獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC特征圖譜的研究和分析

閆曉鑫 ，張志強(qiáng) ，杜守穎

（1.北京康仁堂藥業(yè)有限公司，北京 101300；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

獨(dú)活為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸（Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan）的干燥根，屬祛風(fēng)除濕類中草藥[1]。具有祛風(fēng)除濕，通痹止痛之功效?？捎糜陲L(fēng)寒濕痹，腰膝疼痛，少陰伏風(fēng)頭痛，風(fēng)寒挾濕頭痛[2-3]。其主要化學(xué)成分為蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯等為主的香豆素類及揮發(fā)油類成分。但是中藥為多類成分的共存體，內(nèi)部種類眾多，變化復(fù)雜，單一的成分用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)已經(jīng)無法滿足實(shí)際需要[4]。

中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎液[5-6]。該理論被提出之后，便成為了中藥現(xiàn)代工藝轉(zhuǎn)化的標(biāo)尺，也為不同來源、形式的中藥，提供了參照物，以保證所得產(chǎn)品的質(zhì)量。

本研究從獨(dú)活的道地及主產(chǎn)區(qū)收集了18批獨(dú)活，用于建立其標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征圖譜，使用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）對(duì)特征圖譜中不同成分進(jìn)行分析指認(rèn)，使用SPSS軟件對(duì)特征圖譜進(jìn)行主成分分析（PCA）和聚類分析（HCA）評(píng)價(jià)，并對(duì)煎煮過程的轉(zhuǎn)移概率進(jìn)行量化，研究煎煮過程的內(nèi)在成分變化，闡釋煎煮對(duì)于獨(dú)活內(nèi)在成分的影響規(guī)律，以建立獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑超高效液相色譜（UPLC）特征圖譜，為完善獨(dú)活配方顆粒的特征圖譜質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 島津LC-30AD超高效液相色譜儀，LC-30AD四元泵，SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD-20A紫外檢測(cè)器，CTO-20A柱溫箱（日本島津株式會(huì)社），Labsolution DB工作站；Waters ACQUITY UPLC?HClass超高效液相色譜儀；PDA Detector檢測(cè)器；TUV Detector檢測(cè)器；Empower 3色譜工作站；島津LC-20A高效液相色譜儀，LC-20A四元泵，SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD-20A紫外檢測(cè)器，CTO-10A柱溫箱（日本島津株式會(huì)社）；JY20002電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；BSA124S電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；ME104E電子天平[梅特勒·托利多儀器（上海）有限公司]；XP-26電子天平[梅特勒·托利多儀器（上海）有限公司]；ET18電位滴定儀[梅特勒·托利多儀器（上海）有限公司]；KQ-500DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥與試劑 蛇床子素對(duì)照品（批號(hào)：110822-201609，純度99.6%），二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品（批號(hào)：111583-201304，純度98.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（Fisher Chemical）、乙腈（默克）、甲酸（Fisher Scientific）為色譜純；水為蒸餾水；甲醇為分析純。

1.3 藥材

1.3.1 獨(dú)活藥材 獨(dú)活藥材共18批，見表1。

1.3.2 獨(dú)活飲片 按照《中華人民共和國藥典》2015年版獨(dú)活項(xiàng)下方法“除去雜質(zhì)，洗凈，潤透，切薄片，低溫干燥”制備，見表1。

表1 獨(dú)活藥材信息表

2 方法

2.1 獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備 以衛(wèi)生部、國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》和國家藥典委員會(huì)發(fā)布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》為依據(jù)[7]，考察獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑工藝條件，以制備“獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑”。

取獨(dú)活飲片100 g，置于砂鍋中，一煎加入飲片量9倍水，浸泡30 min，武火煮沸后，文火煎煮30min，趁熱過濾，迅速冷卻，備用；二煎加飲片量7倍水，武火煮沸后，文火煎煮20 min，趁熱150目紗布過濾，迅速冷卻備用；合并濾液，減壓濃縮（≤50℃），濃縮至料液比約為1∶1，冷凍干燥，即得。

2.2 獨(dú)活配方顆粒特征圖譜的建立

2.2.1 參照物溶液的制備 分別取蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含蛇床子素20 μg、含二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯2 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Extend C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；以甲醇為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，按表2中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長為330 nm，柱溫35℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量：5 μL。理論塔板數(shù)按二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯峰計(jì)算應(yīng)不低于10 000[8-10]。

