蛇床子酸緩沖溫敏型凝膠的制備與體外評(píng)價(jià)*

李金玲，王亞靜，石惠姝，王亞楠，商利娜，趙海寧，張 怡，周夢(mèng)楠

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程研究中心，天津 301617）

老年性陰道炎是一種由于絕經(jīng)后卵巢功能衰退、雌激素水平降低引發(fā)的婦女常見(jiàn)且多發(fā)的疾病，在絕經(jīng)婦女中的發(fā)生率為26.1%～30.0%[1]，患者患處發(fā)炎、瘙癢、疼痛，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。健康女性陰道呈適度弱酸性，而老年絕經(jīng)婦女由于體內(nèi)雌激素水平降低陰道上皮細(xì)胞內(nèi)糖元減少，陰道內(nèi)pH值增高，使酸性乳酸桿菌不再成為優(yōu)勢(shì)菌，局部抵抗力降低，為致病菌提供了有利的生存環(huán)境[2-4]，菌群平衡失調(diào)最終導(dǎo)致致病菌感染，因此恢復(fù)和維持陰道酸性微環(huán)境，對(duì)重建陰道正常的微生物平衡起到重要作用。

中藥蛇床子具有殺蟲(chóng)止癢、消炎鎮(zhèn)痛等藥理作用[5]，可減緩老年性陰道炎患者癥狀，現(xiàn)代藥理研究表明蛇床子中蛇床子素等主要成分還具有雌激素樣作用[6]，顯示出在老年性陰道炎防治中良好的應(yīng)用前景。由于陰道的特殊生理結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)，不僅給藥不便且藥物往往難以抵達(dá)陰道深部、易于漏出、局部作用時(shí)間較短。溫敏凝膠作為一種環(huán)境敏感型智能凝膠，在貯存溫度下呈液態(tài)，注入體內(nèi)響應(yīng)給藥部位體溫變化發(fā)生相變，轉(zhuǎn)化成非化學(xué)交聯(lián)的半固體凝膠，不僅克服傳統(tǒng)陰道制劑鋪展性差、覆蓋率低的缺點(diǎn)，還具有延長(zhǎng)藥物局部滯留時(shí)間、增加生物利用度[7]、減少給藥次數(shù)的應(yīng)用潛力。本文以蛇床子提取物為模型藥物，制備具有酸緩沖功能的溫敏型中藥凝膠，并對(duì)其從膠凝溫度、膠凝時(shí)間、鋪展性、黏度、體外釋放等方面進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，為老年性陰道炎外用制劑的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與儀器

蛇床子提取濃縮液（自制，70%乙醇提取，濃縮至2 g生藥/mL）；泊洛沙姆 188（WPAK539B巴斯夫），泊洛沙姆 407（WPAK596B巴斯夫），甘油（1024C0314北京索萊寶），尼泊金乙酯（20180507安徽山河藥用輔料股份有限公司），PEG400（20180301北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司），乳酸（H41022972北京索萊寶），乳酸鈉（20180428北京索萊寶），純化水（milip設(shè)備制備），甲醇（天津市康科德科技有限公司，色譜純），乙腈（天津市康科德科技有限公司，色譜純）；高效液相色譜儀（日本Shinadzu公司，SPD-20A紫外檢測(cè)器；LC-20T泵LCSolution色譜工作站），YP1001N電子天平（上海菁海儀器有限公司），PB-10 pH 測(cè)定儀（Sartorius），DK-98-II電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯儀器有限公司），全自動(dòng)智能溶出儀（德國(guó)ERWEKA公司），干式恒溫器（杭州奧盛有限公司），DV-III型黏度計(jì)（美國(guó)Brookfield公司）

2 方法與結(jié)果

2.1 凝膠的制備 采用冷溶法制備溫敏凝膠[8]。量取純化水，加入2 g蛇床子提取濃縮液，在磁力攪拌下依次加入2 g PEG400，0.04 g尼泊金乙酯及處方量的酸緩沖溶液和溫敏基質(zhì)，補(bǔ)加純化水至20 g，攪勻后于4℃冰箱中冷藏24 h，直至聚合物完全溶脹后即得。

2.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)

