。在細胞ROS實驗中，可以明顯看出ROS陽性對照（Rosup）、LPS都對細胞ROS熒光有顯著升高作用（P< 0.01），同時，ROS抑制劑NAC顯著抑制了LPS引起的ROS升高（P< 0.01），說明細胞ROS模型成功建立。LPS+連艾煎組顯示出比LPS組更強的熒光（P< 0.01），說明連艾煎并不會抑制LPS引起的ROS升高，而相比空白組，連艾煎自身對照組顯著地增強了細胞ROS熒光（P< 0.01），說明連艾煎自身會對細胞ROS產(chǎn)生有促進作用。與普通的抗氧化劑不同的是連艾煎在理化實驗中顯示出較強抗氧化活性，而在細胞實驗中則可以升高ROS水平，這個現(xiàn)象是值得深入研究的。

研究表明ROS與很多病理過程具有密切聯(lián)系，尤其是腫瘤[19-20]。Gorrini等發(fā)現(xiàn)胰島素升高細胞內(nèi)ROS水平，后者進一步促進腫瘤細胞增殖[21]。Helfinger等研究顯示，高濃度的ROS可導(dǎo)致DNA損傷和突變，引起細胞惡性轉(zhuǎn)化[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，ROS介導(dǎo)的PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過度激活利于腫瘤細胞存活以及促進化療耐藥[23-24]。因此，傳統(tǒng)觀點認(rèn)為體內(nèi)ROS升高可促進腫瘤形成、侵襲和轉(zhuǎn)移，并基于此尋找具有強抗氧化活性的天然產(chǎn)物作為開發(fā)抗腫瘤藥物的新方向[25]。

然而，ROS在癌癥中的作用仍存在爭議，最新的觀點認(rèn)為機體低水平的ROS能夠增加癌癥風(fēng)險，升高ROS反而利于癌癥治療。哥德堡大學(xué)的一項研究指出抗氧化劑NAC和維生素E分別使肺癌小鼠的最大存活率降低了60%和50%[26-29]。此外，Lee等發(fā)現(xiàn)放射治療使機體產(chǎn)生ROS能引起DNA損傷，從而破壞癌細胞[30]。Zhen和Hu等研究顯示，在膠質(zhì)母細胞瘤中，ROS水平升高會導(dǎo)致乳腺癌細胞對電離輻射的抗性降低，從而增強癌細胞對放射治療的敏感性[31-32]。普通抗氧化劑有效地減少ROS的生成，從而使癌細胞的生長不受干擾，詹姆斯沃森（James Dewey Watson）甚至認(rèn)為，抗氧化劑不但無助于預(yù)防癌癥，還可能引發(fā)癌癥[33-34]。

綜上所述，關(guān)于ROS在癌癥中的作用的研究日益增多，但學(xué)術(shù)界對ROS是致癌還是抗癌目前尚未有統(tǒng)一的觀點，ROS作為腫瘤促進劑或抑制劑的作用都有大量證據(jù)支持，這種悖論被解釋為適應(yīng)性穩(wěn)態(tài)，細胞內(nèi)存在一種平衡，可能引起細胞損傷的活性物質(zhì)也能激活保護細胞的生物途徑，這種平衡取決于活性物質(zhì)的濃度[35-36]。

氧化應(yīng)激促進癌癥發(fā)展和殺傷癌細胞的作用為兩種相反的癌癥治療策略提供了不同的理論基礎(chǔ)。一種方法是使用抗氧化劑提高ROS清除能力，從而消除ROS信號并抑制腫瘤生長，另一種相反的方法是用具有促氧化劑殺傷癌細胞，促氧化劑可增加ROS生成或消除癌細胞抗氧化系統(tǒng)[37]。連艾煎的抗氧化活性實驗顯示出連艾煎具有較強的抗氧化活性，同時可以升高細胞ROS水平。通過對連艾煎抗氧化活性的研究，在一定程度上預(yù)示連艾煎可能因為升高ROS帶來健康風(fēng)險，也可能成為一種避免細胞ROS減少而導(dǎo)致癌癥風(fēng)險增加，甚至可以通過引起ROS升高而增加癌細胞對放射治療敏感度的抗氧化劑。連艾煎對腫瘤到底起到何種作用值得進一步研究。

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（收稿日期：2019-01-10 編輯：劉斌）