表2 梯度洗脫表

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 精密度考察 取獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（批號(hào)：180209-445800-18）按2.2.3項(xiàng)下方法測(cè)定，連續(xù)檢測(cè)6次，獲得其特征圖譜，以8號(hào)峰（蛇床子素）為參照峰，計(jì)算其相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，并計(jì)算RSD。各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD在0%～0.9%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積的RSD在0%～3.8%范圍內(nèi)，表明該特征圖譜的精密度較好。

2.2.4.2 重復(fù)性考察 取獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（批號(hào)：180209-445800-18）6份，按2.2.3項(xiàng)下方法測(cè)定，獲得其特征圖譜，以8號(hào)峰（蛇床子素）為參照峰，計(jì)算其相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。并計(jì)算RSD。各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD在0%～0.1%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積的RSD在0.1%～0.3%范圍內(nèi)，表明該特征圖譜的重復(fù)性較好。

2.2.4.3 中間精密度考察 采用Waters UPLC H-Class，TUV檢測(cè)器，取獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（批號(hào)：180209-445800-18）6份，按2.2.3方法測(cè)定，獲得其特征圖譜，以8號(hào)峰（蛇床子素）為參照峰，計(jì)算其相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。并計(jì)算RSD。

采用Waters UPLC H-Class，TUV檢測(cè)器獲得的特征圖譜中，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD在0%～0.1%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積的RSD在0%～0.4%范圍內(nèi)。不同儀器間相對(duì)保留時(shí)間RSD范圍是0.1%～5.2%，相對(duì)峰面積RSD%范圍是0.3%～5.1%，表明該特征圖譜的中間精密度符合分析要求。

2.2.4.4 穩(wěn)定性考察 取獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（180209-445800-18），按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12、24 h 按正文方法進(jìn)行測(cè)定，獲得其特征圖譜，以8號(hào)峰（蛇床子素）為參照峰，計(jì)算其相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。并計(jì)算RSD。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，溶液中化學(xué)成分在24 h穩(wěn)定性，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD在0%～0.1%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積的RSD在0.1%～0.9%范圍內(nèi)。

2.2.5 質(zhì)譜成分指認(rèn) 質(zhì)譜條件：Agilent Jet Stream ESI源，干燥氣流速：11 L/min，干燥氣溫度：350℃，鞘氣溫度：400，鞘氣流速：11 L/min，霧化器壓力：35 psi，F(xiàn)ragmentor電壓：130 V。正模式采集，噴嘴電壓：500 V，毛細(xì)管電壓：4 000 V；負(fù)模式采集，噴嘴電壓：1 000 V，毛細(xì)管電壓：3 500 V。

3 結(jié)果

3.1 樣品檢測(cè) 取18批次獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再照2.2.3項(xiàng)下方法檢測(cè)，結(jié)果見表 3，圖 1、2。

表3 獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉樣品列表

3.2 質(zhì)譜成分指認(rèn) 通過對(duì)特征圖譜的紫外光譜信息及所采集的一級(jí)質(zhì)譜圖信息的研究，同時(shí)參考文獻(xiàn)[11]對(duì)獨(dú)活中的主要化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測(cè)，結(jié)果見表4。

3.3 成分量化分析

3.3.1 主成分分析及聚類分析 采用2.2.3項(xiàng)下方法對(duì)18批獨(dú)活飲片和18批獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)軟件積分處理，得到相應(yīng)特征圖譜9個(gè)特征峰的峰面積。

圖1 18批獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉液相圖譜

圖2 獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉對(duì)照?qǐng)D譜及共有峰標(biāo)識(shí)

表4 特征峰質(zhì)譜指認(rèn)

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)18批獨(dú)活飲片和18批獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉特征圖譜進(jìn)行PCA，求出相關(guān)矩陣方差，見表5。以特征值＞1未提取標(biāo)準(zhǔn)，得到前兩個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為90.520%（大于80%），故選擇前兩個(gè)主成分即可進(jìn)行評(píng)價(jià)，它代表了獨(dú)活中9個(gè)成分量的90.520%的信息量，具有很好的代表性，足以評(píng)價(jià)獨(dú)活飲片及獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量，進(jìn)而用于獨(dú)活配方顆粒特征圖譜的分析[12-14]。

從表6中可以看出，第1個(gè)主成分的信息主要來自色譜峰 3、4、5、6、7、8，第 2 個(gè)主成分的信息主要來自色譜峰 1、2、9。

將PCA所得的兩個(gè)主成分對(duì)18批獨(dú)活飲片和18批獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉特征圖譜進(jìn)行打分，所得第1個(gè)和第2個(gè)主成分進(jìn)行聚類分析，以組間連接和歐氏距離作為樣品測(cè)度，采用Q型聚類進(jìn)行HCA。