2.2.1 膠凝溫度 將液體溫敏凝膠置于0℃環(huán)境中，保證待測(cè)樣品擁有相同初始條件，取液體狀態(tài)的待測(cè)樣品，置于25℃干式恒溫器上預(yù)熱5 min后，以0.5℃/min的速率升溫至40℃，每升高0.5℃，觀察液體流動(dòng)情況，容器倒轉(zhuǎn)凝膠不流動(dòng)時(shí)的溫度即為膠凝溫度，平行測(cè)定3次，取均值。

2.2.2 鋪展性 參照文獻(xiàn)[9]分別測(cè)量膠凝前后的凝膠直徑，平行測(cè)定3次，取均值。

2.2.3 膠凝時(shí)間 將表面皿水浴加熱至37℃。取0.5 mL溫敏凝膠溶液于表面皿上方3 cm處進(jìn)行推注，記錄溶液停止流動(dòng)的時(shí)間，平行測(cè)定3次，取均值。

2.2.4 pH值及緩沖能力 采用pH計(jì)平行測(cè)定3次，取均值。以3 mL，1.4%NaHCO3溶液（pH為7.5）模擬老年性陰道炎患者陰道pH狀況[10]，緩沖能力以加入陰道模擬液后的pH值改變量來(lái)表示。

2.2.5 黏度測(cè)定 參照《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》）2015年版四部旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測(cè)定法[5]采用DV-III型黏度計(jì)，64號(hào)轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速45 r/min，測(cè)量溫度為37℃，平行測(cè)定3次，取均值。

2.2.6 體外藥物釋放 色譜條件：色譜柱為ZORAX Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水（65∶35），體積流量 1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)322 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。參照《中國(guó)藥典》2015年版四部第二法槳法[5]測(cè)定溶出度。精密稱(chēng)取蛇床子溫敏型凝膠1.0 g于透析袋中，以200 mL乳酸-乳酸鈉緩沖系統(tǒng)（pH=4）作為溶出介質(zhì)，在（37±0.5）℃，轉(zhuǎn)速100 r/min條件下進(jìn)行試驗(yàn)，分別在0.5、4、12、30、36 h 取樣，用 0.22 μm 的微孔濾膜過(guò)濾，同時(shí)補(bǔ)充同溫新鮮介質(zhì)，樣品按以上色譜條件測(cè)定峰面積，并計(jì)算累積釋放百分率。

2.3 酸緩沖體系的考察

2.3.1 緩沖能力的考察 稱(chēng)取乳酸9.0 g，乳酸鈉18.8 g，加水至100 g，制得pH值為4的乳酸-乳酸鈉緩沖溶液，分別取 0.1、0.3、0.6、0.9、1.0、1.2、1.3、1.4 g，加水至20.0 g，分別加入3 mL陰道模擬液，按2.2.4項(xiàng)下方法測(cè)定其緩沖能力，結(jié)果見(jiàn)表1。由表可知，緩沖溶液用量在1.0～1.4 g時(shí)，其緩沖能力均能滿(mǎn)足維持pH值小于4.5。

表1 酸緩沖體系對(duì)緩沖能力的影響

2.3.2 對(duì)膠凝溫度的影響 分別取pH值為4的乳酸-乳酸鈉緩沖溶液 1.0、1.1、1.2、1.3、1.4 g，按 2.1 項(xiàng)下方法制備泊洛沙姆407質(zhì)量濃度為17%，泊洛沙姆188質(zhì)量濃度為6%的溫敏凝膠，按2.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定膠凝溫度，結(jié)果見(jiàn)圖1。由表可知，乳酸-乳酸鈉緩沖溶液的加入對(duì)溫敏凝膠的膠凝溫度有明顯的影響，且隨著乳酸-乳酸鈉緩沖溶液用量的增加，膠凝溫度呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。