結(jié)果顯示，獨(dú)活飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉均可根據(jù)產(chǎn)地差異分為兩大類，四川省和湖北恩施樣品聚為一類，湖北宜昌聚為一類，煎煮以后的標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉單獨(dú)聚為一類，并與飲片相區(qū)分，樣品間的距離低于飲片之間的距離。

表5 解釋的總方差

表6 成份矩陣a

3.3.2 飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑化學(xué)成分轉(zhuǎn)移概率的量化 取上述實(shí)驗(yàn)所得18批獨(dú)活飲片（稱樣量使用收率折算）和18批獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉特征圖譜，得到9個(gè)特征峰峰面積，計(jì)算特征峰在煎煮過程中的轉(zhuǎn)移值，計(jì)算方式為標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉的峰面積/飲片的峰面積。

若轉(zhuǎn)移值＞1，該成分在煎煮過程中以積累為主；若轉(zhuǎn)移值小于1，該成分不易被水提取或分解為主。在整個(gè)煎煮過程中峰3、4、5、6以積累為主，峰1、7、8、9分解或不易轉(zhuǎn)移，峰2在不同批次中出現(xiàn)了不同的變化趨勢(shì)。

批次 1～6（四川）和 13～18（湖北恩施）的各峰轉(zhuǎn)移情況相近，但是批次7～12（湖北宜昌）各峰轉(zhuǎn)移與前兩者有較大差異，主要體現(xiàn)在峰 2、4、8、9，見表 7、圖4。

圖3 聚類分析結(jié)果

4 討論

中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)提取濃縮制成的、供中醫(yī)臨床配方用的顆粒。但因中藥配方顆粒受到原料、炮制加工、生產(chǎn)等多方面環(huán)節(jié)的限制，中藥配方顆粒目前沒有統(tǒng)一的國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。獨(dú)活配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立也是迫在眉睫。根據(jù)國家藥典委員會(huì)發(fā)布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》的要求，為了有效表征獨(dú)活配方顆粒整體質(zhì)量，需使用標(biāo)準(zhǔn)湯劑，本研究建立了對(duì)照特征圖譜質(zhì)量控制方法，可用于獨(dú)活配方顆粒的產(chǎn)地來源鑒別及全面的質(zhì)量控制。

圖4 獨(dú)活飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉特征圖譜對(duì)比

表7 獨(dú)活煎煮過程特征峰轉(zhuǎn)移值

本實(shí)驗(yàn)建立了獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑的UPLC特征圖譜對(duì)照?qǐng)D譜，可以全面反映樣品的內(nèi)在質(zhì)量，評(píng)價(jià)獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑的內(nèi)在質(zhì)量。本方法在色譜柱型號(hào)、流速、柱溫等方面還進(jìn)行了相關(guān)耐用性考察，結(jié)果表明，本方法可適用于不同型號(hào)色譜柱，在柱溫28～35℃、流速為0.28～0.32 mL/min之間耐用性良好。

結(jié)合PCA和HCA分析方法對(duì)獨(dú)活的煎煮過程進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地差異是導(dǎo)致獨(dú)活原料和獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑差異的主要因素，煎煮可縮小這種差異。獨(dú)活煎煮過程，并非單純的成分溶出及轉(zhuǎn)移，還發(fā)生了相互轉(zhuǎn)化。批次1～6（四川）和13～18（湖北恩施）的各峰轉(zhuǎn)移情況相近，但是批次7～12（湖北宜昌）各峰轉(zhuǎn)移與前兩者有較大差異，主要體現(xiàn)在峰2、4、8、9。通過比較各特征峰的轉(zhuǎn)移值，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)煎煮過程中峰3、4、5、6以積累為主，以峰5的轉(zhuǎn)化生成最多；峰 1、7、8、9分解或不易轉(zhuǎn)移，峰 2在不同批次中出現(xiàn)了不同的變化趨勢(shì)。經(jīng)過質(zhì)譜指認(rèn)峰3、4、5、6可能為當(dāng)歸醇類化合物，可能是經(jīng)過水煮以后，發(fā)生了水解，導(dǎo)致含量升高。

研究過程中，采用多元的評(píng)價(jià)方法可更加全面對(duì)獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜進(jìn)行分析，所得結(jié)果更加全面、直觀，進(jìn)一步確定此方法可用于獨(dú)活標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)。