圖1 酸緩沖體系對(duì)膠凝溫度的影響

2.4 處方優(yōu)化

2.4.1 D-最優(yōu)混料實(shí)驗(yàn) 以膠凝溫度為指標(biāo)，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行最優(yōu)混料設(shè)計(jì)，前期實(shí)驗(yàn)已確定處方載藥量為5%，保濕劑PEG400為10%，防腐劑尼泊金乙酯為0.2%。因此，泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、緩沖溶液用量及純化水用量共占處方實(shí)際比例84.8%，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定其混料優(yōu)選范圍為：泊洛沙姆 407（A）：14.0%～17.0%、泊洛沙姆 188（B）：0%～16.0%、酸緩沖體系（C）：5.0%～7.0%和純化水（D）：44.8%～65.8%。按2.1項(xiàng)下方法制備溫敏凝膠，按2.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定膠凝溫度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 混料設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.4.2 模型擬合分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件，對(duì)各自變量和因變量的關(guān)系進(jìn)行模型擬合，以擬合方程的擬合優(yōu)度（R2）和置信度（P）作為模型判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見(jiàn)表3，表中3次多項(xiàng)式擬合模型R2值最大，P值較低，模型擬合方程為Y=-4173.17X1+244.50X2+36.49X3+39.00X4+30 357.69X1X2+3 048.17X1X3+4 081.19X1X4-91.31X2X3-310.24X2X4-51.15X3X4-22 490.52X1X2X3-21 690.38X1X2X4+2574.64X1X3X4-119.40X2X3X4+59380.21X1X2（X1-X2）。根據(jù)最佳模型擬合方程，確定最優(yōu)處方為5.0%蛇床子提取物、0.2%尼泊金乙酯、10.0%PEG400、16.4%泊洛沙姆407、5.2%泊洛沙姆188、5.6%酸緩沖體系、57.6%純化水。

表3 指標(biāo)的回歸分析

2.5 體外評(píng)價(jià)

2.5.1 凝膠特性評(píng)價(jià) 以最優(yōu)處方制備3批樣品，按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 蛇床子酸緩沖溫敏凝膠的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.5.2 體外藥物釋放結(jié)果 按2.2.6項(xiàng)下方法測(cè)定溫敏凝膠在不同時(shí)間的累計(jì)釋放百分率，分別以零級(jí)方程，一級(jí)方程及Higuchi方程3種釋藥模型對(duì)蛇床子酸緩沖溫敏凝膠進(jìn)行擬合，得到符合該曲線(xiàn)的方程，并用相關(guān)系數(shù)r判斷其擬合程度，以r最大為優(yōu)，結(jié)果見(jiàn)表5。由表可知，蛇床子酸緩沖溫敏凝膠的體外釋放符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，表明蛇床子酸緩沖溫敏凝膠具有良好的緩釋效果。

表5 蛇床子陰道酸緩沖溫敏凝膠體外釋放模型擬合結(jié)果

3 討論

健康女性陰道內(nèi)乳酸桿菌可將陰道內(nèi)剝落的上皮細(xì)胞中的糖元轉(zhuǎn)化為乳酸，使陰道pH值維持在3.5～4.5的正常范圍內(nèi)，而老年性陰道炎患者由于病變陰道內(nèi)pH值上升至7.5[11]，從而造成陰道微環(huán)境的改變，使得陰道優(yōu)勢(shì)菌種乳酸桿菌逐漸減少，陰道菌群失調(diào)，局部抵抗力下降，為廣泛分布的體內(nèi)外條件致病菌提供了入侵和大量繁殖的環(huán)境。本文以緩沖能力及膠凝溫度為指標(biāo)對(duì)中藥蛇床子溫敏凝膠乳酸-乳酸鈉緩沖體系進(jìn)行考察，確定了既滿(mǎn)足維持pH值小于4.5，又保持凝膠膠凝溫度在35℃的緩沖體系用量，該酸緩沖體系的建立有助于恢復(fù)和維持患者陰道酸性微環(huán)境，為陰道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群提供良好的生存環(huán)境，進(jìn)而重建陰道正常的微生物平衡，增加陰道抗病防御能力，對(duì)老年性陰道炎的防治具有積極作用。

本文以膠凝溫度作為考察指標(biāo)，采用D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)對(duì)處方優(yōu)化并確定中藥蛇床子酸緩沖溫敏凝膠處方。所制得的凝膠在室溫下（25℃）呈液體狀態(tài)，黏度為（113.7±5.7）mPa/s，鋪展性良好，可保證藥物注入體內(nèi)時(shí)與陰道褶皺充分接觸。在陰道溫度下轉(zhuǎn)化為膠凝狀態(tài)，膠凝時(shí)間為（2.4±0.4）s，黏度為（444.3±29.3）×104mPa/s，膠凝迅速、黏度增大可有效延長(zhǎng)藥物局部滯留時(shí)間，提高藥物療效，此外體外藥物釋放符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，表明該凝膠具有良好的緩釋作用，符合老年性陰道炎局部用藥的生理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及用藥需求，為老年性陰道炎外用制劑的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)提供參考。